一种养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定方法与流程

本发明属于检测分析技术，具体涉及一种养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定方法。
背景技术：
：养血清脑颗粒和养血清脑丸为天士力集团开发的中成药，分别记载于《中国药典》2015年版一部的1281-1282页、1280-1281页。养血清脑颗粒和养血清脑丸在制备过程中，需要对熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛等中药材进行提取，制备成药物提取物浸膏，进而以该浸膏为药物的活性物质制备成养血清脑颗粒和养血清脑丸，所述药物提取物浸膏的制备方法为：熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛六位药材，加水煎煮二次，滤过，滤液浓缩至清膏，加乙醇适量，静置，回收乙醇，浓缩既得。熟地为玄参科植物地黄的块茎经加工炮制而成。通常以酒等为辅料经蒸晒制成，色黑油润，柔软粘腻。熟地的主要功效为滋阴、补血，益精填髓。用于阴虚血少、目昏耳鸣，腰膝酸软，盗汗遗精，内热消渴，眩晕，耳鸣，须发早白。《中国药典》2015年版一部125-126，熟地黄项下明确写明：以毛蕊花糖苷做为主要鉴别成分，其含量不少于0.020％，其检测方法为高效液相色谱法，其中：色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％醋酸溶液(16：84)为流动相；检测波长为334nm。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于5000。对照品溶液制备：取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每lml含10pg的溶液，即得。供试品溶液制备取本品最粗粉约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加人甲醇100ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，减压回收溶剂近干，残渣用流动相溶解，转移至10ml量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。熟地黄的化学成分主要是毛蕊花糖苷，该成分也是熟地的主要药效成分，通过测定方法得知，毛蕊花糖苷是熟地黄通过甲醇回流提取获得，是脂溶性成分。养血清脑颗粒和养血清脑丸制备过程中得到养血清脑水提浸膏，它是养血清脑颗粒和养血清脑丸的制剂中间体。养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷含量只有对照文献中供试品的约五分之一，且是混合提取物，采用《中国药典》2015年版一部中熟地黄的检测方法，各种成分相互干扰，分析时间长，效率较低，无法达到检测目的，为此需要更好的分离纯化方法对毛蕊花糖苷含量进行检测。目前，针对养血清脑水提浸膏的检测，都没有对其中的毛蕊花糖苷进行含量测定的。技术实现要素：为了提高质量控制能力，针对养血清脑水提浸膏，本发明建立了一种养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷测定方法，并进行了方法学验证，验证结果表明，本发明方法优于现有技术，符合含量测定要求。作为养血清脑颗粒和养血清脑丸的一种制剂中间体，为熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛等中药材的浸膏提取物，本发明称为养血清脑水提浸膏。本发明提供一种养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定方法，所述方法包括以下步骤：1)对照品制备方法：称取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇配制成标准对照溶液；2)供试品溶液的制备方法：称取养血清脑水提浸膏，加甲醇溶解，上固相萃取柱，用甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容；3)测定方法：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积使用外标法计算供试品溶液毛蕊花糖苷含量，经换算得到养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的含量；其中的色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱，流动相：以0.3-0.4％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，洗过方法：梯度洗脱，检测波长：300-350nm。其中，步骤1加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.002-0.006mg的溶液。其中，步骤2称取养血清脑水提浸膏0.20-0.30g，加15-35％甲醇10ml，溶解。步骤2上固相萃取柱，先用25％甲醇5ml洗涤，弃去，再用40％甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液，加40％甲醇至5ml。步骤2的固相萃取柱为proelutc18-u型或sep-pakvacc18型固相萃取柱；固相萃取柱规格为500mg/6ml。其中，步骤3，分别取对照品溶液和供试品溶液1-10ul，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图。优选的，本发明所述方法包括以下步骤：1)对照品制备方法：称取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.002-0.006mg的溶液，既得；2)供试品溶液的制备方法：精密称取养血清脑水提浸膏0.20-0.30g，加15-35％甲醇10ml，超声溶解，摇匀，上至固相萃取柱，用25％甲醇5ml洗涤，弃去，用40％甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液，加40％甲醇至5ml，摇匀，既得；3)测定方法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积使用外标法计算供试品溶液毛蕊花糖苷含量，经换算得到养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的含量；其中色谱条件如下：c18色谱柱为acquityuplchsst3c18色谱柱；梯度洗脱表如下：最优选的，本发明所述方法包括以下步骤：1)对照品制备方法：称取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.004mg的溶液，既得；2)供试品溶液的制备方法：精密称取养血清脑水提浸膏约0.25g，加25％甲醇约10ml，超声溶解，摇匀，上至固相萃取柱，用25％甲醇5ml洗涤，弃去，用40％甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液，加40％甲醇至5ml，摇匀，既得；3)测定方法：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积使用外标法计算供试品溶液毛蕊花糖苷含量，经换算得到养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的含量；色谱条件：c18色谱柱，以0.2％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱，检测波长：334nm，梯度洗脱如下：经方法学验证，本测定方法符合含量测定要求，可以用于养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的含量测定。本发明优选的实验方法、色谱条件和样品前处理方法，是经过筛选得到的。色谱条件采用超高效液相色谱法，流动相等度洗脱，方法简单，提高了分析效率。筛选过程如下：(一)样品前处理方法的筛选样品前处理方法采用了固相萃取技术，通过对固相萃取材料的筛选，能够精确高效的去除干扰成分，同时可以对毛蕊花糖苷进行有效富集，体现了本申请的创造性。1、固相萃取材料和规格筛选：养血清脑水提浸膏由六味中药提取制成，成分非常复杂。同时，熟地在处方中的占比不足10％，毛蕊花糖苷在药材中的含量很低，造成毛蕊花糖苷在养血清脑水提浸膏中的含量极低(约为0.01％)，为含量测定带来了极大地难度。为了去除杂质干扰，对毛蕊花糖苷进行有效富集以便使得检测更为准确，需要采用有效的分离纯化技术将毛蕊花糖苷分离出来。分别采用硅胶键合和高分子聚合物为吸附剂的固相萃取柱对养血清脑水提浸膏进行分离纯化，对不同规格型号的商品柱进行了比较，各种spe柱具体信息见表1：表1：不同规格型号的商品柱的比较1.1色谱条件采用acquityuplchsst3c18(2.1*100mm)色谱柱，采用uplc色谱系统。以0.5％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，按表2进行梯度洗脱；检测波长：287nm、254nm、320nm。表2：梯度洗脱表1.2样品处理：取养血清脑水提浸膏约0.2g，置烧杯中，加水10ml超声溶解，摇匀，分别上至固相萃取柱(500mg/6ml)。采用不同浓度的甲醇溶液10ml洗脱，分别收集洗脱液，分别进样，考查成分分离情况。1.3筛选结果根据色谱图对不同规格型号的spe柱分离情况进行了比较，结果(见图1)显示：proelutc18-u型和sep-pakvacc18型固相萃取柱能有效的纯化样品，将毛蕊花糖苷色谱峰与其它色谱峰分开，其它类型spe柱均未能分开。最后选择proelutc18-u型或sep-pakvacc18型spe柱为毛蕊花糖苷测定的前处理方法用柱。2、固相萃取参数优化分别针对毛蕊花糖苷测定方法，对固相萃取分离纯化参数进行了优化，分别考察了洗脱溶剂强度、分离纯化分割点、洗脱溶剂体积，确定了最佳分离纯化参数。2.1色谱条件采用acquityuplchsst3c18(2.1*100mm)色谱柱，采用uplc色谱系统。以0.5％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，按表2进行梯度洗脱；检测波长：287nm、254nm、320nm。2.2样品处理：取养血清脑水提浸膏约0.2g，置烧杯中，加水10ml超声溶解，摇匀，分别上至proelutc18-u固相萃取柱(500mg/6ml)。按照表3中的溶剂梯度洗脱条件洗脱，分别收集洗脱液，进样，考查成分分离情况。通过纯化效果比较，确定最佳spe分离纯化参数。表3：梯度洗脱条件试验编号溶剂梯度溶剂体积毛蕊花糖苷所在洗脱液的甲醇浓度10、20％、40％、60％、70％甲醇10ml40％20、10％、40％、70％甲醇10ml40％30、30％、40％、50％、60％甲醇10ml30％、40％40、30％、40％、60％甲醇5ml30％、40％50、25％、35％、70％甲醇10ml40％625％、40％、60％、100％甲醇10ml40％2.3筛选结果根据色谱图(见图2)，对不同溶剂梯度洗脱条件进行了比较，确定最佳spe分离纯化参数为25％甲醇上样(除去糖类、有机酸等干扰成分)，以40％甲醇10ml洗脱，取40％甲醇洗脱液测定毛蕊花糖苷，分离效果最佳。因此确定为毛蕊花糖苷测定的固相萃取前处理方法。(二)色谱条件优化分别针对毛蕊花糖苷测定方法，对色谱柱、流动相组成、梯度洗脱条件和检测波长进行了优化。1、样品前处理方法：精密称取养血清脑水提浸膏约0.25g，加25％甲醇约10ml，超声溶解，摇匀，上至proelutc18-u固相萃取柱(500mg/6ml)。用25％甲醇5ml洗涤，弃去。用40％甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液至5ml容量瓶中，加40％甲醇至刻度，摇匀，既得。2、色谱柱选择分别采用acquityuplchsst3c18(2.1*100mm)、acquityuplcbehc18(2.1*100mm)、acquityuplccshc18(2.1*100mm)色谱柱进行养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定，通过方法优化，结果(见图3)显示acquityuplchsst3c18(2.1*100mm)色谱柱的分离效果最佳。3、检测波长选择根据毛蕊花糖苷的全波长扫描图，最大检测波长为334nm。根据主要干扰成分的紫外吸收特性，分别在230nm、254nm、287nm、334nm进行了样品分离度考查，通过色谱图(见图4，波长选择色谱图)分析可知，在334nm波长下毛蕊花糖苷吸收度高，分离度最佳。因此，选择334nm为检测波长。4、流动相选择在水相为流动相a相，以乙腈为流动相b相，分别在a相中加入不同浓度有机酸来优化峰形。表4：流动相a的选择编号流动相a1无甲酸20.5％甲酸30.2％甲酸结果(见图5，流动相选择色谱图)显示，不加甲酸分离度较差，加入0.5％甲酸的峰形较差，加入0.2％甲酸的峰形较好，因此，最佳流动相a定位0.2％甲酸溶液。5、梯度洗脱条件优化为保证色谱峰分离度和提高分离效率，对梯度洗脱条件进行了优化，分别测试3种梯度洗脱条件见表5-1、5-2、5-3：表5-1：洗脱条件1表5-2：洗脱条件2表5-3：洗脱条件3色谱图(见图6，梯度洗脱条件选择色谱图)显示，洗涤条件3既能提高分离效率又能保证色谱峰分离度，因此确定为最终梯度洗脱方法。6、筛选结果通过对毛蕊花糖苷测定方法色谱条件的研究，最终确定了毛蕊花糖苷的色谱分析条件。使用uplc色谱系统，采用acquityuplchsst3色谱柱(2.1*100mm)，以0.2％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，按表6进行梯度洗脱；检测波长：334nm。表6：梯度洗脱表(三)方法学验证1、仪器和材料仪器：watersacquity超高效液相色谱仪，tuv紫外检测器，empower3化学工作站；ag104电子天平；milli-q超纯水处理系统色谱柱：watershsst3色谱柱对照品：毛蕊花糖苷(中国药品生物制品检定所)耗材：proelutc18-u固相萃取柱(500mg/6ml)(迪马科技有限公司)2、对照品溶液的制备：称取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.004mg的溶液，既得。3、线性和范围精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.02mg的混合对照溶液，再分别取量取0.5、1、2、4、5、10ml混合对照溶液置于50ml量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，制成系列溶液，注入液相色谱仪，测定，以浓度对测得的峰面积(见表7和图7)进行线性回归，求得回归方程(见表8)。表7：浓度及对应的峰面积浓度(mg/ml)0.0001260.0006320.0012630.0031580.01579峰面积1560439985262104198014线性关系判定标准：相关系数应≥0.999。表8：回归方程、相关系数及线性范围结论：本测定方法中毛蕊花糖苷在上述浓度范围内，峰面积和浓度呈良好的线性关系。4、进样精密度试验：取样品，依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录毛蕊花糖苷的峰面积(见表9)，计算相对标准偏差。表9：毛蕊花糖苷的峰面积序号123456rsd％峰面积2378523974239282418424090243070.8％判定标准：6次进样的峰面积rsd应≤2.0％。结论：进样精密度符合验证要求。5、重复性试验：取样品，依法制备供试品溶液6份，测定毛蕊花糖苷的含量(见表10)，计算相对标准偏差。表10：毛蕊花糖苷的峰面积序号123456平均rsd％含量mg/g0.07550.0740.07520.07310.07180.07440.07401.9％判定标准：6份样品含量测定结果的rsd应≤2.0％。结论：本测定方法的重复性符合验证要求。6、中间精密度试验两位检测人员，在不同时间平行制备2份供试品溶液，在两台不同仪器上分别进样测定，对2次测定结果(见表11)进行分析，计算测定的rad值。表11：中间精密度试验判定标准：两次测定结果的rad应≤2.0％。结论：两次测定结果的rad小于2.0％，本测定方法符合中间精密度要求。7、回收率试验：精密称取样品共6份，每份约0.4g，置50ml量瓶中，精密加入对照品溶液0.5ml(每毫升含毛蕊花糖苷为0.0071mg)，自“加稀乙醇溶液适量，超声溶解”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取2ul注入色谱仪，计算毛蕊花糖苷的回收率，结果见表12。表12：回收率试验结果判定标准：平均加样回收率应在95％～105％，rsd应≤3.0％。结论：毛蕊花糖苷的平均加样回收率99.0％，在95％～105％内，rsd均≤3.0％，方法符合验证要求。8、样品稳定性取b20171118批制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12h进样，记录毛蕊花糖苷的峰面积，计算相对标准偏差，结果见表13。表13：样品稳定性实验结果时间0h2h4h8h12hrsd％峰面积26231264092653426885262571.0％判定标准：样品溶液峰面积rsd≤2.0％时，溶液稳定。结论：样品溶液在12小时内的峰面积rsd≤2.0％，表明样品溶液在12小时内稳定性良好。9、色谱条件耐用性采用上述分别采用acquitybehc18(2.1*100mm)和acquitycshc18(2.1*100mm)色谱柱，采用上述测定方法进行色谱柱耐用性试验，对2次测定结果进行分析，计算测定的rsd值，结果见表14。表14：色谱条件耐用性实验结果判定标准：三种色谱柱测定结果的rsd应≤2.0％。结论：三种色谱柱测定结果的rsd小于2.0％，均可用于本方法的测定。10、方法专属性制备缺省熟地药材的养血清脑阴性水提浸膏，按照毛蕊花糖苷测定方法进行测定。考查色谱峰专属性。色谱图见图8：结论：阴性对照样品在毛蕊花糖苷对应位置无相应色谱峰，表明该色谱峰为毛蕊花糖苷。11、验证结论：验证结果表明，本测定方法线性关系、耐用性和回收率良好，精密度符合要求，样品在12小时内稳定性良好。该测定方法符合验证要求，可以用于养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定。本发明提供的方法具有以下优点：1、本专利采用超高效液相色谱法进行测定，通过方法优化，能够在10分钟内完成毛蕊花糖苷的测定。高效的分离能够提高检测效率，降低检测成本。2、与现有文献如《中国药典》2015年版一部125-126，熟地黄项下的方法(简称为药典方法)比较，结果如下：色谱条件与系统适用性试验药典方法为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％醋酸溶液(16：84)为流动相；检测波长为334nm。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算应不低于5000。本发明为流动相为乙腈和甲酸溶液，且采用梯度洗脱，改善了色谱峰峰形，有效提高了毛蕊花糖苷与其它成分色谱峰的分离度。供试品溶液制备，相较于药典方法，本发明增加了纯化步骤，药典方法的对象中毛蕊花糖苷含量均高于本检测样品数倍，不需要纯化，就可以直接检测出毛蕊花糖苷含量。本发明供试品养血清脑水提浸膏由熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛等药材制备而成，其中含有糖类、有机酸、生物碱、皂苷等大量干扰成分。必须对样品进行分离纯化，才能实现毛蕊花糖苷的准确测定。本测定方法的最大难度就在于样品的纯化过程，最大限度减少对毛蕊花糖苷测定的干扰。本发明通过大量实验研究，筛选出了最适合的固相萃取纯化材料，能有效地纯化和富集毛蕊花糖苷成分。再通过大量实验和数据分析，优化出了最佳的固相萃取洗脱参数，有效去除了毛蕊花糖苷测定的干扰成分。通过25％甲醇上样液去除糖类、有机酸等干扰成分，通过40％甲醇洗脱，收集含有毛蕊花糖苷的洗脱液，而将生物碱、皂苷等干扰成分保留在更新萃取柱上。最终实现了毛蕊花糖苷的最佳分离纯化效果。3、本申请采用反相硅胶固相萃取法作为前处理方法，相比于溶剂萃取法等其它前处理方法操作更便捷，萃取材料选择更丰富，参数调整更灵活。能有效的对养血清脑水提浸膏进行分离纯化，并可以对毛蕊花糖苷进行富集，最大限度的降低了其它成分对测定的干扰。同时本方法仅使用甲醇一种试剂，有效减少了有机试剂的使用。同时操作更简单，固相萃取柱为商品化产品，均一性更好。4、本发明采用超高效液相色谱法进行测定，通过方法优化，能够在7分钟内完成毛蕊花糖苷的测定。5、高效的分离能够提高检测效率，降低检测成本，体现了本发明的先进性。附图说明图1为固相萃取柱筛选色谱图，其中：1为采用proelutc18型；2为采用proelutc18-u型，3为采用cleanertsc-18型；4为采用cleanertsc-18-n；5为采用proelutpls；6为采用proelutnh2；7、为采用proelutpxa；8、为采用proelutpxc；型；9为采用sep-pakvacc18型；图2为固相萃取参数中不同溶剂梯度洗脱条件比较得到的色谱图，其中实验标号与表3的编号相同；图3为色谱条件优化中色谱柱选择得到的色谱图；图4为色谱条件优化中波长选择得到的色谱图；图5为色谱条件优化中流动相选择得到的色谱图；图6为色谱条件优化中梯度洗脱条件得选择到的色谱图；图7为浓度及对应的峰面积、回归方程；图8为方法专属性考察中的色谱峰专属性色谱图；图9为养血清脑水提浸膏色谱图；图10为毛蕊花糖苷标准品色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。养血清脑水提浸膏的方法，参照养血清脑颗粒和养血清脑丸在《中国药典》2015年版，1280-1282页公开的内容，即熟地黄、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛等六味中药是加水煎煮二次,第一次2小时，第二次1小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06.1.10(80℃)的清膏。实施例1：含量检测方法色谱条件：acquityuplchsst3c18(2.1*100mm)色谱柱，以0.2％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱，检测波长：334nm，梯度洗脱表家表7：表15：梯度洗脱表对照品溶液的制备：称取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷为0.004mg的溶液，既得。供试品溶液的制备：精密称取养血清脑水提浸膏约0.25g，加25％甲醇约10ml，超声溶解，摇匀，上至proelutc18-u型或sep-pakvacc18型固相萃取柱。用25％甲醇5ml洗涤，弃去。用40％甲醇溶液5ml洗脱，收集洗脱液至5ml容量瓶中，加40％甲醇至刻度，摇匀，既得。测量：分别取对照品溶液和供试品溶液各2ul，注入超高效液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积使用外标法计算供试品溶液毛蕊花糖苷含量，经换算得到养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的含量。选取8批养血清脑水提浸膏进行测定，结果见表16和图7(养血清脑水提浸膏色谱图)、图8(毛蕊花糖苷标准品色谱图)。表16：养血清脑水提浸膏多批次样品测定结果(mg/g)对照例1：采用文献(许永等，hplc法同时测定养血安神片中梓醇与毛蕊花糖苷的含量，安徽医药，2014年，18(10)：1859-1861)提供的方法作为对照例1。对照例1因为没有纯化步骤，检测养血清脑水提物中的毛蕊花糖苷时，检测不到结果。对照例2：《中国药典》2015年版一部125-126，熟地黄项下关于毛蕊花糖苷含量的高效液相色谱法检测。对照例2因为没有纯化步骤，检测养血清脑水提物中的毛蕊花糖苷时，检测不到结果。当前第1页12