一种抗菌剂毒性的检测方法与流程

本发明属于毒性检测技术领域，尤其涉及一种抗菌剂毒性的检测方法。

背景技术：

秀丽线虫(caenorhabditiselegans)是一种可独立生存的小型生物，可以在世界上许多地方存活，主要是以细菌为食。作为常见模式生物，秀丽线虫具有生命周期短，基因组紧凑、易培养，体积小、繁殖速度快、对毒物敏感等优势。最重要的是，线虫体内超过40％的基因是与人类同源的；并且，在17种已报道过的信号通路中，有12种已经在线虫和人体内被发现。目前，它已经成功应用于各领域生物效应研究，包括基因组学、细胞生物学、神经学和衰老学科。从解剖学上看，成虫体内的结构是简单的，大概有1000个体细胞。秀丽线虫适合于遗传杂交并且每个成虫均可以生育很多后代。在适宜的条件下，秀丽线虫的生命周期大约是3天。同时，线虫可以在实验室内培养，培养的条件是固体或者液体培养基，食物来源是e.coli。由于线虫在整个生命周期都是透明的，可以在微分干涉差显微镜下观察到体内细胞层次，且整个秀丽线虫的解剖学描述已经在电子显微镜下完成，同时建立了动物之间具有共性的完整细胞谱系。秀丽线虫只有两种性别：雌雄同体(xx)和雄性(xo)。雌雄同体占大部分，雄性个体一般只占群体0.2％。雌雄同体可以自体受精产生遗传上相同的后代，也可以通过雄性交配促进突变菌株的分离与维持。

目前，秀丽线虫在毒性评价中的应用日趋成熟。很多文献采用了行为学的指标，包括体长、头部摆动、身体弯曲等。但是尚无文章提出对抗菌剂采用线虫进行慢性暴露测试的方法研究。

三氯卡班(tcc)是一种广谱抗菌剂，应用于个人护理，兽医，工业和家用产品。环境中三氯卡班的主要来源是废水和污泥；人类接触三氯卡班的方式有两种，一是和日常消费品直接接触，二是食用或饮用已污染的水和食物，这会导致它可以在人体的血液和尿液中检测到。从浓度和频率上看，三氯卡班是废水中十大常见有机物之一。三氯卡班对生态系统和人类的健康威胁主要包括抗菌剂的耐药性、生态毒性和潜在的内分泌干扰影响。就生态毒性而言，学者们已研究过抗菌剂对脊椎动物、鱼类、两栖动物、藻类和植物的急性毒性。但是抗菌剂的慢性毒性少有人研究，并且三氯卡班相比于其他抗菌剂研究的成果较少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种抗菌剂慢性毒性的检测方法。

本发明提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：

使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。

优选的，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间和/或世代时间评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为l1期线虫；根据秀丽线虫种群规模评价抗菌剂的毒性时，所述秀丽线虫为l4期线虫。

优选的，所述抗菌剂为三氯卡班。

优选的，所述评价抗菌剂对生长发育的毒性为所述秀丽线虫的体长小于1.14mm。

优选的，所述评价抗菌剂对神经系统的毒性为秀丽线虫的身体弯曲频率低于9.6次/20秒；头部摆动频率低于120.6次/min。

优选的，所述评价抗菌剂对生殖系统的毒性为后代数低于175条；世代时间大于87h；孵化时间延迟大于4h，相同时间的孵化率减少5％以上；种群规模减少38％以上。

优选的，所述后代数具体按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，生长至成虫期后，将秀丽线虫转移至固体培养基中，24h后计数，并将成虫转移至新的固体培养基中，重复上述操作，直至秀丽线虫不再产卵，得到总数为后代数。

优选的，所述孵化时间与世代时间具体按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，然后使用naoh与naclo溶液对虫子进行处理得到卵，从得到卵到卵孵化成l1秀丽线虫的时间为孵化时间；从得到卵到卵发育成成虫开始产卵的时间为世代时间。

优选的，所述种群规模具体按照以下步骤得到：将l4期秀丽线虫暴露于待测样品中，进行培养，记录秀丽线虫总数。

本发明提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。与现有技术相比，本发明提供的抗菌剂毒性的检测方法快捷高效，实验周期短，对仪器要求少，并可以估算出日常护理产品中抗菌剂安全使用的范围；同时本发明提供的检测方法为推测抗菌剂对后代的影响提供了技术基础，可以得出抗菌剂对亲代线虫及其后代产生的影响。

附图说明

图1为暴露于不同浓度三氯卡班线虫后代数的柱形图；

图2为暴露于不同浓度三氯卡班线虫孵化时间的曲线图；

图3为暴露于不同浓度三氯卡班线虫世代时间的柱形图；

图4为暴露于不同浓度三氯卡班线虫种群规模的曲线图；

图5为暴露于不同浓度三氯卡班线虫身体弯曲频率的柱形图；

图6为暴露于不同浓度三氯卡班线虫头部摆动次数的柱形图；

图7为暴露于不同浓度三氯卡班线虫身体长度的柱形图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

本发明利用秀丽线虫对抗菌剂的毒性进行检测，减少线虫生长的影响，优选先对秀丽线虫进行同步化处理；所述同步化处理的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选采用碱性次氯酸钠裂解法，更优选按照以下步骤进行：将秀丽线虫在接种有大肠杆菌op50(ecoliop50)的ngm固体培养基中，20℃培养，直至固体培养基中出现大量卵，然后用m9溶液冲洗含有秀丽线虫的固体培养基，得到虫液；将虫液静置，移去上清，再用m9溶液洗涤后，吸弃上清，然后加入m9溶液、氢氧化钠溶液与次氯酸钠溶液混合，震荡2～3min，直至虫体破碎后，离心，吸弃上清，并用m9溶液洗涤，转移至m9溶液中20℃培养24h，得到l1期线虫。将l1期线虫转移至ngm固体培养基20℃培养36～48h后，用m9溶液将ngm固体培养基上的线虫冲洗，自然沉降后，吸弃上清，重新加入m9溶液，重复沉淀、吸弃和加入步骤一次，吸弃上清后，得到l4期线虫。

所述ngm固体培养基为本领域技术人员熟知的nmg固体培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤制备：1.2gnacl、6.8g琼脂、1g蛋白胨与390ml水混合，高温灭菌后，加入400μlmgso4(浓度为1m)、400μlcacl2(浓度为1m)、400μl胆固醇(浓度为5mg/ml，溶剂为无水乙醇)、10mlk3po4缓冲溶液(浓度为1m，配置方法:10.83gkh2po4，4.66gk2hpo4·3h2o)，混匀后，倒入6cm平板中，在超净台放置2～3天后，ngm培养基即可用于实验。

接种有大肠杆菌op50(ecoliop50)的ngm固体培养基优选按照以下步骤制备：向ngm固体培养基中加入100μl菌液，37℃培养箱里倒置培养12h，后将板置于20℃培养箱，隔夜放置后即可用于线虫的培养。

所述m9溶液为本领域技术人员熟知的m9液体培养基即可，并无特殊的限制，本发明中优选按照以下步骤制备：7.56gna2hpo4·12h2o、1.5gkh2po4、2.5gnacl与500ml水混合，高温灭菌，然后加入已灭菌的500μlmgso4(浓度为1m)。

以秀丽线虫作为受试生物，评价待测样品中抗菌剂的毒性；所述待测样品优选按照以下步骤制备：将抗菌剂溶于有机溶剂中，并用k液稀释，使有机溶剂的体积分数低于0.1％；所述k液优选包括nacl、kcl与水；所述k液中nacl的浓度优选为0.002～0.004g/ml，更优选为0.003g/ml；所述k液中kcl的浓度优选为0.001～0.003g/ml，更优选为0.0024g/ml；所述k液需经高温灭菌后再使用；所述待测样品中抗菌剂的浓度优选为0～0.5mg/l；所述抗菌剂为本领域技术人员熟知的抗菌剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为三氯卡班。

使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度评价抗菌剂对生长发育的毒性，优选具体为：在食物来源充足的条件下，将l1期秀丽线虫暴露于待测样品3天，待线虫长至幼虫期时，将虫子转移至容器中，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗，优选清洗三次，高温处理使线虫呈伸直状态，再使用电感耦合软件将显微镜与电脑相连，拍摄线虫照片，并使用imagej软件测量线虫体长。线虫的身体长度定义为从线虫头部开始，沿着线虫中间部分，到线虫尾部的距离；所述评价抗菌剂对生长发育的毒性优选为所述秀丽线虫的体长小于1.14mm。

使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体弯曲频率与头部摆动频率评价抗菌剂对神经系统的毒性，优选具体为：将l1期秀丽线虫暴露于待测样品中3天，然后转移至没有食物的ngm固体培养基中，记录线虫在20s内身体弯曲的次数，1次身体弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上一个波长的移动；将l1期秀丽线虫暴露于待测样品中3天，然后转移至固体培养基中，让线虫自由运动约1分钟，在体视显微镜下观察线虫，记录线虫在1分钟内头部摆动的次数；1次头部摆动定义为线虫头部从一侧摆向另一侧，再摆回原位置；所述评价抗菌剂对神经系统的毒性优选为秀丽线虫的身体弯曲频率低于9.6次/20秒；头部摆动频率低于120.6次/min。。

使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生殖系统的毒性。

其中后代数优选具体按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，生长至成虫期后，将秀丽线虫转移至固体培养基中，24h后计数，并将成虫转移至新的固体培养基中，重复上述操作，直至秀丽线虫不再产卵，得到总数为后代数；后代数定义为l1期线虫在待测样品中暴露60h，每条线虫在每一天产卵数目及在整个产卵期繁殖的后代数；所述评价抗菌剂对生殖系统的毒性优选为后代数低于175条。

孵化时间与世代时间优选按照以下步骤得到：将秀丽线虫暴露于待测样品中，然后使用naoh与naclo溶液对虫子进行处理得到卵，从得到卵到卵孵化成l1秀丽线虫的时间为孵化时间；从得到卵到卵发育成成虫开始产卵的时间为世代时间；所述暴露时间优选为4天；所述评价抗菌剂对生殖系统的毒性优选为世代时间大于87h；孵化时间延迟大于4h，相同时间的孵化率减少5％以上。

所述种群规模优选具体按照以下步骤得到：将l4期秀丽线虫暴露于待测样品中，进行培养，记录秀丽线虫总数，即为种群规模；所述培养的条件为：培养箱摇床，速度为100～200rpm/min，优选为140～180rpm/min，再优选为160rpm/min，每24h添加一次食物；所述暴露时间优选为5天，从第6天开始每天取培养液，在光学显微镜下观察线虫来确定线虫总数。所述评价抗菌剂对生殖系统的毒性优选为种群规模减少38％以上；种群规模在一定程度上可以反映抗菌剂对线虫后代的毒性。

本发明提供的抗菌剂毒性的检测方法快捷高效，实验周期短，对仪器要求少，并可以估算出日常护理产品中抗菌剂安全使用的范围；同时本发明提供的检测方法为推测抗菌剂对后代的影响提供了技术基础，可以得出抗菌剂对亲代线虫、亲代线虫的后代以及亲代线虫后代的后代产生的影响。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种抗菌剂毒性的检测方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例

模式生物是秀丽线虫，从-80℃冰箱取出线虫，解冻，待线虫发育至第三代时，线虫经裂解，获得卵，20℃孵育24h后，获得l1期线虫。

所述三氯卡班的配置方法如下：以二甲亚砜(dmso)为溶剂配置1000mg/l的储存液。

秀丽线虫在不同浓度的三氯卡班下暴露一定时间后，对线虫各项测定指标如下：

对线虫生殖系统影响的指标进行如下的测定：

后代数：l1期线虫在不同浓度的三氯卡班下暴露60h，每条线虫在每一天产卵数目及在整个产卵期繁殖的后代数。

孵化时间和世代时间：l1期线虫在不同浓度的三氯卡班下暴露4天。使用naoh和naclo对收集到虫子分别进行处理获得卵，从此刻起一直到这些卵孵化成l1期线虫的时间为孵化时间；此刻起一直到这些卵发育成成虫开始产卵的时间称为世代时间。

种群规模：l4期线虫暴露5天后，线虫的种群大小。种群规模在一定程度上可以反映抗菌剂对线虫后代的毒性。

对线虫神经系统影响的指标进行如下的测定：

身体弯曲：在体视显微镜下，记录线虫在20sec内身体弯曲的次数。一次身体弯曲的定义是线虫相对于身体长轴方向上1个波长的移动。

头部摆动：在体视显微镜下，记录线虫在1min内头部摆动的频率。1次头部摆动的定义是线虫的头部从一侧摆向另一侧后，再摆动回来的运动。

培养基及实验试剂的配置

lb液体培养基：2gnacl，1gyeastextract，2gtryptone，然后加入200ml去离子水，高温灭菌。隔夜放置后，即可用于培养大肠杆菌ecoliop50.培养方法是37℃，220rpm条件下培养12h左右后将菌液收集。

ngm培养基：1.2gnacl、6.8g琼脂与1g蛋白胨混合后加入390ml的去离子水，高温灭菌后，加入400μlmgso4(浓度为1m)、400μlcacl2(浓度为1m)、400μl胆固醇(浓度为5mg/ml，溶剂为无水乙醇)、10mlk3po4缓冲溶液(浓度为1m，配置方法:10.83gkh2po4,4.66gk2hpo4·3h2o)，混匀后，倒入6cm平板中，在超净台放置2～3天后，ngm培养基即可用于实验。即向固体培养基中加入100μl菌液，37℃培养箱里倒置培养12h，后将板置于20℃培养箱，隔夜放置后即可用于线虫的培养。

m9溶液：7.56gna2hpo4·12h2o、1.5gkh2po4与2.5gnacl混合后加入500ml去离子水，高温灭菌。然后加入已灭菌的500μlmgso4(浓度为1m)。

k液：1.521gnacl与1.192gkcl混合，然后加入500ml去离子水，高温灭菌。

同步化线虫的获得

将秀丽线虫转移至接种大肠杆菌op50(ecoliop50)的ngm固体培养基里，在20℃培养箱里培养，直至固体培养基中出现大量的卵。此时，使用m9冲洗含有秀丽线虫的固体培养基，将得到虫液转移至1.5ml离心管中，静置1～2min，移去上清；接着在用m9清洗2次，用移液管吸弃上清，离心管内留有100μl虫液。接下来加入600μlm9、100μlnaoh和200μlnaclo，混合均匀，震荡2～3min，直至虫体破碎后，在离心机转速为3500rpm的条件下离心1min，沉淀即为卵。此时，应当吸弃上清，并用m9清洗2次，得到的沉淀就是线虫的卵。最后，向3cm的平板中加入3mlm9，并将上一步得到的卵移至m9中，在20℃培养箱里附于24h左右。24h后，即可获得实验所需要的l1期线虫。

用于实验的三氯卡班溶液的配置

由于三氯卡班微溶于水，所以以二甲亚砜为溶剂配置母液，浓度为1000mg/l。根据所查文献，三氯卡班设置的实验浓度在0～0.5mg/l之间，保证二甲亚砜的体积分数在低于0.1％即可。该实验方法使用的稀释溶液是k液。

后代数实验

l1期线虫在不同浓度的三氯卡班暴露60h(食物足量)，待线虫发育至成虫期时，每个实验组挑取15条虫子至固体培养基里，每个固体平板里一条虫子。24h后，在显微镜下计数后代数目，并将成虫转移至新板，重复操作，直至秀丽线虫不再产卵，得到后代数的柱形图如图1所示。

孵化时间和世代时间

l1期线虫在浓度为0.01、0.1、0.2和0.4mg/l的三氯卡班下暴露4天，分别将各个实验组的虫子收集起来，使用naoh和naclo对虫子进行处理获得卵，从此刻起一直到这些卵孵化成l1期线虫的时间为孵化时间，得到孵化时间的曲线图如图2所示；从此刻起一直到这些卵发育成成虫开始产卵的时间称为世代时间，得到秀丽线虫世代时间的柱形图如图3所示。

种群规模

该实验在3cm培养皿中进行，该培养皿含有3.5ml具有不同浓度的三氯卡班处理溶液。每个培养皿中加入相等数量的l4期线虫。将培养皿置于培养箱摇床中，速度为160rpm/min，温度为20℃，每24h添加一次食物。从第6天开始，每个锥形瓶每天取50μl溶液，在光学显微镜下观察线虫来确定每个实验组中的线虫总数，得到种群规模的曲线图如图4所示。

身体弯曲的次数

l1期线虫在不同浓度的三氯卡班暴露3天后，将秀丽线虫转移至1.5ml离心管里，然后转移至没有食物的ngm培养基，记录线虫在20sec内身体弯曲的次数，得到身体弯曲频率的柱形图如图5所示。

头部摆动的频率

l1期线虫暴露于不同浓度的三氯卡班3天后，将线虫收集至离心管里，然后转移到固体培养基里，让线虫自由运动约1分钟，在体视显微镜下观察线虫，记录线虫在1分钟内头部摆动的次数，得到头部摆动次数的柱形图如图6所示。

体长

在食物来源充足的条件下，l1期线虫暴露于不同浓度的三氯卡班3天，待线虫长至幼虫期时，将虫子转移至1.5ml本发明提供了一种抗菌剂毒性的检测方法，包括：使秀丽线虫暴露于待测样品中，根据秀丽线虫的身体长度、身体弯曲频率、头部摆动频率、后代数、孵化时间、世代时间和/或种群规模评价抗菌剂对生长发育、神经系统和/或生殖系统的毒性；所述待测样品含有抗菌剂。与现有技术相比，本发明提供的抗菌剂毒性的检测方法快捷高效，实验周期短，对仪器要求少，并可以估算出日常护理产品中抗菌剂安全使用的范围；同时本发明提供的检测方法为推测抗菌剂对后代的影响提供了技术基础，可以得出抗菌剂对亲代线虫、亲代线虫的后代以及亲代线虫后代的后代产生的影响。离心管里，pbs清洗3次，高温处理使线虫呈伸直状态。此时，使用电感耦合软件将显微镜与电脑相连，拍摄线虫图片，并使用imagej处理图片，得到身体长度的柱形图如图7所示。

结果分析：

不同浓度的三氯卡班对线虫影响的结果如下：

三氯卡班对后代数的影响浓度是在0.2mg/l以上，随着浓度的上升，产卵数目显著减少。

世代时间和孵化时间也是判断抗菌剂对线虫生殖系统影响的指标。相对于对照组而言，使用三氯卡班处理的实验组的世代时间至少大于87h，孵化时间至少延迟4h；并且三氯卡班对世代时间和孵化时间的影响浓度在0.1mg/l以上。这说明世代时间和孵化时间是能够灵敏地判断三氯卡班毒性的指标。

对于种群规模来说，0.1、0.2、0.4mg/l三氯卡班可以使第8、9和10天的线虫种群数目明显减少。

三氯卡班对神经系统的影响范围在0.1mg/l以上，神经系统产生负效应的浓度要比生殖系统低，并且浓度与身体弯曲次数及头部摆动频率之间有明显的剂量效应关系。

三氯卡班对线虫生长发育指标的影响范围在0.01mg/l以上，，效应浓度要比神经系统低一个数量级，这表明体长是一个评价毒性的灵敏指标之一。