一种评价复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量的采样点优化方法与流程

本发明属于药代动力学领域，涉及用于评价复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量的采样点优化方法，所述方法的核心在于以复方丹参滴丸有效组分丹参素、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1在大鼠体内的auc和cmax与组分在不同时间点血药浓度的相关性作为评价指标，对取样点时间进行优化选择，获得较少的关键采样点用于后期复方药物的药动学评价过程。该方法用于对复方丹参滴丸在大鼠体内的药代评价时，减少采样点，在预测其体内有效成分的auc和cmax时可以减少实验周期和费用。
背景技术：
：复方丹参滴丸是由丹参、三七、冰片制备而成的现代化中药，药理作用为活血化瘀，理气止痛。常用于气滞血瘀所致的胸痹、冠心病、心绞痛等。复方丹参滴丸的药代动力学研究报道主要集中在对丹参素、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1等有效组分在人或动物体内药代动力学参数的测定，通过建立不同的测定方法和药代动力学模型，测定相关药代动力学参数，进而研究其在体内的代谢情况。而研究的重点主要集中在测定方法的构建和优化，从而提高其分离检测的灵敏度，从多角度研究其体内代谢情况。为提高研究的准确性，得到复方丹参滴丸在个体中动态变化的详细数据，往往需要密集采集血样或尿样以获得更多的数据，通常进行全程采样，即样本数据涵盖吸收、分布、代谢和排泄的全过程，通常11～14个血样点。例如洪馨等(复方丹参滴丸中丹参素的药物动力学研究.中药新药与临床药理,2000,11(5),286-288)使用雄性sd大鼠70只，随机分成14组，每组5只，各组大鼠按0.3ml/kg剂量灌服667g/l的复方丹参滴丸溶液，采集大鼠灌服后0.083、0.167、0.25、0.50、0.75、1、1.5、2、2.5、4、6、8、10h的血样，用hplc-uv法测定大鼠血清中丹参素的浓度，结果表明，大鼠灌服复方丹参滴丸后丹参素在大鼠体内的药物动力学过程可用开放的二室模型来描述，丹参素在胃肠道能迅速吸收(ka＝4.956h-1)，血药浓度在0.5h即达峰值，t1/2(α)为0.199h,t1/2(ab)为0.140h，说明丹参素在大鼠体内吸收快，分布也快,药物起效迅速，血浆中丹参素的消除速率常数β为0.211h-1,t1/2(β)为3.28h，说明丹参素在体内主要以消除过程为主，属慢消除过程；天士力的课题组(studyofthedeterminationandpharmacokineticsofcompounddanshendrippingpillsinhumanserumbycolumnswitchingliquidchromatographyelectrosprayiontrapmassspectrometry.journalofchromatographyb,809(2004)237–242)建立了液质联用(lc-ms/ms)方法同时测定口服丹参滴丸后大鼠血浆中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、三七皂苷r1、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1六种组分的浓度的方法，每个受试个体分别采集服用前及服用后5，15,30min,1,1.5,2,3,5,8,12,24及48h时间点的血样，并对其在血浆中浓度变化情况进行了研究，其结果(如下表)显示了六种组分不同的药代动力学过程表1该课题组(simultaneousdeterminationandpharmacokineticsofdanshensu，protocatechuicaldehyde，4-hydroxy-3-methyloxyphenyllacticacidandprotocatechuicacidinhumanplasmabylc-ms/msafteroraladministrationofcompounddanshendrippingpills.journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis,2017,145:860-864)后又建立了液质联用(lc-ms/ms)方法同时测定口服丹参滴丸后人血浆中丹参素、原儿茶醛、4-羟基-3-甲基氧苯基乳酸、原儿茶酸四种组分的浓度，每个受试个体分别采集服用前及服用后0.083，0.17,0.33,0.67,1,1.5,2,3,4,6,8，12and24h时间点的血样，并对其药代动力学参数进行了测定，所述方法显示出良好的精密度，四种组分均是研究人体内复方丹参滴丸药代动力学的良好标记组分；张伯礼课题组(plasmaandurinarytanshinolfromsalviamiltiorrhiza(danshen)canbeusedaspharmacokineticmarkersforcardiotonicpills,acardiovascularherbalmedicine.drugmetabolismanddisposition,2008,36(8):1578-1586)通过超高效液相色谱和质谱联用分别测定了狗、大鼠、人血浆和尿中丹参素的含量，每个受试个体均采集服用后的九个时间点的数据，分别获取了其药代动力学参数，在研究人口服复方丹参滴丸后的药代动力学行为实验中，分别测定了男女口服或舌下含服条件下的药代动力学参数，结果显示吞服情况下女性血清中cmax值和auc0-6h都明显高于男性，而当剂量调整为按体重给药时，这种差异就不再明显。尿样检测数据则显示女性fe和cum.ae都明显高于男性，clr则没有明显性别差异。目前已有的中药药动学研究主要是定量地描述中药中有效成分、有效部位、单味药或复方以不同剂型形式或通过各种给药途径进入机体后的体内变化规律。而其变化规律是通过各种药动学参数进行描述的，其中auc(血药浓度-时间曲线下面积)和cmax(药物浓度峰值)是药物在体内暴露程度的最为直接的参数。以往的auc测定必须要采集患者的服用药物间隔周围多个时间点的血液样本，通常在9个时间点以上，临床试验成本相对比较高，还给患者带来巨大痛苦以及生活不便，难以在临床当中广泛应用。20世纪80年代，d’argenio、endrenyi等人将非线性的计算方法应用到药代动力学研究中。药代动力学的实验设计随之发展，采样优化方法就是其中之一。模拟试验研究表明，采样点的个数以及采样的时间点选择对药代动力学及药效动力学参数计算及结果影响很大，因此在药代、药效动力学研究中如何设计采样点非常重要。为了在减少采样点的同时保证参数估算的准确性，采样优化的方法被应用到临床药代、药效动力学研究中。采样优化的主旨是选择对参数影响最大的采样点。根据相关实践研究表明，研究者提出了lss(有限采样法)的概念，即通过相对比较少的血药浓度点对auc值进行估算。这种方法是在以往药动学研究完整血样采集的前提之下，利用多元线性回归建立含有2～4个采血点的模型方程，其相关性可以满足临床监测的需求。李燕等(临床药代动力学和药效动力学研究中的采样优化方法.定量药理学,2012，17(9),1014-1021)汇总了采样优化方法的特点以及2009年以后发表的典型的采样优化的例子。采样优化的方法主要应用于他克莫司、麦考酚酸、抗肿瘤药的治疗药物监测等药代动力学试验中。此类研究的特点是药代动力学参数非常重要，而密集采样却很难执行。比如，治疗药物监测中因为药物的治疗窗窄，需要用个体药代动力学参数调节给药剂量，而密集的采样会给患者带来痛苦、降低依从性、提高成本。采样优化可以有效解决这种问题。目前国内最常用的方法是多元线性回归法，应用于盐酸二甲双胍、氨氯地平、头孢克洛等药物的药代动力学研究中。多元线性回归法是利用多元线性回归寻找auc、cmax、effect等药动、药效学目标参数与血药浓度的相关性。首先用传统的密集采样方式对一部分患者进行动力学分析并计算其目标参数，通常每个患者需要8～12个点。用所有备选时间点排列出所有1～4个点的组合，将其对应的血药浓度/药效作为自变量，药动/药效学参数作为因变量进行多元线性回归，其中预测能力最好的组合就是最佳的采样方案。回归方程如式(以药动学为例)其中药动学目标参数指auc、cmax等参数，主要用来反映药物暴露量，一般选择与临床疗效和毒副反应最相关的指标。c(tj)是j时刻的血药浓度，a和b是回归方程的参数。一旦确定最佳时间组合与回归方程式，此后的患者只要知道最佳时间组合对应的血药浓度就可以预测其药代动力学参数。其主要分为如下四个部分：(1)获得先验信息：多元线性回归法不需要知道群体药动/药效学模型和参数的信息，只需要知道已证明与药物暴露量相关的药动/药效参数，如auc或cmax等，因此其先验信息通常由非房室模型获得。(2)计算参比值：参比值一般是较为准确的个体药动/药效学参数，以此为基准来评价优化采样点的准确度与精密度。假如所关心的药代参数是auc，则用梯形法来计算，cmax则用实验获得的血药浓度最大值。(3)优化采样点：多元线性回归法将药动/药效学参数(如auc)作为因变量，各采样时间点对应的血药浓度作为自变量进行多元线性回归。回归的方式主要有两种，一是最优子集回归，分析所有可能的采样组合的预测能力，选择预测能力最优的采样组合；二是逐步回归，用偏相关系数的统计显著性作为纳入剔除标准的一种回归方式。两种方法均可用统计软件自动完成。多元线性回归法无需知道房室模型的信息，但是其缺点是只能预测与建立方程相同给药方案和相同采样点的情况。如果其中一个时间点的血药浓度未能获得，则公式和其他时间点的数据就不能用。多元线性回归法的另一个缺点是需要药代动力学参数与血药浓度呈线性关系，若cl是目标参数就需要对参数或对血药浓度取自然对数。(4)预测能力评价与验证：通常以比较通过优化的采样点得到的个体参数预测值和参比值的差异来评价采样优化样本在进行药动/药效学计算时的预测能力和可接受性。预测能力的评价指标有r2、预测误差(predictionerror,pe)、绝对误差(absoluteerror,ae)、平均预测误差(meanpredictionerror,mpe)、平均绝对误差(meanabsoluteerror,mae)、均方根误差(rootmeansquarederror,rmse)、对应平均方差(scaledmeansquarederror,smse)、平均相对预测误差(meanrelativepredictionerror,mrpe)、相对标准误差(relativestandarderror，rse)、平均相对偏差(meanrelativebias)。复方丹参滴丸为复方中药，组分复杂，传统临床药动学的研究方法受限。同时传统的有限采样法多用于单组分的采样点的筛选，中药多组分使用有限采样法进行采样点优化的研究目前鲜有报道，因此为避免传统药动学研究中集中采样的弊端，且实现多组分的同时评价，本发明的目的是提供一种用于评价复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量的采样点的优化方法。本发明的特点在于：(1)通过该优化方法筛选出的三个采样点就可预测pk参数；(2)筛选出的采样点可用于同时预测三种组分的药代参数。技术实现要素：本发明提供一种用于评价复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量的采样点的优化方法，所述方法的核心在于以复方丹参滴丸有效组分丹参素、人参皂苷rb1、人参皂苷rg1在大鼠体内的auc和cmax与组分在不同时间点血药浓度的相关性作为评价指标，对取样点时间进行优化选择，获得较少的关键采样点用于后期复方药物的药动学评价过程。本发明应用多元线性回归拟合获得复方丹参滴丸有效成分auc和cmax参数与不同时间点血药浓度测定值之间的关系，通过最优子集的方法筛选满足三个成分药代参数拟合结果r2均大于0.9的时间点组合。借助本发明所建立的采样方案及预测方法，可以在后期进行复方丹参滴丸在大鼠体内的药代评价时，采集确定时间点的血样，预测体内有效成分的auc和cmax。为此，本发明提供一种评价复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量的采样点的优化方法，该方法通过收集大鼠复方丹参滴丸给药后在不同时间点的血药浓度数据进行采样点优化，以获得优选的采样点，所述方法，步骤如下：1)药物经时浓度测定：受试大鼠给予复方丹参滴丸，于给药前及给药后进行采血，每只大鼠采血点11-14个，测定血浆中丹参素、人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的经时浓度；2)先验信息获得及参比值计算：应用das2.0软件，以非房室模型法求算每只大鼠服用复方丹参滴丸后体内组分的药代动力学参数；3)随机采样点组合：采样点11-14个，用excel罗列所有1-3个采样点的组合；4)药物组分pk参数预测模型的构建，包括如下步骤：a)逐步筛选自变量组合，b)模型整体评价指标，c)模型的预测检验。所述的方法，其特征在于，所述药物组分pk参数预测模型的构建，包括：auc或cmax的参数预测。所述的方法，其特征在于，所述步骤a)，应用spss分析软件分别进行丹参素pk参数与各时间点组合血药浓度的多元线性回归，建立一组回归方程为：parameterjk＝constantjk+m1jkc1jk+……+mijkcijk(i≤3)，获得不同时间点组合拟合的r2，筛选出丹参素pk参数拟合r2同时大于0.9的组合，后再进行人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的相应参数拟合，筛选出三种组分pk参数的拟合r2同时大于0.9的组合。所述的方法，其特征在于，所述步骤b)，用筛选出的时间点组合进行所有组分的pk参数预测，确认其拟合的r2。所述的方法，其特征在于，所述步骤c)，应用所建模型对受试大鼠进行复方丹参滴丸给药后pk参数进行预测，将所得预测值与对应个体参比值做相关性散点图。优选的：本发明所述方法，步骤如下：1)药物经时浓度测定：受试大鼠不少于12只，随机分为两组分别单次给予低、高剂量的复方丹参滴丸，于给药前及给药后进行采血，采血点11-14个，测定血浆中丹参素、人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的经时浓度，2)先验信息获得及参比值计算：应用das2.0软件，以非房室模型法求算每只大鼠服用复方丹参滴丸后体内组分的药代动力学参数auc和cmax，3)随机采样点组合：采样点11-14个，用excel罗列所有1-3个采样点的组合，4)auc或cmax预测模型的构建，包括如下步骤：a)逐步筛选自变量组合：应用spss分析软件分别进行丹参素pk参数与各时间点组合血药浓度的多元线性回归，建立一组回归方程为：parameterjk＝constantjk+m1jkc1jk+……+mijkcijk(i≤3)，获得不同时间点组合拟合的r2，筛选出丹参素pk参数拟合r2同时大于0.9的组合，后再进行人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的相应参数拟合，筛选出三种组分pk参数的拟合r2同时大于0.9的组合，b)模型整体评价指标：用经筛选出的时间点组合进行三种组分的cmax和auc预测，确认其拟合的r2，c)模型的预测检验：应用所建模型对受试大鼠复方丹参滴丸给药后cmax和auc进行预测，将所得预测值与对应个体参比值做相关性散点图。进一步优选的：本发明所述方法，步骤如下：1)药物经时浓度测定：受试大鼠16-20只，随机分为两组分别单次给予低(1000mg/kg)、高剂量(1500mg/kg)的复方丹参滴丸，分别于给药前及给药后进行采血，采血点11-14个，测定血浆中丹参素、人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的经时浓度，2)先验信息获得及参比值计算：应用das2.0软件，以非房室模型法求算每只大鼠服用复方丹参滴丸后体内组分的药代动力学参数auc和cmax，3)随机采样点组合：采样点11-14个，用excel罗列所有3个采样点的组合，4)auc或cmax预测模型的构建，包括如下步骤：a)逐步筛选自变量组合：应用spss分析软件分别进行丹参素pk参数与各时间点组合血药浓度的多元线性回归，建立一组回归方程为：parameterjk＝constantjk+m1jkc1jk+……+mijkcijk(i≤3)，获得不同时间点组合拟合的r2，筛选出丹参素pk参数拟合r2同时大于0.9的组合，后再进行人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的相应参数拟合，筛选出三种组分pk参数的拟合r2同时大于0.9的组合，b)模型整体评价指标：用经筛选出的时间点组合进行三种组分的cmax和auc预测，确认其拟合的r2，c)模型的预测检验：应用所建模型对受试大鼠复方丹参滴丸给药后cmax和auc进行预测，将所得预测值与对应个体参比值做相关性散点图。最优选的：本发明所述方法，步骤如下：1)药物经时浓度测定：受试大鼠18只，随机分为两组分别单次给予低(1000mg/kg)、高剂量(1500mg/kg)的复方丹参滴丸，分别于给药前及给药后0.083h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h共14个采血时间点进行血浆样本采集，测定血浆中丹参素、人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的经时浓度，2)先验信息获得及参比值计算：应用das2.0软件，以非房室模型法求算每只大鼠服用复方丹参滴丸后丹参素、人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的药代动力学参数auc和cmax，3)随机采样点组合：上述采样点共计14个，用excel罗列所有3个采样点的组合，4)auc或cmax预测模型的构建，包括如下步骤：a)逐步筛选自变量组合：应用spss分析软件分别进行丹参素cmax和auc与各时间点组合血药浓度的多元线性回归，建立一组回归方程为：parameterjk＝constantjk+m1jkc1jk+……+mijkcijk(i≤3)，获得拟合r2，筛选出丹参素cmax与auc拟合r2同时大于0.9的组合，后再进行人参皂苷rb1和人参皂苷rg1的相应参数拟合，筛选出三种组分cmax与auc拟合r2同时大于0.9的组合，b)模型整体评价指标：用经筛选出的时间点组合进行三种组分的cmax和auc预测，确认其拟合的r2，c)模型的预测检验：应用所建模型对受试大鼠复方丹参滴丸给药后cmax和auc进行预测，将所得预测值与对应个体参比值做相关性散点图。经过本发明上述方法筛选所得的采样点如下：0.25h、1h、3h经过本发明上述方法所得的药代动力学参数的预测模型如下：丹参素的cmax预测：tsl-cmax＝36.701+0.521*t0.25+0.653*t1+0.462*t3丹参素的auc预测：tsl-auc＝410.591+0.856*t0.25+0.838*t1+2.389*t3人参皂苷rb1的cmax预测：rb1-cmax＝9.311+0.309*t0.25+0.45*t1+0.343*t3人参皂苷rb1的auc预测：rb1-auc＝75.12+10.232*t0.25-0.843*t1+16.908*t3人参皂苷rg1的cmax预测：rg1-cmax＝0.428+0.938*t0.25+0.55*t1-0.097*t3人参皂苷rg1的auc预测：rg1-auc＝8.162+0.233*t0.25+1.335*t1-0.224*t3使用本发明的方法和模型在实际工作中的应用以及所获得的有益效果如下：本方法和模型筛选出的三个时间点可用于复方丹参滴丸后续药动学暴露量的评价过程，即按照本方法对大鼠给药后，采集0.25h、1h、3h的血浆即可预测大鼠体内药物的auc和cmax。本方法可应用于其他复方药物的关键采样点筛选，避免了复方药物研究时由于密集采样导致的受试依从性差、伦理道德问题、实验开展困难等。以下为本发明名称术语的解释和说明：药物经时浓度：药物给药后不同时间下，在受试个体内的血药浓度。复方丹参滴丸给药量及其配制方法：复方丹参滴丸以生理盐水溶解为合适的浓度，对大鼠灌胃给药。本方法中，复方丹参滴丸给药剂量为1.0g/kg和1.5g/kg，于给药前加生理盐水将复方丹参滴丸溶解为100mg/ml和150mg/kg，给药体积10ml/kg，根据大鼠体重调整具体药物体积。测定血浆中丹参素、人参皂苷rb1和rg1的经时浓度：应用生物样本分析技术对不同时间点血浆中的丹参素、人参皂苷rb1和rg1进行血药浓度测定。本方法中使用的测定方法见“实施例2.大鼠血浆中丹参素、人参皂苷rb1、rg1的分析方法”。das2.0软件：das2.0是一款药代动力学智能化分析区块软件，能够分析药物生物等效性、药物代谢智能分析、药物效应动力学分析、药物相互作用动力学分析、药物试验设计、医药统计学分析、药物体内外相关分析。非房室模型：药动学研究中不按照隔室行为特征进行建模分析，而采用统计矩模型进行分析。常见的非房室模型参数有药峰浓度(cmax)、达峰时间(tmax)、末端消除速率(ke)、末端消除半衰期(t1/2)、药时曲线下面积(auc)、清除率(cl)、表观分布容积(vd)、平均驻留时间(mrt)、生物利用度(f)。用excel罗列所有1-3个采样点的组合：本方法中将14个采血时间点随机1个、2个或3个时间点组成一组，用excel程序进行排列组合。其中，三个时间点组成一组，共有364种情况。auc或cmax预测模型：将受试个体的pk参数(auc或cmax)与其不同时间的血药浓度进行线性回归，获得回归方程，可用于受试个体auc或cmax的预测。spss分析软件：ibmspssstatistics22软件，常用于数据处理和图形输出。parameterjk＝constantjk+m1jkc1jk+……+mijkcijk(i≤3)：该公式是多元线性回归公式，其中parameter指某药物组分的auc或cmax，constant是该公式中的常数项，c是某药物组分在某时间的血药浓度，m是相应时间血药浓度前面的系数。r2：评价多元线性回归方程效能的参数，检验样本数据点聚集在回归线周围的密集程度。对应个体参比值：获得受试个体的血药浓度后，经血药浓度数据分析得到每个个体的药代动力学参数auc和cmax，这些真实值即个体参比值。相关性散点图：以预测值和真实值做x-y散点图，考察预测相关性。本发明和现有技术相比，优点在于：1.以auc和cmax作为pk研究中的重点预测指标，筛选出了药物组分的关键采样时间点，简化了研究流程，有利于减少大量样本药动学研究实验周期、经费等的投入。2.较单组分丹参素、人参皂苷rb1或人参皂苷rg1单独的优化采样模型相比，本发明针对的对象是复方丹参滴丸多组分，筛选出的时间点可以较好的预测多组分的体内过程，实现了多组分的同时评价。附图说明：图1是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，丹参素auc所得预测值与对应个体参比值相关性散点图图2是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，丹参素cmax所得预测值与对应个体参比值相关性散点图图3是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，人参皂苷rb1auc所得预测值与对应个体参比值相关性散点图图4是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，人参皂苷rb1cmax所得预测值与对应个体参比值相关性散点图图5是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，人参皂苷rg1auc所得预测值与对应个体参比值相关性散点图图6是受试大鼠复方丹参滴丸给药后预测，人参皂苷rg1cmax所得预测值与对应个体参比值相关性散点图具体实施方式：下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1.复方丹参滴丸多组分在大鼠体内暴露量采样点的优化方法：1.药物经时浓度测定：将雄性sd大鼠18只随机分成两组，每组9只，受试大鼠禁食12h后，分别单次灌胃给予低(1000mg/kg)、高剂量(1500mg/kg)的复方丹参滴丸，于给药前及给药后0.083h、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48、72h进行眼底静脉丛连续取血，离心取血浆，应用lc/ms-ms进行血浆中丹参素、rb1和rg1经时浓度的测定。2.先验信息获得及参比值计算：应用das2.0软件，以非房室模型法求算药代动力学参数，结果见表1-表6。表1.复方丹参滴丸(1.5g/kg)单次给药后丹参素血药浓度及药代参数表2.复方丹参滴丸(1.0g/kg)单次给药后丹参素血药浓度及药代参数表3.复方丹参滴丸(1.5g/kg)单次给药后人参皂苷rb1血药浓度及药代参数表4.复方丹参滴丸(1.0g/kg)单次给药后人参皂苷rb1血药浓度及药代参数表5.复方丹参滴丸(1.5g/kg)单次给药后人参皂苷rg1血药浓度及药代参数表6.复方丹参滴丸(1.0g/kg)单次给药后人参皂苷rg1血药浓度及药代参数3.随机采样点组合：考虑数据处理方便，以t1～t14代替0.083h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h这14个采样点，用excel罗列所有三个采样点的组合，得到364种组合。如表7所示。表7：采样点组合列表组合11,2,3组合151,3,6……组合3519,11,14组合21,2,4组合161，3,7组合3529，12,13组合31，2,5组合171,3,8组合3539,12,14组合41,2,6组合181,3,9组合3549，13,14组合51,2,7组合191，3,10组合35510,11,12组合61,2,8组合201,3,11组合35610,11,13组合71,2,9组合211,3,12组合35710，11，14组合81，2，10组合221,3，13组合35810,12，13组合91,2,11组合231,3,14组合35910,12，14组合101，2,12组合241，4，5组合36010,13,14组合111,2,13组合251,4,6组合36111,12,13组合121,2,14组合261,4,7组合36211,12,14组合131,3,4组合271,4,8组合36311,13，14组合141，3，5组合281，4，9组合36412，13,144.auc或cmax预测模型的构建，包括如下步骤：1)逐步筛选自变量组合：应用spss分析软件先进行丹参素的cmax拟合，筛选出该药物对应参数满足条件的组合，再考察auc结果，选出同时满足r2大于0.9的组合，再进行人参皂苷rb1和rg1的相应参数拟合。结果如表8所示，最后筛选获得：t2、t4、t7，即0.25h、1h、3h三个时间点满足三个药物cmax和auc的参数预测要求。表8：丹参素、人参皂苷rb1、rg1进行cmax和auc拟合r2大于0.9的组合2)模型整体评价指标：用0.25h、1h、3h三个时间点进行丹参素、人参皂苷rb1、rg1的cmax和auc预测，结果表明预测值与实测值接近，预测值与实测值做散点均匀分布在y＝x对角线附近，其趋势线斜率接近于1，r2大于0.9。相关预测回归方程如表9所示。表9：用0.25h、1h、3h三个时间点的丹参素、人参皂苷rb1、rg1的cmax和auc预测回归方程。3)模型的预测检验：应用所建模型对18例大鼠复方丹参滴丸给药auc或cmax预测，将所得预测值与对应个体参比值做相关性散点图，见附图1-6。实施例2.大鼠血浆中丹参素、人参皂苷rb1、rg1的分析方法1)色谱与质谱条件选用waters公司的acquityhsst3column(1.8μm,2.1mm×100mm)色谱柱，配预柱vanguardtmhsst3pre-column(1.8μm，2.1mm×5mm)，柱温设定为40℃。流动相选用0.1％甲酸水和乙腈，洗针液为乙腈-水(1:1/v:v)。各成分按照表10罗列的梯度条件进行分离。表10.样品分析液相条件质谱检测按照正负离子模式同步进行，相应参数如表11所示：表11.质谱检测参数(正负离子模式同步进行)应用多重反应监测(mrm)模式进行定量分析，待测物和内标质谱参数如表12所示。其中正离子模式下检测人参皂苷rb1(grb1)、人参皂苷rg1(grg1)分析物，应用内标为艾司唑仑；负离子模式下检测丹参素(tsl)分析物，应用内标为氯霉素。表12.分析物及相关内标质谱条件2)溶液配制和样品处理对照品溶液的配制：精密称取适量丹参素钠标准品，用0.1mol/l盐酸(含0.2％亚硫酸氢钠)水溶液溶解，得到1.0mg/ml的丹参素母液。精密称取适量人参皂苷rb1、人参皂苷rg1标准品，分别用甲醇溶解得到1.0mg/ml的母液。所有分析物母液放置于4℃冰箱避光储存。标准曲线工作液的配制：取适量上述分析物母液混合，甲醇-水(1:1/v:v)作为溶剂进行稀释，配制含丹参素1600ng/ml、含人参皂苷rb1500ng/ml、含人参皂苷rg1100ng/ml的标准曲线储备液。然后以甲醇-水(1:1/v:v)溶液为稀释溶剂，配制标准曲线工作液sw1～sw8(含丹参素浓度为1.6、3.2、8、24、80、240、800、1600ng/ml，含人参皂苷rb1浓度为0.5、1、2.5、7.5、25、75、250、500ng/ml，含人参皂苷rg1浓度为0.1、0.2、0.5、1.5、5、15、50、100ng/ml)，将配置好的标准曲线工作液放置于4℃冰箱储存。内标工作液的配制：精密称取适量氯霉素和艾司唑仑标准品，氯霉素用0.1mol/l盐酸(含0.2％亚硫酸氢钠)水溶液溶解，艾司唑仑用甲醇溶解，得到1.0mg/ml的母液。以甲醇-水(1:1/v:v)溶液为稀释溶剂，配制两个内标均为20ng/ml的混合内标工作液，放置于4℃冰箱储存。血浆样本处理：取肝素抗凝给药后血浆100μl至10mlep管中，加入甲醇-水(1:1/v:v)溶液100μl，加入混合内标工作液50μl，再加入1mol/l盐酸100μl，混匀后加入2ml正丁醇-乙酸乙酯(1:4/v:v)溶液提取，涡旋3min后于4500rpm、4℃条件下离心10min。取上层液体移至干净ep管中，25℃氮吹挥干。加入100μl新配制的乙腈-水(1:1/v:v)复溶液涡旋3min，然后将样品转移至1.5mlep管中，于13300rpm转速下离心3min。取上清液转移至进样瓶中，进样2μl，按“1)色谱与质谱条件”测定，用样品峰面积和内标峰面积的比值进行定量分析。实施例3.大鼠实验1.给药及采样方案复方丹参滴丸灌胃给药，给药时间安排在实验当天上午8：00-9：00，复方丹参滴丸给药剂量为1.0g/kg和1.5g/kg，于给药前加生理盐水将复方丹参滴丸溶解为100mg/ml和150mg/kg，给药体积10ml/kg，根据大鼠体重调整具体药物体积。大鼠给药前禁食12h，自由饮水，给药后3h统一进食。考虑到人参皂苷rb1半衰期时间较长，设计采样点为：0.083h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h。在相应时间点采集血样，30min内离心取上清。2.样品收集与处理各组于给药后相应时间经眼球后静脉丛取血0.2ml，置于肝素钠抗凝管中，轻轻摇使其与抗凝剂充分混匀，于0.5h之内完成离心。血浆离心操作：将血样置于高速离心机，4500rpm离心10min后，取上清0.1ml，-40℃下冷冻储存。分析测定工作按照“实施例2大鼠血浆中丹参素、人参皂苷rb1、rg1的分析方法”项下操作。当前第1页12