用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法
【专利说明】用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法
[0001] 本发明涉及用于对抗抗菌剂抗性细菌的组合物和方法。特别地，其涉及用于使细 菌对抗菌剂敏感并将该细菌暴露于已经使其敏感的抗菌剂中从而将其杀灭。
[0002] 细菌引起一些最严重的人和动物感染性疾病并且仍然是全世界死亡的主要原因。 抗菌剂抗性的发展是医院和社区中治疗细菌感染中的主要问题。对抗微生物剂存在不同的 抗性机制，如固有抗药性，其是不必与给定类型的抗微生物剂关联的一般适应性过程的结 果。这样的抗药性的实例可见于绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa)，其低膜渗透性很可 能是其对许多抗菌剂先天抗药的主要原因。后天抗药性是主动抗菌剂抗性的主要机制并且 是特定进化压力的结果，以允许细菌预先对抗菌剂敏感从而变得有抗性。这样的抗药性包 括渗透屏障的改变，包括外排栗的过表达；抗微生物药物靶标的改变；以及抗菌剂的失活， 例如通过酶修饰。在Bockstael&VanAerschot(2009)Eur.J.Med.4(2)，141_155 中综述了 细菌的抗微生物剂抗性。
[0003] 仍旧需要对抗细菌感染的另外的方法，并且本发明涉及使抗菌剂抗性细菌对抗菌 剂的作用敏感，从而有助于克服抗菌剂抗性的方法。抑制抗菌剂抗性决定因子的试剂是已 知的，但并不都证实用于使细菌对抗菌剂敏感，原因是其不能进入抗菌剂抗性细菌并到达 靶位点。本发明的目的旨在克服这些困难中的一些。
[0004] 本发明的第一方面提供了一种组合物，该组合物包含细菌进入促进剂和抑制抗菌 剂抗性的试剂。
[0005] 所述组合物还可以包含抗菌剂。
[0006] 本发明的再一方面提供了用于使细菌对抗菌剂敏感的方法，所述方法包括以下步 骤：在进入促进剂存在的情况下，使细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
[0007] 本发明的另一方面提供了用于杀灭抗菌剂抗性细菌的方法，所述方法包括以下步 骤：在进入促进剂存在的情况下，使细菌暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中并使细菌暴露于 抗囷剂中。
[0008] 本发明实施方案的任何方面中的进入促进剂优选地如在2012年10月11日提交 的PCT/GB2012/052526中所述的进入促进剂，通过引用将其并入本文中。
[0009] 术语"进入促进剂"意指能够进入细菌的荚膜和/或细胞壁的化合物或组合物。优 选地，所述试剂还能够使抑制抗菌剂抗性的试剂也通过细菌的细胞质膜。
[0010] 进入促进剂
[0011] 本发明的任意方面或实施方案的进入促进剂典型地为聚合物，其中所述聚合物包 括直链和/或支链聚单胍/聚胍、聚双胍或其类似物或衍生物，例如根据下式la或式lb的， 并在下表1和2中给出实例：
[0012] 式la
[0013]
[0016]其中：
[0017] "η"是指聚合物中重复单元的数量，并且η可以从2到1000变化，例如从2或5到 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800 或 900变化；
[0018]GJPG2独立地表示包含双胍或胍的阳离子基团，其中LJPL2直接连接到胍的氮原 子上。因此，双胍或胍基与聚合物骨架是成一体的。双胍或胍基在式la中不是侧链部分。
[0019] 阳离子基团的实例：
[0023] 在本发明中，LdPL2是聚合物中G 62阳离子基团之间的连接基团。L1^可 以独立地表不含有。碳原子的脂肪族基团，例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、。9或C10;C「C10、_C20、_C30、_C40、_C50、_C60、_C70、_C80、_C90、_C100、_C110、_C120、 -C13。或-c14。，烷基；或LJPL2可以（独立地）为C「C14。（例如CpC2、C3、C4、C5、C6、C7、Cs、C9 或C1Q;C「C1Q、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、-C9。、_C1Q。、-Cn。、_C12。、_C13。或_c14。）、月曰环 族基团、杂环基团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基，或LdPL2可以（独 立地）为任选地被一个或多个，优选地一个氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环 部分中断的聚亚烷基。适合的LdPL2的实例是表1中列出的基团。
[0024]LpL2、GjPG2可能已使用脂肪族基团、脂环族基团、杂环基、芳基、烧芳基、和氧基 亚烷基修饰。
[0025] ~和63优选地为端基。典型地，用于本发明的聚合物具有末端的氨基（N)和氰基 狐（G3)或狐（G3)端基。这样的端基可以通过与脂肪族基团、脂环族基团、杂环基、芳基、烷基 芳基、芳基烷基、氧基亚烷基连接（例如使用1，6-二氨基己烷、1，6-双（氰基胍基）己烷、 1，6-二胍基己烷、4-胍基丁酸）来修饰。此外，可以通过与受体配体、右旋糖酐、环糊精、月旨 肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇或胆固醇衍生物或聚乙二醇（PEG)连接来修饰端基。任选地， 聚合物可以在N和G3位置处以胍或双胍或氰基胺或胺或氰基胍结束，或在N处以氰基胺结 束而在G3位置处以氰基胍结束，或在N处以胍结束而在G3位置处以氰基胍结束，或在G3处 以L1胺结束和在N处以氰基胍结束。G3可以是h-胺、L2-氰基胍或1^2-胍。根据聚合（η) 或聚合物链断裂的数量和在合成过程中的副作用，端基的不均匀混合物可以作为实例如上 所述出现。因此，如上所记载的，Ν和G3基团可以互换/作为不均匀混合物存在。可选地 Ν和63可以不存在并且聚合物可以是环状的，在这种情况下各个末端的LJPG2基团彼此直 接连接。
[0026] 在式lb中，X可以存在或不存在。L3、LjPX如以上针对"1^或1^2 "所述的。。和 L4以及X是聚合物中G4和G5阳离子基团之间的连接基团。L3和L4以及X可以独立地表示 含有。碳原子的脂肪族基团，例如烷基基团如亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、CS、 09或C10;C「C10、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、_C9。、_C10。、_Cn。、_C12。、_C13。或_Cμ。， 基；或LjpL4以及X可以独立地为C「C14。（例如CpC2、C3、C4、C5、C6、C7、Cs、(：9或C1Q;C「C1Q 、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、-C9。、_C1Q。、-Cn。、_C12。、_C13。或_c14。）、月曰环族基团、杂环基 团、芳香族基团、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亚烷基，或1<5和L4以及X可以独立地为任 选地被一个或多个，优选一个氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断的聚 亚烷基。适合的LjpL4以及X的实例是表2中列出的基团。
[0027] "G/'和"G5"是阳离子部分并且可以相同或不同。它们中的至少一个是双胍部分 或氨基甲酰基胍，其他部分可以如上所述（双胍或氨基甲酰基胍）或胺。为了避免疑问，在 式lb中，阳离子部分64和65仅不含单胍基团。例如，GjPG5典型地不含单胍基团。这样 的化合物的实例是如表2中列出的聚烯丙基双胍、聚（烯丙基二胍基-共（co)-烯丙胺）、 聚（烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺）、聚乙烯基双胍。
[0028] 聚烯丙基双胍的实例如下所示
[0029]
[0030] 在聚烯丙基双胍的情况下，L#PL4相同，G4和G5类似，因此聚烯丙基双胍可以简 化如下。
[0031]
[0032] 聚（烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺）的实例如下所示
[0033]
[0034] 用于本发明的聚合物一般会有与其相关的抗衡离子。适合的抗衡离子包括但不限 于以下：卤化物（例如氯化物）、磷酸盐、乳酸盐、膦酸盐、磺酸盐、氨基羧酸盐、羧酸盐、羟基 羧酸盐、有机磷酸盐、有机膦酸盐、有机磺酸盐和有机硫酸盐。
[0035] 用于本发明的聚合物可以是不同"η"数目的聚合物的不均匀混合物或通过标准纯 化方法纯化的包含指定"η"数目的均匀部分。如上面所表明，聚合物也可以是环状的，另外 可以是分支的。
[0036] "η" 的优选数目包括 2-250、2-100、2-80 和 2-50。
[0037] 表1.由式la产生的聚合物类似物的实例
[0043] 表2.由式lb产生的聚合物类似物的实例。
[0044]
[0045] 用于本发明的方法、组合物、制剂、用途和试剂盒的进入促进剂可以包含线性、分 支或树状分子。进入促进剂可以包含线性、分支或树状分子的组合。进入促进剂可以包含 式la或式lb的分子的一个或任意组合，例如如上所述。
[0046] 例如，进入促进剂可以包含聚六亚甲基双胍（PHMB)、聚六亚甲基单胍（PHMG)、聚 亚乙基双胍（PEB)、聚四亚甲基双胍（PTMB)或聚亚乙基六亚甲基双胍（PEHMB)中的一种或 多种。一些实例列于表1和2。本发明的任意方面的进入促进剂优选为PHMB或PHMG或两 者中任一个的类似物或衍生物。
[0047] 进入促进剂可以包含聚六亚甲基双胍（PHMB)、聚六亚甲基单胍（PHMG)、聚亚乙 基双胍（PEB)、聚四亚甲基双胍（PTMB)、聚亚乙基六亚甲基双胍（PEHMB)、聚亚甲基双胍 (PMB)、聚（烯丙基二胍基-共-烯丙胺）、聚（N-乙烯基双胍）、聚烯丙基双胍中的一种或 多种的均匀或不均匀混合物。
[0048] 如本领域普通技术人员众所周知的，化合物可以通过标准程序在实验室合成或可 以得自商业供应商。
[0049] 例如，PHMB还具有同义词聚（六亚甲基）双胍盐酸盐；聚合双胍盐酸盐；聚盐酸 己双胍；双胍；CAS号27083-27-8 ;32289-58-0 ;IUPAC名称聚（亚氨基酰亚胺羰基）亚 氨基六亚甲基盐酸盐。PHMB可以通过标准程序在实验室合成或可以得自供应商，例如 Arch(http://www.archchemicals.com/Fed/BIO/Products/phmb.htm) 〇 典型地n= 2 至 40,平均值n为11，平均分子量为3025。PHMB作为杀虫剂出售，例如用于卫生产品、游泳池 水处理和伤口敷料。
[0050] 聚六亚甲基单胍（PHMG)可以通过标准程序在实验室合成或可以得自供应商， 例如得自ShanghaiSounderIndustryCo. ,Ltd,http://sounder,en.busytrade.com/ products/info/683633/PHMG·html〇
[0051] 如本领域普通技术人员所理解的，进入促进聚合物可以是共聚物或杂聚物，即单 体可以不是相同的。然而，通常单体单元相同。
[0052] 抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂可以共价连接。可选地，抑制抗菌剂抗性的 试剂和进入促进剂可以提供为制剂，例如非共价络合络合物。可以通过将进入促进剂和抑 制抗菌剂抗性的试剂以适当的比率并在适当的条件下，例如pH和盐浓度适当的条件下混 合来制备制剂。可以例如通过使用等摩尔浓度的载体和货物（cargo)分子，从抑制抗菌剂 抗性的试剂比进入促进剂摩尔过量高达1〇〇倍开始，到进入促进剂比抑制抗菌剂抗性的试 剂摩尔过量高达1000倍来进行该方法。例如，抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂的适当 的摩尔比可以为1:0. 1至1:50或1:0. 5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1. 5左 右。抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂的适当的重量：重量比可以为1:0. 1至1:50或 1:0. 5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1. 5左右。以下进一步讨论络合物的形 成。
[0053] 混合/孵育进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的pH可以是高pH，例如 10-13. 5,如以下进一步讨论的。特别优选的是，当抑制抗菌剂抗性的试剂是核酸时，在高pH 下混合/孵育所述试剂。
[0054] 可选地，混合/孵育进入促进剂和抑制抗菌剂抗性的试剂的pH可以是中性pH，例 如6. 5至8. 6。特别优选的是，当抑制抗菌剂抗性的试剂是肽时，在中性pH下混合所述试 剂。适当的孵育条件将由本领域技术人员来确定并且可以根据使用的试剂的确切性质来优 化。将选择向细菌细胞提供最有效的递送的条件。在适当的情况下，pH可以是低pH，即小 于6〇
[0055] 在一个实施方案中，可以在具有尚pH的缓冲液中一起提供进入促进剂和抑制抗 菌剂抗性的试剂。因此，用于促进抑制抗菌剂抗性的试剂进入细菌细胞的方法可以包括以 下步骤：在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中（均如上所 述），其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂已经在高pH下混合或孵育，例如在具 有高pH的缓冲液中混合或孵育。术语"高pH"对于本领域技术人员而言是众所周知的并且 典型地指9以上的pH，例如9. 5以上或10以上，例如10至13. 5的pH。典型地，在高pH下 混合抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂以形成纳米粒子，然后在进入促进剂的存在下将 细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
[0056] 在再一个实施方案中，可以在具有中性pH的缓冲液中一起提供进入促进剂和抑 制抗菌剂抗性的试剂。因此，用于促进抑制抗菌剂抗性的试剂进入细菌细胞的方法可以包 括以下步骤：在进入促进剂的存在下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中（均如上 所述），其中所述抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂已经在中性pH下混合或孵育，例如 在具有中性pH的缓冲液中混合或孵育。术语"中性pH"对于本领域技术人员而言是众所周 知的并且典型地指7左右的pH，例如6以上或9以下，例如6. 5至8. 6的pH。可以在中性 pH下混合抑制抗菌剂抗性的试剂和进入促进剂以形成纳米粒子，然后在进入促进剂的存在 下将细菌细胞暴露于抑制抗菌剂抗性的试剂中。
[0057] 具体地，如本领域技术人员将理解，认为pH6 - 13. 5的缓冲液（有或没有添加的 盐，如在分子生物学缓冲液，例如例如PBS、NaCl或许多其他中常用的）提供具有改进的 递送效率的制剂，根据待递送的试剂的性质改变pH。可以用适合的生长培养基以1:1至 1:1000稀释所生产的络合物，甚