化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法与流程

本发明涉及一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法。

背景技术：

糖尿病是目前世界范围内最严重的健康问题之一，2015年全球20-79岁的人中有约4.15亿人患糖尿病，另外有3.18亿人糖耐量受损。中国是全球糖尿病患者第一大国，2015年病患人数高达1.096亿人，130万人死于糖尿病及其并发症。据国际糖尿病联盟预测，如果不加干预，2040年全球糖尿病患者将达6.42亿，我国患者数量将上升至1.54亿。糖尿病是由于胰岛素在体内的绝对不足和相对不足而引起的以高血糖为主要特征的疾病，如果病人长期高血糖不加以控制会引发糖尿病心肌病、肾病、视网膜病变及神经病变的发生与发展，严重危害患者的健康和生活。因此，糖尿病发病机制及药物一直是医药学界研究的重点，促进胰岛素分泌是抗糖尿病药物的作用机制之一。

胰岛是胰腺的内分泌组织，主要是由胰岛alpha和beta细胞组成的细胞团，散布在胰腺的各处，胰岛产生的胰岛素和胰高血糖素，是机体能量代谢的主要调节激素，特别是针对碳水化合物的代谢调节，如果胰岛素长期分泌不足，会导致糖尿病的发生。目前胰岛功能研究的技术主要包括胰岛灌流和胰岛孵育。胰岛灌流可以得到动态的胰岛素分泌曲线，但耗时长、成本高、技术难度大。传统的方法分离培养的胰岛和功能研究不适用于高通量的研究，限制了胰岛功能研究在疾病机制研究领域及药物研发领域的应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，可快速、大批量的检测化合物对胰岛功能的影响。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种化合物对胰岛功能影响的高通量检测方法，其步骤包括：

a、将胰岛置于rpmi1640培养液中培养2~3天；

b、取1~5个胰岛置于96孔板中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；

c、在胰岛中加入孵育液，在摇床上培养30分钟，离心，移走上清；

d、在胰岛中加入刺激液，在摇床上培养30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素分泌水平。

优选的，其中刺激液包括对照组刺激液和化合物组刺激液，所述对照组刺激液为在孵育液中加入葡萄糖，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的葡萄糖以及待测化合物；或者对照组刺激液为在孵育液中加入亮氨酸+谷氨酰胺，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的亮氨酸+谷氨酰胺以及待测化合物；

根据对照组刺激液和化合物组刺激液培养的胰岛素分泌水平，分析化合物对葡萄糖对胰岛的促胰岛素分泌作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少；或者分析化合物对亮氨酸+谷氨酰胺对胰岛的促胰岛素分泌作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少；

所述刺激液中葡萄糖浓度为0~25mm；或者刺激液中亮氨酸浓度为0~10mm，谷氨酰胺浓度为2mm。

优选的，所述孵育液中nacl的浓度为115mmol/l,nahco3的浓度为24mmol/l,kcl的浓度为5mmol/l，mgcl2的浓度为1mmol/l，cacl2的浓度为2.5mmol/l，hepes浓度为10mmol/l，溶剂为h2o，调节溶液ph到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。

优选的，步骤a中的培养条件为37℃、5%co2及95%空气湿度的培养箱。

优选的，步骤c和d中的培养条件为37℃、5%co2培养箱的摇床。

本发明还公开了一种化合物对胰岛功能（胰岛素及胰高糖素分泌）影响的高通量检测方法，其步骤包括：

a、将胰岛置于rpmi1640培养液中培养2~3天；

b、取15~25个胰岛置于培养装置中，其中胰岛之间的大小误差不超过20%，加入孵育液，离心，移走上清；

c、在胰岛中加入孵育液，在摇床上培养30分钟，离心，移走上清；

d、在胰岛中加入刺激液，在摇床上培养30分钟，离心，收集上清液，并测量上清液中的胰岛素及胰高糖素分泌水平。

优选的，其中刺激液包括对照组刺激液和化合物组刺激液，所述对照组刺激液为在孵育液中加入甘氨酸及不同浓度葡萄糖，化合物组刺激液为在孵育液中加入同样浓度的甘氨酸及不同浓度葡萄糖以及待测化合物；

根据对照组刺激液和化合物组刺激液培养的胰岛素及胰高糖素分泌水平，分析化合物对葡萄糖对胰岛的促胰岛素分泌作用，甘氨酸对胰高糖素刺激分泌作用及葡萄糖对甘氨酸刺激的胰高糖素分泌的抑制作用起到促进还是抑制作用，促进或抑制的程度为多少，所述刺激液中葡萄糖浓度为0～25mmol/l,，甘氨酸的浓度为1mmol/l。

优选的，所述孵育液中nacl的浓度为115mmol/l,nahco3的浓度为24mmol/l,kcl的浓度为5mmol/l，mgcl2的浓度为1mmol/l，cacl2的浓度为2.5mmol/l，hepes的浓度为10mmol/l，溶剂为h2o，调节溶液ph到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。

优选的，步骤a中的培养条件为37℃、5%co2及95%空气湿度的培养箱。

优选的，步骤c和d中的培养条件为37℃、5%co2培养箱的摇床。

本发明的有益效果如下：

本发明只需要4个小时左右的时间（胰岛实验时间为1小时，激素测定时间为3小时）即可测量出化合物对胰岛分泌水平的影响，胰岛的用量少，只需1~5个胰岛即可测量。如果培养容器选择96孔板的话，可同时进行多个化合物对胰岛分泌水平影响的测量，成本低、耗时短、步骤简单、使用方便，结果的重复性好，在药物筛选和胰岛生物学研究中有广泛应用。

附图说明

图1.实施例1中一种胰岛功能刺激药物（gsk-j1500nmol/l，h3k27histonedemethylase抑制剂）对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响图，图中三角形标注的为对照组刺激液培养的胰岛的胰岛素水平分泌图，圆形标注的为化合物组（gsk-j1）刺激液培养的胰岛的胰岛素水平分泌图；

图2、实施例2中胰岛功能刺激药物（tak-875）对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响图；

图3.实施例3中刺激物对小鼠胰岛胰高糖素分泌的影响图。图中方形标注的为基因敲除小鼠的胰高糖素水平分泌图，圆形标注的为野生型小鼠的胰高糖素水平分泌图。

具体实施方式

实施例1：

1.胰岛分离

胰岛分离的方法为本领域通用的方法。下为小鼠胰岛分离的过程简述：

1）小鼠麻醉后固定于手术板上，打开腹腔，用止血钳闭锁胆管进入十二指肠的入口，之后用5ml注射器及31.5号针头将2mg/ml的胶原酶溶液（溶解在hanks缓冲液内）注射进入胆管，至胰腺充分充起后停止。

2）剥离胰腺，清理掉脂肪及非胰腺组织后，将胰腺转移到50ml离心管内，再倒入3ml的2mg/ml胶原酶溶液，在37℃水浴中震荡4~5分钟。

3）震荡结束后，立刻在50ml离心管内加入hanks缓冲液至50ml，离心（2000转，30秒），移走上清，剩余组织沉淀加入5mlhistopaque-1119溶液，震荡混匀。

4）缓慢加入5mlhistopaque-1077溶液,再缓慢加入5mlhanks缓冲液，离心（2000转，10分钟）。

5）从分层的液体间移走胰岛组织，在解剖显微镜下挑取纯化胰岛，清洗后培养。

胰岛培养

1）rpmi1640培养液的配制：溶液中加入葡萄糖10mmol/l，谷氨酰胺2mmol/l，10%胎牛血清，碳酸氢钠24mmol/l，青霉素100units/ml，链霉素10ug/ml，调节ph到7.2。

2）用rpmi1640培养液将分离纯化的胰岛培养在37℃、5%co2及95%空气湿度的培养箱内2~3天。

胰岛孵育

1）孵育液krebs-ringerbicarbonatebuffer（简称krbb）配制：溶液中加入115mmol/lnacl,24mmol/lnahco3,5mmol/lkcl,1mmol/lmgcl2,2.5mmol/lcacl2,10mmol/lhepes,调节ph到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。

2）刺激液配制：根据实验需求用krbb配制5组对照组刺激液，其中葡萄糖浓度分别为0mmol/l、2mmol/l、5mmol/l、10mmol/l、25mmol/l，再配制5组刺激液并添加500nmol/lgsk-j1，购自sigma公司。3）选择大小误差不超过20%的胰岛，置于v型底的96孔平板，根据需求，每孔放置1~5个胰岛，加入150ulkrbb。

4）平板离心机离心（500转，20秒），移走上清，再重复一次。

5）加入150ulkrbb，置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）后移走上清。

6）加入不同刺激液，再次置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）收集上清液。

胰岛素测定

取胰岛刺激实验后的上清液10ul，移入384空板，之后按照htrf胰岛素试剂盒说明加入抗体，震荡混匀后置于室温孵育4小时后，用bmg的clariostar酶标仪htrf程序读数，根据标准曲线计算激素分泌值。测定上清液的胰岛素分泌来确认药物对胰岛素分泌的影响。从图1中可看出，该药物能够改善葡萄糖刺激小鼠胰岛分泌胰岛素。

实施例2：

1.胰岛培养

1）rpmi1640培养液的配制：溶液中加入葡萄糖10mmol/l，谷氨酰胺2mmol/l，10%胎牛血清，碳酸氢钠24mmol/l，青霉素100units/ml，链霉素10ug/ml，调节ph到7.2。

2）用rpmi1640培养液将分离纯化的胰岛培养在37℃、5%co2及95%空气湿度的培养箱内2~3天。

胰岛孵育

1）孵育液krebs-ringerbicarbonatebuffer（简称krbb）配制：溶液中加入115mmol/lnacl,24mmol/lnahco3,5mmol/lkcl,1mmol/lmgcl2,2.5mmol/lcacl2,10mmol/lhepes,调节ph到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。

2）刺激液配制：根据实验需求用krbb配制2组对照组刺激液，低糖（3mmol/l葡萄糖）及高糖（10mmol/l葡萄糖），再配置2组和对照组一样的刺激液另外加不同的化合物（示例化合物为：tak-875，浓度为1umol/l;阳性对照为exendin-4，100nmol/l）。

3）选择大小误差不超过20%的胰岛，置于v型底的96孔平板，根据需求，每孔放置1~5个胰岛，加入150ulkrbb。

4）平板离心机离心（500转，20秒），移走上清，再重复一次。

5）加入150ulkrbb，置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）后移走上清。

6）加入不同刺激液，再次置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）收集上清液。

胰岛素测定

取胰岛刺激实验后的上清液10ul，移入384空板，之后按照htrf胰岛素试剂盒说明加入抗体，震荡混匀后置于室温孵育2～4小时后，用bmg的clariostar酶标仪htrf程序读数，根据标准曲线计算激素分泌值。测定上清液的胰岛素分泌来确认药物对胰岛素分泌的影响。从图2中可看出，1）10mmol/l葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显高出3mmol/l葡萄糖的刺激能力；2）100nmol/lexendin-4明显改善10mmol/l葡萄糖刺激的胰岛素分泌；3）化合物tak-875刺激10mmol/l葡萄糖刺激的胰岛素分泌。可以看出，化合物tak-875是能改善葡萄糖胰岛素分泌的，适用于针对糖尿病的药物开发。

实施例3：

1.胰岛培养

1）rpmi1640培养液的配制：溶液中加入葡萄糖10mmol/l，谷氨酰胺2mmol/l，10%胎牛血清，碳酸氢钠24mmol/l，青霉素100units/ml，链霉素10ug/ml，调节ph到7.2。

2）用rpmi1640培养液将基因敲除小鼠的胰岛及野生型小鼠的胰岛培养在37℃、5%co2及95%空气湿度的培养箱内2~3天。

胰岛孵育

1）孵育液krebs-ringerbicarbonatebuffer（简称krbb）配制：溶液中加入115mmol/lnacl,24mmol/lnahco3,5mmol/lkcl,1mmol/lmgcl2,2.5mmol/lcacl2,10mmol/lhepes，调节ph到7.4，再加入0.25%牛血清白蛋白。

2）刺激液配制：根据实验需求用krbb配制5组对照组刺激液，其中甘氨酸浓度为1mmol/l，葡萄糖浓度为0mmol/l、5mmol/l、100mmol/l、20mmol/l。

3）挑选大小误差不超过20%的胰岛，置于v型底的96孔平板，根据实验需求，每孔20个胰岛，加入150ulkrbb。

4）平板离心机离心（500转，20秒），移走上清，再重复一次。

5）加入150ulkrbb，置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）后移走上清。

6）加入不同刺激液，再次置于37℃、5%co2培养箱的摇床上，轻微摇动30分钟，离心（500转，20秒）收集上清液，保存于-20℃冰箱直到激素测定，。

胰岛素及胰高糖素测定

取胰岛刺激实验后的上清液10ul，移入384空板，之后按照胰岛素试剂盒或胰高糖素测定试剂盒说明加入抗体，震荡混匀后置于室温孵育2~4小时后，用bmg的clariostar酶标仪htrf程序读数，根据标准曲线计算激素分泌值，通过测定上清液的胰岛素及胰高血糖素同时分泌来确认葡萄糖和甘氨酸对小鼠胰岛胰岛素及胰高血糖素分泌的影响。从图3可以看出，野生型小鼠胰岛对甘氨酸刺激敏感，对葡萄糖抑制的胰高糖素分泌也很敏感。但基因敲除小鼠的胰岛对甘氨酸刺激胰高糖素分泌及葡萄糖抑制胰高糖素都存在异常。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。