一种快速测定保健食品中乳铁蛋白含量的方法与流程

本发明属于乳品检测技术领域，具体涉及一种快速测定保健食品中乳铁蛋白含量的方法。

背景技术：

乳铁蛋白是一种与铁的转运和存储有关的蛋白质，属于乳转铁蛋白家族。乳铁蛋白是一种分子量为70～80kda的非血红素铁结合糖蛋白，等电点为7.8，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内外分泌液和嗜中性粒细胞)。乳铁蛋白在人类初乳中含量最高，可达6g/l，在常乳中浓度为1～2g/l，牛乳中的含量比人乳中少得多，泌乳中期的含量仅为0.7g/l。乳铁蛋白属于先天免疫系统成分，除了能够结合和运输铁离子的主要功能外，还具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、阻断氧自由基、免疫调节及抗炎症、促进细胞增长、减少内脏脂肪等多种功能。此外，由于乳铁蛋白是一种可被婴儿摄入并且安全性很高的天然乳成分，因此深受国内外食品相关企业的高度重视，在我国《gb14880食品营养强化剂使用标准》中被列为一种新型营养强化剂并规定了其在相关保健食品中的含量标准。因此，建立快速准确的乳铁蛋白含量检测方法对于食品的安全有效性是至关重要的。

乳铁蛋白含量的检测方法主要有：紫外分光光度法、酶联免疫吸附法、高效亲和色谱法以及表面等离子共振技术法等，其中紫外分光光度法虽然快速简便但是抗干扰能力差、准确度不高并且检测结果容易受到外界因素的影响，因此不适用于调制乳粉、婴儿配方乳粉、保健食品中乳铁蛋白的含量测定；酶联免疫吸附法在测定样品前处理繁琐复杂，且该法所用试剂盒较为昂贵，重现性不好；高效亲和色谱法因设备昂贵，大多数工厂的实验室均不配备，也不适合工厂的在线检测；表面等离子共振技术所需spr仪器价格昂贵、检测结果易受外界及样品组分影响。基于以上因素，目前逐渐开始采用高效液相色谱法对乳铁蛋白的含量进行测定。

例如程静等人对反相高效液相色谱法检测牛初乳乳铁蛋白的方法进行研究，首先通过离心、离子交换层析富集牛初乳中的乳铁蛋白，然后再测定含量，并对色谱条件进行了优化，但是该种方法对样品的前处理操作步骤繁琐，在工业化生产时会花费大量的时间和人力。中国专利文献cn104634910a公开了一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法，该方法包括对待测乳制品进行预处理后再进行高效液相色谱分析检测的过程，其中所述预处理的过程包括：将待测乳制品调配成质量浓度为0.5～5％的溶液作为待测样品溶液，离心，离心后除去上浮的脂肪，然后将除去脂肪的样品溶液的ph值调节到乳铁蛋白的等电点使样品中的乳铁蛋白沉淀，离心后弃去上清液，将乳铁蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，进行高效液相色谱分析检测，该方法简化了传统的样品预处理的步骤，但是需要做标准曲线，测试步骤复杂。

因此，需要一种样品前处理简单易操作、检测快速、成本低、检测准确及重现性好的快速测定保健食品中乳铁蛋白含量的方法。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术存在的不足，提供一种快速测定保健食品中乳铁蛋白含量的方法，该方法具有样品前处理简单易操作、检测快速、成本低、检测准确及重现性好的优点，适用于保健食品中乳铁蛋白含量的快速检测。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种快速测定保健食品中乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：

s1、精密称取乳铁蛋白对照品用一级水溶解并稀释至刻度，配成浓度为2mg/ml的溶液，摇匀，过滤备用；

s2、将所述步骤s1中的溶液用一级水稀释为浓度为0、0.2、0.5、1、2mg/ml的标准系列溶液，摇匀，过滤备用；

s3、将待测品采用一级水溶解，配制成浓度为4～8mg/ml的待测液，摇匀，过滤备用；

s4、分别将所述步骤s2中的浓度为0、0.2、0.5、1和2mg/ml标准系列溶液与所述步骤s3中的待测液注入高效液相色谱仪，采用流动相进行洗脱，使待测液主峰的保留时间与标准溶液主峰的保留时间相一致，采用外标法计算待测液中乳铁蛋白含量。

进一步地，所述步骤s3中待测液的浓度为6mg/ml。

进一步地，所述步骤s4高效液相色谱仪的检测波长为270～290nm，流速0.8～1.2ml/min，柱温为30～40℃。

进一步地，所述步骤s4中采用流动相进行洗脱的洗脱方式为梯度洗脱。

进一步地，所述步骤s4中流动相为一级水、乙腈和1％的三氟乙酸溶液。

更进一步地，所述高效液相色谱仪的检测波长为280nm，流速为1ml/min，柱温为35℃。

进一步地，所述步骤s4中标准系列溶液和待测液的注入量为10μl。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法解决了复杂乳制品体系中乳铁蛋白的快速提取和准确定量分析的问题，与目前常用的方法相比，具有专一性和可重复性，去除了其它干扰物质及环境变化的影响，从而降低了检测费用、提高了准确度并简化了乳铁蛋白的检测方法。

(2)本发明方法采用反相高效液相色谱法精确测量保健食品中的乳铁蛋白的含量，样品的前处理简单易操作，测定结果准确可靠，快速方便，精密度高，实验再现性良好，操作简便、检验成本低，适用于保健食品中乳铁蛋白含量的快速检测。

附图说明

图1为采用实施例2方法测定的乳铁蛋白对照品的高效液相色谱图；

图2为采用实施例2方法测定的培安滋粉的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、本发明快速测定保健食品中乳铁蛋白的方法

本发明实施例1快速测定保健食品中乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：

s1、精密称取乳铁蛋白对照品用一级水溶解并稀释至刻度，配成浓度为2mg/ml的溶液，摇匀，过滤备用；

s2、将所述步骤s1中的溶液用一级水稀释为浓度为0、0.2、0.5、1、2mg/ml的标准系列溶液，摇匀，过滤备用；

s3、将待测品采用一级水溶解，配制成浓度为4mg/ml的待测液，摇匀，过滤备用；

s4、分别将所述步骤s2中的浓度为0、0.2、0.5、1和2mg/ml标准系列溶液与所述步骤s3中的待测液注入高效液相色谱仪，注入量为10μl，检测波长为270nm，流速为0.8ml/min，柱温为30℃，采用流动相进行梯度洗脱，洗脱溶剂如表1所示，使待测液主峰的保留时间与标准溶液主峰的保留时间相一致，采用外标法计算待测液中乳铁蛋白含量，计算公式如下所示：

x-待测品中乳铁蛋白的含量，单位为克每一百克；

a1-待测品中乳铁蛋白对应峰面积；

a2-标准品中乳铁蛋白对应峰面积；

c1—标准溶液的浓度，单位为毫克每毫升；

v-待测品定容体积，单位为毫升；

m-待测品的质量，单位为克。

表1高效液相色谱梯度洗脱表

实施例2、本发明快速测定保健食品中乳铁蛋白的方法

s1、精密称取乳铁蛋白对照品用一级水溶解并稀释至刻度，配成浓度为2mg/ml的溶液，摇匀，过滤备用；

s2、将所述步骤s1中的溶液用一级水稀释为浓度为0、0.2、0.5、1、2mg/ml的标准系列溶液，摇匀，过滤备用；

s3、将待测品采用一级水溶解，配制成浓度为6mg/ml的待测液，摇匀，过滤备用；

s4、分别将所述步骤s2中的浓度为0、0.2、0.5、1和2mg/ml标准系列溶液与所述步骤s3中的待测液注入高效液相色谱仪，注入量为10μl，检测波长为280nm，流速为1ml/min，柱温为35℃，采用流动相进行梯度洗脱，洗脱溶剂参照实施例1，使待测液主峰的保留时间与标准溶液主峰的保留时间相一致，采用外标法计算待测液中乳铁蛋白含量，计算公式参照实施例1。

实施例3、本发明快速测定保健食品中乳铁蛋白的方法

s1、精密称取乳铁蛋白对照品用一级水溶解并稀释至刻度，配成浓度为2mg/ml的溶液，摇匀，过滤备用；

s2、将所述步骤s1中的溶液用一级水稀释为浓度为0、0.2、0.5、1、2mg/ml的标准系列溶液，摇匀，过滤备用；

s3、将待测品采用一级水溶解，配制成浓度为8mg/ml的待测液，摇匀，过滤备用；

s4、分别将所述步骤s2中的浓度为0、0.2、0.5、1和2mg/ml标准系列溶液与所述步骤s3中的待测液注入高效液相色谱仪，注入量为10μl，检测波长为290nm，流速为1.2ml/min，柱温为40℃，采用流动相进行梯度洗脱，洗脱溶剂参考实施例1，使待测液主峰的保留时间与标准溶液主峰的保留时间相一致，采用外标法计算待测液中乳铁蛋白含量，计算公式参考实施例1。

对比例1

申请号为201210030215.9公开的一种乳制品中乳铁蛋白含量的测定方法。

对比例2

申请号为201310567858.1公开的一种检测乳制品中乳铁蛋白的方法。

试验例、保健食品中乳铁蛋白的含量测定

选用市面上同一批加工而成的培安滋粉(生产的培安滋粉食品中乳铁蛋白的含量为75mg/g)、诗幼乐幼儿配方奶粉(3段，乳铁蛋白的含量为0.5mg/g)和新西特婴幼儿调制乳粉(乳铁蛋白的含量为1mg/g)作为试验对象，采用实施例1～3和对比例1～2的方法进行乳铁蛋白含量的检测，检测结果如下表1所示：

表1保健食品中乳铁蛋白的含量测定结果

由上表1可知，本发明实施例1～3的方法在检测保健食品中乳铁蛋白含量时，准确率高，其中以实施例2的效果最好，为本发明的最佳实施例；与实施例2相比，对比例1和对比例2方法在检测保健食品中乳铁蛋白含量的过程中，准确率明显下降，说明本发明方法测定结果准确可靠，精密度高，实验再现性良好，适用于保健食品中乳铁蛋白含量的快速检测.

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。