香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法与流程

本发明涉及一种香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法。

背景技术：

香樟(cinnamomumcamphora)作为亚热带地区重要的材用和特种经济树种，不仅发挥着重要的园林绿化价值，且其材质上乘，是贵重家具、造船和雕刻等的重要用材，此外，樟树皮、果和根等具有一定的药用价值。本申请人前期从香樟中分离得到4个cccbf基因，命名为cccbfa、cccbfb、cccbfc和cccbfd(genbank登录号分别为kj958932、kj958933、kp336741和kp336742，以下简称cccbfs基因)。欲在香樟中研究cccbfs基因功能，然而，由于木本植物本身的特殊性，使其遗传转化和再生周期较长，通过获得转基因香樟植株研究cccbfs基因功能不切实际。因此，发掘快速准确基因功能研究材料，具有重要意义。

胚性愈伤组织分裂活性强，且具备胚胎发生能力，研究发现以香樟胚性愈伤组织作为受体，能获得较理想的转化效果，香樟胚性愈伤组织可能是抗寒基因功能验证的好材料。然而，目前尚不清楚香樟胚性愈伤组织能否准确快速的响应低温胁迫。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法。本发明通过荧光定量pcr技术，分析香樟胚性愈伤组织在分子水平上感知低温胁迫的能力，筛选获得胚性愈伤组织相对表达量反应最剧烈的时刻；并通过测定渗透调节物质、膜代谢产物以及酶活性等指标，分析其在植物组织水平响应低温胁迫的能力，筛选获得胚性愈伤组织应对低温较敏感的生理指标及对应的时刻，从而建立香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系。

本发明提供香樟胚性愈伤组织抗寒性评价方法，将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛mda含量以及超氧化物歧化酶sod、过氧化氢酶cat和过氧化物酶pod的活力；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较高，sod、cat和pod活力相对较强，mda含量相对较低时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较强；当脯氨酸、可溶性糖含量相对较低，sod、cat和pod活力相对较弱，mda含量相对较高时，则对应的香樟胚性愈伤组织的抗寒性相对较弱。

作为优选，所述低温胁迫处理是在4℃和/或-4℃下处理0.5-24h。

作为优选，所述处理时的光照强度为3000lx，光照时间16h·d^-1。

作为优选，所述将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛mda含量以及超氧化物歧化酶sod、过氧化氢酶cat和过氧化物酶pod的活力的具体方法为：将香樟胚性愈伤组织在4℃下处理2h，测定可溶性糖含量；将香樟胚性愈伤组织在4℃下处理8h，测定脯氨酸含量和sod活力；将香樟胚性组织在4℃下处理12h，测定丙二醛含量和cat活力。

作为优选，所述将香樟胚性愈伤组织进行低温胁迫处理，测定香樟胚性愈伤组织中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛mda含量以及超氧化物歧化酶sod、过氧化氢酶cat和过氧化物酶pod的活力的具体方法为：将香樟胚性愈伤组织在-4℃下处理2h，测定可溶性糖和丙二醛的含量以及pod活力；将香樟胚性愈伤组织在-4℃下处理8h，测定脯氨酸含量和cat活力。

香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系的建立，不仅证实了胚性愈伤组织可以作为鉴定香樟抗寒性的良好材料，而且揭示了香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下表达模式以及各生理生化指标变化规律，并筛选获得该材料响应低温胁迫最剧烈的时刻和较敏感的生理指标。该体系的建立可以短时间内，对大批量不同香樟胚性愈伤组织材料的抗寒性进行快速、简便评价，为将香樟抗寒基因转入胚性愈伤组织研究其功能奠定研究基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为香樟胚性愈伤组织对低温胁迫的表达模式分析。

图2为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸变化情况。

图3为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织可溶性糖变化情况。

图4为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织丙二醛变化情况。

图5为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织sod变化情况。

图6为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织cat变化情况。

图7为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织pod变化情况。

图8为香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

以实验室诱导获得的香樟胚性愈伤组织为试材，进行低温胁迫处理。

1.2方法

1.2.1低温胁迫处理

将香樟胚性愈伤组织置于4℃人工气候箱中(光照强度3000lx，光照时间16h·d^-1)，进行低温胁迫处理，以25℃(光照强度3000lx，光照时间16h·d^-1)处理作为空白对照。低温处理0、0.5、1、2、4、8、12和24h后，分别取样，每个取样点设3个生物学重复，液氮速冷后置于-80℃冰箱保存，用于荧光定量pcr。

将香樟胚性愈伤组织分别进行4℃和-4℃低温胁迫处理(方法同上)，低温处理0、2、8、12和24h后，分别取样，每个取样点设3个生物学重复，进行生理指标的测定。

1.2.2实时荧光定量pcr

利用easyspinplus植物rna快速提取试剂盒(北京艾德莱公司)提取香樟胚性愈伤组织rna，检测rna样品浓度和样品完整性，然后反转录合成cdna。以ccef1α为内参基因，cccbfa、cccbfb、cccbfc和cccbfd为目标基因，进行qrt-pcr(quantitativereal-timepcr)，每个样品设置3次重复。

1.2.3低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸含量的测定

由于酸性茚三酮可使游离于磺基水杨酸的脯氨酸发生显色反应，然后用甲苯处理可将色素萃取出来，色素的颜色可反应出脯氨酸的含量。因此，可利用改良的酸性茚三酮比色法，经标准曲线的绘制、总游离脯氨酸的提取以及总游离脯氨酸含量的测定等过程，测定4℃和-4℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸含量。

1.2.3.1标准曲线的绘制

用标准母液配置成每毫升含0(作空白)、1、2、3、4、5μg脯氨酸的溶液各2ml，分别放入试管中，然后依次向试管内加入2ml冰乙酸和2ml2.5％酸性茚三酮，摇匀，沸水浴30分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，加入3ml甲苯后震荡，使色素全部转移至甲苯溶液中，在520nm波长下测定吸光值。以脯氨酸含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2总游离脯氨酸的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织，用研钵迅速研碎后加4ml3％磺基水杨酸制成组织匀浆，然后将组织匀浆倒入具塞试管中沸水浴10分钟。

1.2.3.3总游离脯氨酸含量的测定

吸取2ml上清提取液于具塞试管中，然后分别加入2ml冰乙酸和2ml2.5％酸性茚三酮，沸水浴30分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，加入3ml甲苯后震荡，震荡分层后取3ml上清液于干净离心管中，5000rpm离心5分钟，测波长为520nm时的吸光值。每个处理重复三次，根据吸光度在标准曲线上查得总游离脯氨酸含量。

1.2.3.4总游离脯氨酸含量计算

式中：y——样品中脯氨酸含量，μg·g^-1；

c——从标准曲线查的脯氨酸含量，μg；

vr——样品稀释总体积，ml；

vs——测定时样品的体积，ml；

w——样品的质量，g。

1.2.4低温胁迫下香樟胚性愈伤组织可溶性糖含量的测定

由于糖类可被强酸脱水生成糖醛，生成的糖醛与蒽酮脱水缩合，生成蓝绿色衍生物，该物质在620nm处吸光值最大，其颜色的深浅在一定范围内与可溶性糖含量呈正比。因此，可通过测定该衍生物在620nm处吸光值，计算得出4℃和-4℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸含量，主要包括可溶性糖的提取、可溶性糖含量的测定和可溶性糖含量的计算等过程。

1.2.4.1可溶性糖的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织于研钵中，加入1ml蒸馏水充分研磨，将匀浆导入离心管中沸水浴10分钟，冷却至室温后于4000rpm离心10分钟，然后将上清液加蒸馏水稀释10倍后备用。

1.2.4.2可溶性糖含量的测定

取干净离心管分别标记为空白管、标准管和测定管，在空白管中分别加入200μl蒸馏水、100μl底物液和1ml浓硫酸，在标准管中分别加入200μl的100μg/ml标准品应用液、100μl底物液和1ml浓硫酸，在测定管中分别加入200μl的测试样品上清液、100μl底物液和1ml浓硫酸。然后将上述离心管置于100℃沸水浴中反应10分钟，流水冷却至室温后，在620nm波长下测定吸光值。

1.2.4.3可溶性糖含量的计算

式中：y——样品中可溶性糖含量，μg·g^-1；

δa1620——测定管与空白管吸光度差值；

δa2620——标准管与空白管吸光度差值；

c——标准品浓度，μg·ml^-1；

v——匀浆用蒸馏水体积，ml；

w——样品的质量，g。

1.2.5低温胁迫下香樟胚性愈伤组织丙二醛含量的测定

丙二醛可与硫代巴比妥酸(tba)发生缩合反应，进而生成红色产物，且此产物在532nm波长处达到最大吸收峰。因此，可通过测定532nm时反应产物的分光光度值，计算获得低温胁迫下香樟胚性愈伤组织，过氧化脂质降解产物丙二醛含量。

1.2.5.1丙二醛的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织于研钵中，加入0.8ml0.1mol/l磷酸缓冲液充分研磨，制成10％的组织匀浆，于5000rpm离心10分钟，取上清液备用。

1.2.5.2丙二醛含量的测定

取干净具塞试管分别标记为空白管、标准管和测定管，首先，在空白管中加入0.1ml无水乙醇和0.1ml试剂一应用液，在标准管中加入0.1ml的10nmol/ml标准品和0.1ml试剂一应用液，在测定管中分别加入0.1ml测试样品上清液和0.1ml试剂一应用液。混匀后在每个试管中分别加入3ml试剂二应用液和1ml试剂三应用液。然后，95℃水浴40分钟，流水冷却后于4000rpm离心10分钟。用移液枪吸取上清液至比色皿中，测定532nm处吸光度值。

试剂一到试剂三为南京建成丙二醛测试盒对应试剂一到三。

每个待测样品做三次重复。

1.2.5.2丙二醛含量的计算

式中：y——样品中丙二醛含量，nmol·g^-1；

δa1532——测定管与空白管吸光度差值；

δa2532——标准管与空白管吸光度差值；

c——标准品浓度，nmol·ml^-1；

v——匀浆用磷酸缓冲液体积，ml；

w——样品的质量，g。

1.2.6低温胁迫下香樟胚性愈伤组织sod活力的测定

采用黄嘌呤氧化酶法，利用总超氧化物歧化酶测试盒，测定香樟胚性愈伤组织在4℃和-4℃低温胁迫下，超氧化物歧化酶活力，包括超氧化物歧化酶sod的提取、最佳取样量的确定以及超氧化物歧化酶sod活力的测定等过程。

1.2.6.1超氧化物歧化酶sod的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织于研钵中，加入0.4ml0.1mol/l磷酸缓冲液，冰水浴条件下制成20％的组织匀浆液，于4000rpm离心10分钟，取上清液备用。

1.2.6.2最佳取样量的确定

取6只干净的离心管分别标记为对照管和测定管，具体操作如表1所示，充分混匀后，置于37℃恒温水浴锅内反应40分钟。然后，每只试管中各加2ml显色剂，室温放置10分钟后，于550nm波长处测定吸光值。

试剂一到试剂四为南京建成总超氧化物歧化酶测试盒对应试剂一到四。

表1试验操作表

1.2.6.3超氧化物歧化酶sod活力的测定

根据筛选获得的最佳取样量，进行香樟胚性愈伤组织，超氧化物歧化酶sod活力的测定，具体操作流程同上。

1.2.6.4超氧化物歧化酶sod活力的计算

式中：y——样品中sod活力，u·g^-1；

δa550——对照管与测定管吸光度差值；

od550——对照管吸光度值；

c——匀浆液浓度，g·ml^-1；

vr——反应液总体积，ml；

vs——取样量，ml。

1.2.7低温胁迫下香樟胚性愈伤组织cat活力的测定

过氧化氢酶分解过氧化氢的反应过程，可通过钼酸铵的加入而迅速停止，剩余的过氧化氢与钼酸铵反应，生成一种淡黄色络合物，可通过在405nm处测定其变化值，从而计算获得香樟胚性愈伤组织在4℃和-4℃低温胁迫下过氧化氢酶活力。

1.2.7.1过氧化氢酶cat的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织于研钵中，加入0.9ml生理盐水，冰水浴条件下制成10％的组织匀浆液，于2500rpm离心10分钟，取上清液备用。

1.2.7.2最佳取样浓度的探索

将10％的组织匀浆液用生理盐水，分别稀释至浓度为5％、2％、1％、0.5％、0.25％和0.125％的组织液，进行最佳取样浓度探索，具体如下：在对照管中加入0.05ml双蒸水、1.0ml试剂一以及0.1ml试剂二；在各测定管中分别加0.05ml上述不同浓度的香樟胚性愈伤组织匀浆，以及1.0ml试剂一和0.1ml试剂二。充分混匀后于37℃条件下准确反应60秒，然后，在各试管中分别加1.0ml试剂三和0.1ml试剂四，充分混匀后于550nm波长处测定吸光值。

试剂一到试剂四为南京建成过氧化氢酶测试盒对应试剂一到四。

1.2.7.3过氧化氢酶cat活力的测定

根据筛选获得的最佳取样浓度，进行香樟胚性愈伤组织，过氧化氢酶cat活力的测定，具体操作方法同上。

1.2.7.4过氧化氢酶cat活力的计算

式中：y——样品中cat活力，u·g^-1；

δa405——对照管与测定管吸光度差值；

v——匀浆用生理盐水体积，ml；

w——样品的质量，g。

1.2.8低温胁迫下香樟胚性愈伤组织pod活力的测定

过氧化物酶可将愈创木酚氧化为醌类化合物，该化合物在470nm波长处吸光值达到最大，因此可利用愈创木酚法通过测定470nm波长下分光光度值的变化，从而计算出香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下pod的活力。

1.2.8.1过氧化物酶pod的提取

准确称取0.1g香樟胚性愈伤组织于研钵中，加入3ml的0.1mol/l磷酸缓冲液充分研磨，然后于8000rpm离心15分钟，上清液即为过氧化物酶pod的提取液。

1.2.8.2过氧化物酶pod活力的测定

在比色皿中依次加入1ml的0.3％愈创木酚溶液、0.8ml的磷酸缓冲液和2ml的0.1mol/l过氧化氢溶液，然后加入200μl的pod提取液，立即用秒表计时，并于470nm波长下测定吸光值，一分钟之后再次进行测定。

1.2.8.3过氧化物酶pod活力的计算

式中：y——样品中过氧化物酶活性，u·g^-1；

δa470——反应液在470nm波长处吸光度值的增加值；

n——酶液稀释倍数；

t——反应时间，min；

w——样品的质量，g。

1.2.9统计分析

利用excel2010和ibmspssstatistics22进行数据分析，用lsd法进行显著性分析。

2结果与分析

2.1香樟胚性愈伤组织对低温胁迫的表达模式分析

图1为香樟胚性愈伤组织对低温胁迫的表达模式分析。其中，“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

为探究香樟胚性愈伤组织能否在分子水平上感知低温胁迫，并筛选获得香樟胚性愈伤组织感受4℃低温胁迫最强烈的时刻，采用qrt-pcr技术分析4个cccbf基因在4℃低温胁迫下的表达情况，结果如图1所示：未胁迫处理(0h)时，cccbfs的相对表达量均处于相对较低水平，低温胁迫处理0.5h时其相对表达量均有所上升，胁迫处理1h时其相对表达量均显著高于对照(0h)，分析原因可能是，香樟胚性愈伤组织对4℃胁迫较敏感，短时间内即可完成cbf基因的上调表达。

随着胁迫时长的增加，cccbfs的相对表达量均大致呈先上升后下降的趋势，4℃低温胁迫处理24h时其相对表达量极显著增加达到峰值，此刻为香樟胚性愈伤组织感受低温最强烈的时刻。表达分析结果表明，香樟胚性愈伤组织不仅能在分子水平上感知低温胁迫，且对低温胁迫响应较为迅速，在4℃低温胁迫24h时香樟胚性愈伤组织在分子水平上响应低温胁迫最剧烈。

2.2低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸和可溶性糖含量分析

脯氨酸和可溶性糖作为重要的有机渗透调节物质，其含量的变化可反映植物感知低温胁迫的能力。未胁迫处理时(0h)脯氨酸含量约为0.7mg·g^-1，胁迫2h时脯氨酸含量即有所上升，胁迫处理8h时脯氨酸含量显著增加达到峰值，随后脯氨酸的含量有所下降。此外，对比4℃和-4℃低温胁迫下脯氨酸含量可知，-4℃低温胁迫下脯氨酸含量整体高于4℃低温胁迫下脯氨酸含量。结果表明，香樟胚性愈伤组织可感知并响应低温胁迫，低温条件下香樟胚性愈伤组织体内脯氨酸含量快速上升，并于胁迫8h时积累量达到峰值。

图2为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织脯氨酸变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

未胁迫处理时可溶性糖的含量较少约为8mg·g^-1，低温胁迫2h时其含量极显著增加达到峰值，-4℃胁迫下可溶性糖含量上调至80mg·g^-1以上，约为对照的10倍以上；4℃胁迫下可溶性糖含量也增加至37mg·g^-1，随着胁迫时间的延长，可溶性糖含量有所下降。结果表明，香樟胚性愈伤组织内可溶性糖于胁迫2h后积累量达到峰值。

图3为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织可溶性糖变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

2.3低温胁迫下香樟胚性愈伤组织丙二醛含量分析

mda作为膜脂过氧化产物，可抑制保护酶活性，其含量的积累可反映植物所受逆境程度。未胁迫处理时mda含量约为9.5nmol·g^-1，4℃低温胁迫处理12h其含量下降达到低峰约为3nmol·g^-1，表明此时香樟胚性愈伤组织能够应对低温胁迫，消除一部分丙二醛。-4℃低温胁迫下，mda含量达到低峰的时间较早(2h)约为7nmol·g^-1，随后其含量快速上升，在胁迫处理24h时其含量显著增加至10nmol·g^-1。

图4为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织丙二醛变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

结果表明，香樟胚性愈伤组织感知并应对低温胁迫，通过清除过氧化产物mda，缓解低温的伤害，4℃下胚性愈伤组织于12h对mda清除效果最显著，而-4℃下于2h清除能力最强。

2.4低温胁迫下香樟胚性愈伤组织sod、cat和pod活力分析

sod、cat和pod作为植物体保护酶系统的重要组成部分，其活力的变化可反映机体的调控能力。4℃低温胁迫下，sod活力在胁迫8h时显著增加达到峰值，随后呈下降的变化趋势；-4℃胁迫处理前期，sod活力显著下降。结果表明4℃下，sod可对香樟胚性愈伤组织起调控作用，并于8h调控能力最强，但当温度下降为-4℃时，低温逆境超出sod调控范围。

图5为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织sod变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

未胁迫时香樟胚性愈伤组织cat活力较低，低温胁迫2h时其活力显著升高，4℃低温处理12h其活力到达峰值，约为对照(0h)的20倍，-4℃下于胁迫8h时出现峰值，其活力约为对照的7倍。且在两种低温胁迫处理过程中cat活力均显著高于对照。结果表明，cat在香樟胚性愈伤组织应对低温胁迫时，可迅速且持续的发挥调控作用，4℃胁迫12h时cat调控能力最强，-4℃胁迫8h其调控能力最强。

图6为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织cat变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

pod活力在不同低温胁迫的变化趋势不同，4℃下呈先降后升的趋势，而-4℃下其活力呈先升后降的趋势，且于胁迫2h时显著升高。因此推测，香樟胚性愈伤组织pod可能对4℃低温胁迫不敏感，4℃下pod未参与香樟胚性愈伤组织的调控，当温度降至-4℃时，pod可迅速感知并参与机体对外界低温的综合调控。

图7为低温胁迫下香樟胚性愈伤组织pod变化情况。“*”表示与0h相比差异显著(p<0.05)；“**”表示与0h相比差异极显著(p<0.01)。

综合分析酶活性可知，香樟胚性愈伤组织在应对低温胁迫时，其保护酶响应低温胁迫的能力不完全相同。cat可迅速且持续的响应低温胁迫，sod可感知4℃低温，而pod可迅速应对-4℃胁迫。

2.54℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织生理指标综合分析

综合分析4℃低温胁迫下脯氨酸、可溶性糖、mda、sod、cat和pod含量变化可知，香樟胚性愈伤组织在应对4℃低温胁迫时，脯氨酸、可溶性糖、sod和cat的综合调控起主导作用，且可溶性糖对低温的调控作用较迅速，cat对低温的调控作用较持久。

表24℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织生理指标变化情况

2.6-4℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织生理指标综合分析

综合分析-4℃低温胁迫下各有机成分的含量变化情况可知，在-4℃低温胁迫下，香樟胚性愈伤组织可快速响应低温胁迫，并通过有机渗透调节物质可溶性糖以及保护酶cat和pod的快速积累，以提高细胞液的浓度，增强清除过氧化物能力，从而降低活性氧的伤害，维持细胞膜在低温下的正常功能。

表3-4℃低温胁迫下香樟胚性愈伤组织生理指标变化情况

3结论

本发明建立的香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系图如8所示。

图8为香樟胚性愈伤组织抗寒性鉴定体系。

脯氨酸、可溶性糖、mda、sod、cat和pod，可如实反映香樟胚性愈伤组织在低温胁迫下的变化趋势，因此可用于鉴定不同抗寒能力的香樟胚性愈伤组织抗寒性；4℃低温胁迫时，有3个重要时刻，分别为2h、8h、和12h，可通过测定胁迫处理后2h时的可溶性糖含量，8h时的脯氨酸含量以及sod活力，12h时的mda含量和cat活力；-4℃低温胁迫时，有2个重要时刻，分别为2h和8h，可通过测定处理后2h时可溶性糖和mda含量以及pod活力，8h时的脯氨酸含量以及cat活力，综合分析上述生理、生化指标，以脯氨酸和可溶性糖含量高、sod、cat和pod活力强，而mda含量低为鉴定指标，从而筛选不同抗寒性香樟胚性愈伤组织(细胞系)，用于下一步的抗寒育种目标。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。