一种伪狂犬病病毒的间接ELISA检测试剂盒的制作方法

本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种伪狂犬病病毒的间接elisa检测试剂盒。

背景技术：

猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由猪伪狂犬病病毒(prv)引起的一种烈性传染病，主要引起母猪流产、死胎，仔猪出现神经症状，对养猪业危害极大。多年以来，我国采用的pr疫苗主要基于疫苗株batha-k61制备，并取得较好的效果。然而2011年以来，在我国北方多个省份相继暴发猪伪狂犬病，继而向全国蔓延，其流行特征为batha-k61等经典疫苗株不能提供足够的保护，并且致死率高。我国学者研究认为，猪伪狂犬病病毒的流行是由于病毒的变异造成。交叉中和试验表明，2011年以来的流行毒株的免疫原性与之前的经典毒株已经有了一定的差异。基因测序结果表明，与经典毒株相比，病毒在gb、gc、gd和ge等多个关键基因都发生了特征性的重大变异。由于流行毒株的变异，不仅急需更换与之相匹配的疫苗，而且需要建立与之相匹配的检测技术，一则用于新疫苗的抗体监控和免疫评价，二则用于建立与变异株疫苗相匹配的免疫程序，以适应针对当前流行毒株的防控需要。

酶联免疫吸附试验(elisa)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其用于检测特异性抗体，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。该技术在猪伪狂犬病的防控中发挥了重要的作用。其中针对gb蛋白的抗体elisa检测，是猪伪狂犬病抗体监测和免疫效果评价的最重要和最常用的方法。

研究发现，2011年以来的猪伪狂犬病病毒，与经典的batha-k61等传统疫苗株相比，基因发生了重大的变异，gb蛋白n端表位发生了总共17个氨基酸的替换和缺失。由于市售gb-elisa试剂盒都是根据传统毒株建立的，gb重要抗原表位的变异，已影响到试剂盒的检测准确性。在2011年以来的临床实践中，许多用gb-elisa试剂盒检测阳性率较高，免疫评价较好的养猪场，在变异株病毒到来时仍然会造成大面积感染。

抗体监控和免疫评价是伪狂犬病防控中的重要环节，没有准确的检测方法就难以建立良好的免疫程序，也难以保证免疫效果。由于当前流行的猪伪狂犬病病毒gb基因n端抗原表位的重大变异，当前elisa检测试剂盒已不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。

技术实现要素：

由于伪狂犬病病毒2001年出现的变异，病毒gb重要抗原表位已经发生变化，当前elisa试剂盒的检测结果已经不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。为了解决上述技术问题，本发明建立一种检测prv抗体的间接elisa试剂盒。

本发明的目的在于提供一种伪狂犬病病毒的间接elisa试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

seqidno:1所示氨基酸序列在制备伪狂犬病毒间接elisa检测试剂盒中的应用。

seqidno:2所示核酸序列在制备伪狂犬病毒间接elisa检测试剂盒中的应用。

一种伪狂犬病毒的间接elisa检测试剂盒，其组成包括：重组蛋白包被抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、酶标二抗、显色液及终止液和洗涤液；

所述重组蛋白包被抗原中含有seqidno:1所示氨基酸序列。

优选的，所述封闭液为含脱脂奶的pbst溶液，脱脂奶浓度为3g/100ml～5g/100ml。

优选的，所述酶标二抗为hrp标记的羊抗猪igg。

优选的，所述显色液为tmb底物液；所述终止液为：1.2mol/l～2mol/l硫酸。

优选的，所述洗涤液为pbst缓冲液。

优选的，阳性对照血清为c株(属于2011年以后流行的伪狂犬病病毒变异毒株)疫苗免疫猪获得的高免血清。

优选的，阴性血清为未感染伪狂犬病病毒且未经免疫的猪的血清。

一种伪狂犬病毒的间接elisa检测方法，包括以下步骤：

(1)包被：用碳酸缓冲盐溶液稀释重组蛋白包被抗原，将重组蛋白包被抗原稀释为0.90mg/l，每孔加入80～120μl，3～7℃包被20～18h后甩干，用pbst洗涤；所述重组蛋白包被抗原中含有seqidno:1所示氨基酸序列；

(2)封闭：每孔加入封闭液，36～38℃封闭1.5～2.5h后甩干，用pbs洗涤；

(3)待测血清作用条件：待测血清用稀释液稀释后，每孔加入80～120μl，36～38℃孵育0.8～1.2h后甩干，用pbst洗涤；

(4)二抗作用条件：将hrp标记的羊抗猪igg用pbst稀释后，每孔加入80～120μl，36～38℃孵育0.8～1.2h后甩干，用pbst洗涤；

(5)显色：每孔加入显色液，36～38℃孵育8～12min后加终止液终止反应；

(6)读数：用酶标仪在450mn下读取od数据，计算结果，根据结果判定样品中是否含有伪狂犬病毒。

优选的，所述封闭液为含脱脂奶的pbst溶液，脱脂奶浓度为3g/100ml～5g/100ml；所述酶标二抗为hrp标记的羊抗猪igg；所述显色液为tmb底物液；所述终止液为：1.2mol/l～2mol/l硫酸。

优选的，所述稀释液含4.8～5.2％脱脂奶和4.8～5.2％大肠杆菌裂解稀释液的pbst。

优选的，根据结果判定样品中是否含有伪狂犬病毒的标准如下：s/p值判定结果计算公式如下：

样品od值＝检测孔od值-对照孔od值

临界od值＝阴性血清平均od值+3×标准差

样品s/p值＝样品od值/参考阳性血清od值

临界s/p值＝临界od值/参考阳性血清od值

间接elisa结果判定标准：当参考阳性血清od值≥0.75，参考阴性血清od值<0.25，同时参考阴性血清od值/参考阳性血清od值<0.2，表明试验成立，样品临界s/p值为0.3，s/p≥0.3判定为阳性，s/p<0.3判定为阴性。

本发明的有益效果是：

由于伪狂犬病病毒2001年出现的变异，病毒gb重要抗原表位已经发生变化，当前elisa试剂盒的检测结果已经不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。本发明建立了一种检测prv抗体的间接elisa试剂盒，对伪狂犬病病毒2001年以后的流行病毒具有更准确的检测效果，其准确性具体表现为，其检验结果与基于流行毒株的微量血清抗体中和试验具有更好的符合率，因此更符合临床实际的抗体保护力水平。

附图说明

图1是重组蛋白his-by在大肠杆菌bl21(de3)中的诱导表达的sds-page(左)和westernblot(右)分析图；其中，左边为sds-page分析图，第1泳道为蛋白分子量标准，由下至上分别为15kd、25kd、35kd、45kd、55kd、70kd条带；第2泳道为重组菌bl21(de3)(pet32a-gbn)诱导表达产物，在35kd和45kd之间表达出重组蛋白；第3泳道为重组菌bl21(de3)(pet32a)诱导表达产物；第4泳道为未经诱导的重组菌bl21(de3)(pet32a-gbn)。右边为相应的westernblot图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1包被抗原的制备

(1)重组表达载体质粒pet32a-gbby的构建

人工合成如seqidno:2所示的序列，插入pet32a表达载体，构建重组表达载体质粒pet32a-gbby，委托公司对插入位点两端测序，确定插入成功。

seqidno:2所示的序列为：

gcagcagcacgcggtgcagttgcactggcactgctgctgctggcactggcagcaaccccgacctgtggtgcagcagcagttacccgcgcagcaagcgcaagcccggcaccgggaactggtgcaaccccggatggttttagcgcagaagaaagcctggaagaaattgatggtgcagttagtccgggtccgagcgatgcaccggatggtgaatatggcgatctggatgccaggaccgcagttcgcgcagcagcaaccgaacgtgatcgcttctacgtttgtccgccgccgagcggtagcaccgttgttcgtctggaaccggaacaggcatgtccggaatatagccagggtcgtaattttaccgaaggtattgcagttctg。

(2)重组蛋白的诱导表达

重组表达载体质粒pet32a-gbby大肠杆菌转化至e.coli.bl21(de3)细胞，经0.1mmiptg诱导表达重组蛋白his-by。以伪狂犬病病毒兔高免血清为一抗，以hrp标记的羊抗兔igg为二抗,对诱导表达产物进行western-blot检验，结果提示重组蛋白his-by蛋白与伪狂犬病病毒抗体可以特异性地结合。(sds-page和western-blot图见附图1)

(3)重组蛋白的纯化

该蛋白主要以可溶性形式存在。采用镍柱亲和层析方法纯化(参照novagen公司high-affinityni-ntaresin试剂盒说明书)得到重组蛋白gb-by，制得包被抗原。对照孔包被的蛋白为硫氧还原蛋白，由pet32a(+)质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)细胞诱导表达，采用镍柱亲和层析方法纯化。纯化产物即可作为elisa板包被抗原(重组蛋白his-by蛋白)，所述重组蛋白his-by蛋白中含有seqidno:1所示氨基酸序列。

seqidno:1所示氨基酸序列为：

aaargavalallllalaatptcgaaavtraasaspapgtgatpdgfsaeesleeidgavspgpsdapdgeygdldartavraaaterdrfyvcpppsgstvvrlepeqacpeysqgrnftegiavl。

实施例2以纯化的重组蛋白his-by作为包被抗原建立间接elisa方法

(1)包被：用ph为9.6的0.05m碳酸缓冲盐溶液稀释包被抗原，将实施例1中的his-by蛋白稀释为0.90mg/l，对照孔蛋白稀释为0.45mg/l，每孔加入100μl，4℃包被24h后甩干，用pbst洗涤2次；

(2)封闭：用pbst稀释5％脱脂奶(组分v)，每孔加入300μl，37℃封闭2h后甩干，用pbs洗涤3次；

(3)待测血清作用条件：稀释液为含5％脱脂奶和5％大肠杆菌裂解稀释液的pbst。待测血清用稀释液1：100稀释后，每孔加入100μl，37℃孵育1h后甩干，用pbst洗涤4次；

(4)酶标二抗作用条件：hrp标记的羊抗猪igg(sigma公司产品)，用pbst做1：3000倍稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h后甩干，用pbst洗涤4次；

(5)显色：tmb底物(sigma公司产品)，每孔加入100μl，37℃孵育10min后加2mh2so4,每孔加入100μl终止反应；

(6)读数：用酶标仪在450mn下读取数据，计算结果。

本发明中提及的pbst均为含有0.05％吐温-20的0.05mph7.4的磷酸缓冲溶液。

阳性标准血清的制备：

阳性对照血清为c株(属于2011年以后流行的伪狂犬病病毒变异毒株)疫苗免疫猪获得的高免血清。

阴性血清为未感染伪狂犬病病毒且未经免疫的猪的血清。

s/p值判定结果计算公式如下：

样品od值＝检测孔od值-对照孔od值

临界od值＝阴性血清平均od值(n>30)+3×标准差

样品s/p值＝样品od值/参考阳性血清od值

临界s/p值＝临界od值/参考阳性血清od值

间接elisa结果判定标准：当参考阳性血清od值≥0.75，参考阴性血清od值<0.25，同时参考阴性血清od值/参考阳性血清od值<0.2，表明试验成立，样品临界s/p值为0.30，s/p≥0.30判定为阳性，s/p<0.30判定为阴性。

实施例3一种基于伪狂犬病毒gb基因n端肽段的间接elisa试剂盒

该试剂盒的组成包括：50～200μl实施例1制备的重组蛋白his-by作为包被抗原、50～200μl阳性对照血清、50～200μl阴性对照血清、50～200μl封闭液、50～200μl酶标二抗、50～200μl显色液及50～200μl终止液、25ml～100ml洗涤液、血清稀释液。

重组蛋白his-by为伪狂犬病病毒2011年流行毒株gb基因n端变异肽段通过大肠杆菌表达系统获得的蛋白，并通过镍柱亲和层析进行重组蛋白纯化，经sds-page分析后得到纯化目的蛋白(见实施例1)，重组蛋白his-by中含有seqidno:1所示氨基酸序列，重组蛋白his-by使用包被缓冲液稀释为0.91mg/l。

所述包被缓冲液配方为：na2co31.59g、nahco32.93g溶于去离子水中，定容至1000ml，调至ph9.5～9.8。

阳性对照血清为c株(属于2011年以后流行的伪狂犬病病毒变异毒株)疫苗免疫猪获得的高免血清。

阴性对照血清为未感染伪狂犬病病毒且未经免疫的猪的血清。

所述血清稀释液为含5％脱脂奶和5％大肠杆菌裂解稀释液的pbst。

所述封闭液为含脱脂奶的pbst溶液，脱脂奶浓度为3g/100ml～5g/100ml。

所述酶标二抗为hrp标记的羊抗猪igg，使用浓度为1:2000～1:5000。

所述显色液为tmb底物液，检测波长为450nm。

所述终止液为：1.2mol/l～2mol/l硫酸。

所述洗涤液为pbst缓冲液,配方为：nacl8.0g、kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、tween-200.5ml溶于800ml蒸馏水，调整ph为7.4，定容至1000ml。

实施例4与微量血清中和试验的检验符合率试验

50份血清，分别用实施例的方法，某公司猪伪狂犬病病毒gb抗体检测试剂盒及微量血清抗体中和试验进行检验，将检验结果进行对比。

1.材料：

(1)血清：三组血清。第一组血清20份(编号1-01到1-20)，为用bartha-k61(gi/ge缺失株)疫苗免疫过二次的猪的血清，经idexx猪伪狂犬病病毒gi(ge)抗体检测试剂盒检验野毒抗体为阴性，即该组血清用bartha-k61疫苗免疫过且未感染过prv野毒。第二组血清5份(编号2-01到2-05)，为感染过当前prv流行病毒后的康复后猪血清。第三组(编号3-01到3-10)血清10份，为用流行病毒毒株免疫二次的猪的血清，经idexx猪伪狂犬病病毒gi(ge)抗体检测试剂盒检验野毒抗体为阴性，即该组血清用流行毒株疫苗免疫过且未感染过prv野毒病毒。

(2)病毒：prvgd02株，2014年从临床野毒分离并经三次蚀斑纯化。细胞：vero细胞。

(3)某公司猪伪狂犬病病毒gb抗体检测试剂盒。

2.方法：

(1)按照实施实例2方法，用本发明试剂盒进行检测。

(2)用某公司猪伪狂犬病病毒gb抗体检测试剂盒进行检测。根据该试剂盒的说明书s/n值≤0.6为阳性，s/n值>0.7为阴性。

(3)用微量血清中和抗体试验，利用prv流行毒株gd02在vero细胞上检测待测血清中的中和抗体。

3.结果：

结果如表1所示，35份样品，本发明试剂盒对抗体中和试验的符合率为85.7％，而某公司试剂盒对抗体中和试验的结果总符合率为51.4。其中第一组中本发明试剂盒对抗体中和试验的符合率为85.0％，而某公司试剂盒对抗体中和试验的结果符合率为35.0％，第二组中本发明试剂盒对抗体中和试验的符合率为100％，某公司试剂盒对抗体中和试验的结果符合率为80％；第三组中本发明试剂盒对抗体中和试验的符合率为80％，而某公司试剂盒对抗体中和试验的结果符合率为70％。

结果表明，相对于现有试剂盒，本发明试剂盒的检验结果，与基于流行毒株的抗体中和试验具有更好的符合率。

表1与微量血清中和试验的检验符合率试验

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>一种伪狂犬病病毒的间接elisa检测试剂盒

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>126

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

alaalaalaargglyalavalalaleualaleuleuleuleualaleu

151015

alaalathrprothrcysglyalaalaalavalthrargalaalaser

202530

alaserproalaproglythrglyalathrproaspglypheserala

354045

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505560

aspalaproaspglyglutyrglyaspleuaspalaargthralaval

65707580

argalaalaalathrgluargaspargphetyrvalcyspropropro

859095

serglyserthrvalvalargleugluprogluglnalacysproglu

100105110

tyrserglnglyargasnphethrgluglyilealavalleu

115120125

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<211>378

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcagcagcacgcggtgcagttgcactggcactgctgctgctggcactggcagcaaccccg60

acctgtggtgcagcagcagttacccgcgcagcaagcgcaagcccggcaccgggaactggt120

gcaaccccggatggttttagcgcagaagaaagcctggaagaaattgatggtgcagttagt180

ccgggtccgagcgatgcaccggatggtgaatatggcgatctggatgccaggaccgcagtt240

cgcgcagcagcaaccgaacgtgatcgcttctacgtttgtccgccgccgagcggtagcacc300

gttgttcgtctggaaccggaacaggcatgtccggaatatagccagggtcgtaattttacc360

gaaggtattgcagttctg378