一种胶体金免疫层析试纸及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种检测蓝舌病毒抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法与应用。

背景技术：

蓝舌病(bluetongue，bt)是由蓝舌病病毒(bluetonguevirus，btv)引起的一种重要虫媒传染病，主要侵害绵羊或牛及部分鹿种群，发病动物的舌、齿龈和颊粘膜会出现充血肿胀、形成瘀点，此后变为青紫色，并引起较高的发病率和致死率。btv最早于1876年被发现，目前在热带和温带的多个国家都已分离到btv，并且该病的分布范围在不断的扩大，已成为国际性广泛流行扩散的动物疫病，呈现全球性分布的趋势。据世界动物卫生组织(oie)统计，全球动物存在被蓝舌病病毒感染并确认的国家众多，包括与我国存在动物国际贸易的国家。我国于1979年第一次发现该病的存在，目前在我国29个省份已检测到感染btv阳性的病畜。目前，oie已将bt列为法定通报性疾病，我国也将其列为一类动物疫病，因此建立快速检测牛源蓝舌病诊断方法具有非常重要的公共卫生学意义。

胶体金免疫层析技术自被研制开发以来，就以其使用方便性、检测迅速性、特异性强等特点，成为快速检测传染病、药物残留、早孕等的首选。胶体金标记由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。

目前，在动物疾病诊断中，对于检测蓝舌病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条报道较少。我国每年进口十几万头种牛，在进境牛疫病的检疫中，如何快速准确地检测蓝舌病毒抗体，是口岸检测实际工作中急需解决的问题。

抗体检测是蓝舌病诊断的重要依据。采用抗体检测，可以诊断发病早期的病例(毒血症出现以前)。通过比较发病和健康动物血清抗体水平平均差异，结合临床症状、流行病学进行初步诊断，此外对同群动物进行不同时间的抗体监测，依据抗体变化的幅度可对疫病情况做出初步诊断。另外，免疫抗体检测结果，是最主要疫情预警信息之一，通过建立抗体监测数据库和纵横比较，为动物重大疫情预警、预报充分发挥作用。同时，抗体监测可对疫情风险及时做出科学的评估，为防控重大动物疫病提供科学数据。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种胶体金免疫层析试纸及其制备方法与应用。所述试纸适用于检测蓝舌病毒抗体，制备过程经过多种条件的优化，能在10min内完成样品检测，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、易携带、使用方便等优点。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种胶体金免疫层析试纸，包括胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白、检测线和质控线。

由于蓝舌病毒vp7是一种内衣壳结构蛋白，vp7基因的高度保守性决定了它是建立btv群特异性抗原抗体检测方法的最佳选择。因此本申请利用胶体金免疫层析技术检测牛血清中的蓝舌病毒抗体，研制一种快速灵敏的胶体金试纸条方法，为口岸一线进境牛的蓝舌病检测及监测工作提供快速筛查的技术储备。

优选地，所述牛蓝舌病毒vp7蛋白的序列为seqidno.2所示序列或在seqidno.2所示序列的末端(n端和/或c端)添加标签序列后的序列，以便于蛋白的分离纯化，优选的，所述标签为his标签、gst标签。

进一步地，所述胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白中，胶体金的粒径为10—50nm，优选20nm。

进一步地，所述胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白中，胶体金的ph值为7.0—10.0，优选8.2。

进一步地，所述胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白中，牛蓝舌病毒vp7蛋白的标金量为6μg/ml—18μg/ml，优选10μg/ml。

进一步地，所述检测线包含免疫球蛋白；优选的，所述免疫球蛋白的浓度为0.5—2mg/ml，更优选1mg/ml；优选的，所述免疫球蛋白为免疫血清igg，更优选的，所述免疫球蛋白为兔抗牛igg、羊抗牛igg、和/或鼠抗牛igg。

进一步地，所述质控线包含抗牛蓝舌病毒vp7蛋白的抗体；优选的，所述抗体的浓度为0.5—2mg/ml，更优选1mg/ml；优选的，所述抗体为单抗和/或多抗。

进一步地，所述试纸包括：底板(不吸水，如pvc板)，所述底板上依次拼接：样品垫、胶体金结合垫、c/t线的承载体、和吸水垫，

所述胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白附着于所述胶体金结合垫上；

所述检测线和质控线设于所述c/t线的承载体上，

所述c/t线的承载体使用的材料为硝酸纤维素膜，优选为milliporehiflow-135；

所述胶体金结合垫使用的材料为玻璃纤维膜，优选为gls-17930。

本发明保护一种制备上述任一所述的胶体金免疫层析试纸的方法，所述方法包括将含有胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7蛋白的溶液喷涂于胶体金结合垫上的步骤。

本发明保护上述任一项所述的胶体金免疫层析试纸在检测蓝舌病毒抗体中的应用，优选的，所述蓝舌病毒为牛蓝舌病毒。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的检测蓝舌病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，在牛源蓝舌病标准阳性血清稀释至64倍时仍可检测；且与牛结核、牛蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病阳性血清均无交叉反应；与国外商品化试剂盒elisa检测试剂盒(idexx)的检测相比符合率为98％。所述试纸还具有较好的稳定性，37℃放置所述试纸28天后，灵敏度并没有明显下降；每次检测过程可在10min内完成，能够快速检测样品血清，适用于现场快速检测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为胶体金溶液的紫外-可见光谱图。其中，横坐标为波长；纵坐标为吸收率。

图2为试纸条的特异性检测。其中，1为牛源蓝舌病标准阴性血清(阴性对照)；2为牛结核病阳性血清；3为牛布鲁氏菌病阳性血清；4为牛病毒性腹泻阳性血清；5为牛巴氏杆菌病阳性血清；6为牛白血病阳性血清；7为牛源蓝舌病标准阳性血清(阳性对照)。

图3为试纸条的灵敏度检测。其中，1为牛源蓝舌病标准阴性血清(阴性对照)；2-8分别为1:128、1:64、1:32、1:16、1:8、1:4、1:2稀释的牛源蓝舌病标准阳性血清。

图4为试纸条的稳定性检测。其中，1-4分别为37℃保存1、2、3、或4周的牛源蓝舌病标准阴性血清(阴性对照)；5-8分别为37℃保存1、2、3、或4周的牛源蓝舌病标准阳性血清。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的氯金酸(haucl4·4h2o)、柠檬酸三钠、吸水纸(paper-2030)、nc膜(milliporehiflow-135)、白色底板和金标垫(gls-17930，即胶体金结合垫，材料为玻璃纤维膜)均购于北京吉森生物科技有限公司。

下述实施例中所用的兔抗牛igg购于艾博抗(上海)贸易有限公司。

下述实施例中所用的牛蓝舌病毒vp7蛋白由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所保存；抗牛蓝舌病毒vp7蛋白单克隆抗体由云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供；牛源蓝舌病标准阴性血清和阳性血清购于中国兽医药品监察所；牛结核病阳性血清、牛布鲁氏菌病阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清、、牛巴氏杆菌病阳性血清、牛白血病阳性血清和200份被检牛未知血清样品均由中国检验检疫科学研究院提供。

下述实施例中所用的三位喷点系统(xyz3050tm)和切纸机系统(cm4000tm)均由美国biodot公司生产；手持式紫外灯(bg-42-a)由中国检验检疫科学研究院提供。

下述实施例中的“％”如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1、蓝舌病毒抗体检测用胶体金免疫层析试纸的制备

影响胶体金免疫层析试纸质量的因素有很多，如胶体金颗粒大小、胶体金标记抗原量、包被抗体浓度、nc膜和玻璃纤维膜的类型、缓冲液的配制等。由于空间位阻等因素，不同的标记物需要胶体金的颗粒大小不同。胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。

在胶体金免疫层析快速检测中，nc膜作为包被抗体的固相支持物，其种类选择是很重要的，需要从层析速度、灵敏度及非特异性结合等几方面综合进行筛选，选择一种既可以很好负载标记物和待检测样品，又不被吸附的nc膜。不同的nc膜处理液对于金标蛋白的释放有直接关系，需要选择一种能将标记物很好地释放出来的处理液。

1、抗原牛蓝舌病毒vp7重组蛋白的制备

将seqidno.1所示牛蓝舌病毒vp7基因片段作为目的基因连入克隆载体的多克隆位点上，得到重组质粒；将该重组质粒转化到大肠杆菌，对所述目的基因进行原核诱导表达(seqidno.1所示基因编码的氨基酸序列如seqidno.2所示)，分离纯化后得到牛蓝舌病毒vp7重组蛋白，该重组蛋白的大小为67kd。

2、胶体金制备

采用柠檬酸盐还原法制备粒径为20nm的胶体金溶液。

具体操作方法如下：首先取200ml超纯水于500ml圆底锥形瓶中，加入2.0ml1％haucl4溶液，将其置于微波炉中进行中高火加热5min，待沸腾后将其取出；然后搅拌下加入4.8ml1％柠檬酸三钠溶液，继续置于微波炉中，中火加热4.5min；将锥形瓶取出，待金液冷却至室温，加超纯水定容至200ml，随后将其置于4℃备用；取出10ml烧好并且冷却的胶体金溶液，在波长400nm～700nm范围内进行扫描，扫描间距为1nm，最高吸收峰在519nm±2nm处为合格。将制备的胶体金溶液ph值调至8.2，4℃保存备用。

上述胶体金溶液的鉴定方法如下：

按照上述胶体金制备的方法操作，结果显示，胶体金溶液呈酒红色，用由紫外-可见光谱图可知：显示制备的胶体金尖峰位于520nm处，且峰型狭窄，说明制备的金颗粒粒径均一，分散性良好(如图1所示)。

3、胶体金标记抗原牛蓝舌病毒vp7重组蛋白

1)最佳抗原牛蓝舌病毒vp7重组蛋白标记量的确定

通过试管观察法确定抗原最佳标金量，确定最佳包被抗原浓度。具体操作方法如下：

取8支离心管，每管加入1ml步骤2制备得到的胶体金溶液(胶体金粒径20nm)，每管分别加入3、5、7、9、11、13、15、或17μlk2co3和相对应的6、8、10、12、14、16、或18ug的牛蓝舌病毒vp7重组蛋白，混匀搅拌20min，观察其颜色。当胶体金溶液不发生沉聚现象，颜色不变或变化不大，且呈酒红色，此时的抗原剂量即为最佳标记蛋白质量。

结果显示，胶体金标记最佳ph值为8.2(加入7μlk2co3时)；抗原的最佳标金量为10μg/ml(每毫升溶液含0.02g粒径为20nm的胶体金颗粒)。

2)胶体金标记的牛蓝舌病毒vp7重组蛋白制备

取30ml步骤2得到的胶体金溶液置于50ml三角瓶内，平衡至室温，开启搅拌器；滴加入0.2mk2co390μl使胶体金颗粒ph8.2；再加入300ug牛蓝舌病毒vp7重组蛋白标记抗原，搅拌20min；再加入10％bsa1.5ml，搅拌10min；再加入0.075ml20％peg2000，搅拌10min；然后4℃静止1小时将标记好抗原的胶体金颗粒，置入50ml离心管，10000rpm离心35min，然后垂直放置30分钟，弃上清，保留浓缩标记抗原的胶体金颗粒。用0.2mpbph7.4(0.2mnah2po4，0.2mna2hpo4等量混匀后加入0.5gbsa)定容至3ml，混均匀4℃保存备用。

4、最佳检测线(t线)和质控线(c线)浓度的确定

将兔抗牛igg和抗牛蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体使用pbs溶液均依次稀释成0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml共4个浓度；将nc膜贴到底板上，然后将稀释好的兔抗牛igg和抗牛蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体相对应用划膜仪喷涂在nc膜上，分别为t线(检测线)和c线(质控线)；37℃烘干。根据t线和c线的颜色深浅确定t线和c线的最佳浓度。检测线的兔抗牛igg和质控线的抗牛蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体最佳包被量分别为1mg/ml。

5、胶体金免疫层析试纸的组装

用喷膜仪将步骤3标记好抗原的胶体金溶液喷在玻璃纤维膜上，37℃恒温烘干。用划膜仪将1mg/ml兔抗牛igg和1mg/ml抗牛蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体固定在nc膜，分别作为检测线(t线)和质控线(c线)，两线间隔0.5cm，置于37℃真空恒温干燥箱中干燥2h以上。将样品垫(2cm长)、胶体金结合垫(5mm长)、nc膜和吸水垫(2cm长)依次沿长度方向贴于底板pvc板上，再切割成宽0.4cm/条，即检测蓝舌病毒抗体的胶体金免疫层析试纸。将制好的试纸装入铝箔袋中，加入干燥剂密封，4℃保存。

6、胶体金免疫层析试纸的检测方法和判定标准

将80μl的待检血清加入样品孔中，取步骤5中制好的试纸，将样品垫一端浸入样品孔中，10min内观察结果。若试纸条质控线和检测线处出现两条红色的条带，表明样品为阳性，含有牛蓝舌病毒抗体；若试纸条上只有质控线处出现条红色条带，表明样品为阴性，不含有牛蓝舌病毒抗体；若质控线处不出现红色条带则说明试纸条失效。

实施例2、蓝舌病毒抗体检测用胶体金免疫层析试纸的性能检测

1、试纸条特异性实验

用实施例1步骤5制备好的试纸条同时检测用pbs缓冲液50倍稀释的牛结核病阳性血清、牛布鲁氏菌病阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清、牛巴氏杆菌病阳性血清和牛白血病阳性血清，同时以牛源蓝舌病标准阴性血清作为阴性对照，以牛源蓝舌病标准阳性血清作为阳性对照，观察几种病的交叉性，判断所述试纸条的特异性。

结果如图2所示，表明蓝舌病与结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻病、牛巴氏杆菌病及牛白血病均无交叉反应，说明实施例1制备的试纸条具有很好的特异性。

2、试纸条灵敏性实验

用实施例1制备的试纸条同时检测用0.01mpbs缓冲液稀释为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128的牛源蓝舌病标准阳性血清，出现阳性信号的血清最高稀释度作为试纸条的敏感度。

结果如图3所示，表明实施例1制备的试纸条检测不同稀释倍数的牛源蓝舌病标准阳性血清，当稀释度为1:64时检测线仍可见，表明该检测试纸条灵敏性良好。

发明人经多种试纸条组装方法，试验条件相同的情况下，(1)兔抗牛igg作为检测线，单抗作为质控线(即实施例1制备的试纸条)；(2)兔抗牛igg作为检测线，多抗作为质控线；(3)抗原vp7蛋白作为检测线，多抗作为质控线；(4)抗原vp7蛋白作为检测线，单抗作为质控线；(5)单抗作为质控线，兔抗牛igg之外的其他igg作为检测线。

经验证，最佳组合为(1)，其在检测灵敏度上明显优于(2)-(4)。方法(1)最低能检测到1:64稀释的牛源蓝舌病标准阳性血清，而(2)-(4)只能检测到1:32稀释的牛源蓝舌病标准阳性血清，存在低浓度样品漏检的风险，(5)的检测线的亮度较弱，影响结果判定。

3、试纸条稳定性实验

将实施例1制备的试纸条与干燥剂装入铝箔袋中密封，置于37℃保存，保存的样本每隔一周用0.01mpbs缓冲液稀释64倍的牛源蓝舌病标准阳性血清进行一次检测。

结果如图4所示，表明实施例1制备的试纸条在37℃放置28天后仍能特异性检出，灵敏度并没有明显下降，说明该试纸条稳定性良好。

4、临床样品检测

使用同一批次实施例1制备的试纸条对200份牛未知血清样品(用pbs缓冲液1：50稀释)进行检测，10min后记录结果。同时以蓝舌病毒抗体检测标准elisa试剂盒(idexx)作为胶体金试纸条的对比参照，计算两种实验方法的符合率。

结果：在200份样品血清中，用idexx试剂盒检测显示阳性结果的样品为55份，阴性结果的样品为145；用实施例1制备的试纸条显示阳性结果的样品为51份，阴性结果的样品为149；以idexx试剂盒的检测结果作为标准，试纸条检出的51份阳性样品全部来源于55份阳性样品之中，两种实验方法仅有4个样品的结果不同，实施例1制备的试纸条检测的符合率为98％。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>一种胶体金免疫层析试纸及其制备方法与应用

<130>jh-zgjy-pi-20180151

<141>2018-10-26

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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