一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中ADMA和SDMA的方法及试剂盒与流程

本发明涉及血液检测
技术领域：
，特别是涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法及试剂盒。
背景技术：
：一氧化氮(no)是内皮衍生的血管活性物质之一，对于维持内皮稳态起了重要作用，低水平的no与内皮功能受损有关。非对称二甲基精氨酸(adma)和对称二甲基精氨酸(sdma)是l-精氨酸的代谢产物。正常情况下，精氨酸被血管内皮细胞内源性一氧化氮合成酶转化成一氧化氮和l-瓜氨酸。adma可以竞争性的抑制一氧化氮合成酶的功能，从而减少一氧化氮的产量，sdma通过减少细胞中的精氨酸间接影响一氧化氮产生。最终，因一氧化氮缺乏，血管内皮细胞功能不全，导致血管动脉粥样硬化。因此，人体adma和sdma含量的升高或者降低与心脑血管类疾病风险息息相关，其在血浆中含量的高低对于评估人体健康是至关重要的。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法，用于解决现有技术中没有共同检测adma和sdma含量的检测方法的问题，本发明还提供一种用于adma和sdma定量分析的试剂盒。本发明具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点。为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面，提供一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法，包括如下步骤：步骤一、将血浆处理后取上清液进样，经过超高效液相色谱将adma和sdma与血浆基质分离，其中色谱条件如下：色谱柱为三键键合式烷基柱，色谱柱柱温为30～50℃，进样量为0.5～5μl，流速为0.1～1ml/min，流动相a为0.2mm甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相b为乙腈；步骤二、将超高效液相色谱分离的adma和sdma再通过串联质谱进行检测，根据建立的校准曲线计算adma和sdma的含量，其中质谱条件如下：喷雾电压2.5～3.5kv，去溶剂温度为80～140℃，雾化气温度为350～450℃，雾化气流速为700～900l/h，锥孔气流速为120～180l/h。超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点，6min之内完成待测物的分离和检测，基质效应与精密度基本满足要求，可用于临床上adma和sdma的定量分析，为临床上心脑血管疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。采用id-uplc-ms/ms方法测定了人体血浆中的非对称二甲基精氨酸(adma)和对称二甲基精氨酸(sdma)。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。于本发明的一实施例中，所述步骤一中血浆处理的具体过程为：将血浆和内标液b按照体积比为1：(50～80)加入离心管中，先涡旋10～30s、振荡8～10min后进行离心，离心速率为12000～18000r/min，离心时间为8～12min，离心后取上清液作为待测样。于本发明的一实施例中，所述血浆和内标液b按照体积比为1：60，离心速率为15000r/min，离心时间为10min。于本发明的一实施例中，所述的血浆为人或动物的血浆。于本发明的一实施例中，所述内标液b的制备过程为：取同位素内标品adma-d7加入体积分数为50％的甲醇水溶液中溶解，得到摩尔浓度为10mm的同位素内标溶液，再用体积分数为50％的甲醇水溶液将该同位素内标溶液稀释至摩尔浓度为40μm的内标液a，将内标液a和甲醇按照体积比为1：2000混合即得内标液b。于本发明的一实施例中，所述色谱条件如下：色谱柱为acquityuplcbehamide，2.1×100mm，1.7μm；色谱柱柱温为40℃；进样量为1μl；流速为0.4ml/min；流动相梯度洗脱参数如表2所示：表格2时间流速(ml/min)流动相a/％流动相b/％0.00.415853.00.470303.50.470306.00.41585，其中流动相a为0.2mm甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液，流动相b为乙腈。于本发明的一实施例中，所述校准曲线的制作过程为：将含adma和sdma各0.1mm的标准品储备液与空白血浆基质溶液按照体积比为1：19混合后作为第一个高值浓度点，其摩尔浓度为5μm；再将第一个高值浓度点的溶液与空白血浆基质溶液按照体积比为1：1混合后作为第二高值浓度点，其摩尔浓度为2.5μm；再将第二高值浓度点的溶液与空白血浆基质溶液逐级稀释得到其余六个校准点；再将8个浓度点的溶液分别与内标液b按照体积比为1：60加入离心管中，先涡旋10～30s、振荡8～10min后进行离心，再分别取上清液进样，通过串联质谱进行检测，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，即可。于本发明的一实施例中，所述空白血浆基质溶液为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液。于本发明的一实施例中，所述质谱条件如下：喷雾电压3.0kv；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃；雾化气流速为800l/h；锥孔气流速为150l/h；同时监测了目标物adma(m/z203.1→46.0)、sdma(m/z203.1→172.0)以及同位素内标adma-d7(m/z210.1→46.0)，各个目标物的去簇电压和碰撞电压参数见表3：表格3本发明第二方面，提供一种用于adma和sdma定量分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：0.2mm甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液、乙腈、含adma和sdma各0.1mm的体积分数50％甲醇溶液、50mg/ml牛血清白蛋白的水溶液、甲醇、含adma和sdma各0.1μm的空白血浆基质溶液、含adma和sdma各0.5μm的空白血浆基质溶液、含adma和sdma各4μm的空白血浆基质溶液。于本发明的一实施例中，所述试剂盒中包括：500ml的0.2mm甲酸铵和体积分数0.004％甲酸的水溶液、500ml的乙腈、0.1ml的含adma和sdma各0.1mm的体积分数50％甲醇溶液、20ml的50mg/ml牛血清白蛋白的水溶液、100ml的甲醇、0.5ml的含adma和sdma各0.1μm的空白血浆基质溶液、0.5ml的含adma和sdma各0.5μm的空白血浆基质溶液、0.5ml的含adma和sdma各4μm的空白血浆基质溶液。如上所述，本发明的一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法，具有以下有益效果：超高效液相色谱串联质谱检测血浆中adma和sdma的方法具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点，6min之内完成待测物的分离和检测，基质效应与精密度基本满足要求，可用于临床上adma和sdma的定量分析，为临床上心脑血管疾病的健康评估提供一种可靠的检测方法。附图说明图1为adma和sdma及其内标标准品的总离子流色谱图。图2为血浆中adma和sdma及其内标的总离子流色谱图。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。1.材料(1)血浆样品：方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2017年12月份门诊收集的血浆样本。(2)仪器：xevotq-s三重四级杆质谱仪(waterscorporation)；uplci-class超高效液相色谱系统(配自动进样器，waterscorporation)；scilogexd2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(elgalabwater，英国)；多管涡旋混合仪(vortexgenie2，美国)；可调移液器(eppendorf0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl)；玻璃仪器、量筒等。(3)试剂耗材：色谱纯甲醇(honeywell，美国)；ms级乙腈(fisher，美国)；ms级甲酸、甲酸铵(merck，美国)；牛血清白蛋白(bsa)(merck，美国)；色谱柱watersbehamide，1.7μm，2.1x100mm(waterscorporation)。(4)标准品：adma和sdma购自merck公司，adma-d7购自cambridgeisotopesltd.公司，纯度均≥98％。(5)质控品：含有adma和sdma分子的空白血浆基质溶液，分低中高三个浓度分别为qc(l)、qc(m)、qc(h)表示，如表4所示，：表格4化合物qc(l)/μmqc(m)/μmqc(h)/μmadma0.10.54sdma0.10.54。2.方法(1)色谱条件：流动相a：水(含体积分数0.004％甲酸+0.2mm甲酸铵)；流动相b：乙腈。色谱柱型号：acquityuplcbehamide，1.7μm,2.1x100mm。流速为0.4ml/min。色谱柱柱温为40℃。进样体积为1μl。流动相梯度洗脱参数如表5所示：表格5时间流速(ml/min)流动相a/％流动相b/％0.00.415853.00.470303.50.470306.00.41585。(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kv；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h；同时监测了目标物adma(m/z203.1→46.0)、sdma(m/z203.1→172.0)以及同位素内标adma-d7(m/z210.1→46.0)。各个目标物的去簇电压和碰撞电压参数见表6：表格6(3)标准品配制：分别准确称取adma、sdma3.92mg和5.00mg，各自加入14.24、6.565ml的体积分数为50％的甲醇水溶液，配制成浓度均为1mm的adma标准品母液、sdma标准品母液，将adma标准品母液和sdma标准品母液用体积分数为50％的甲醇水溶液稀释配制成含adma和sdma各0.1mm的混合标准品储备液；取5.00mg同位素内标品adma-d7，加入1.896ml体积分数为50％的甲醇水溶液完全溶解，得到浓度为10mm的同位素内标溶液，然后用体积分数为50％的甲醇水溶液将该同位素内标溶液的浓度稀释至40μm的内标液a，取10μl内标液a加入到20ml甲醇溶液中，得内标液b。(4)质控品的配制：取混合标准品储备液1μl、5μl、40μl分别用空白血浆基质溶液定容至1000μl得到。(5)样品处理a标准曲线的制作：取10μl标准品储备液加入至190μl空白血浆基质溶液中作为第一个高值浓度点；取100μl第一高值浓度点用等体积空白血浆基质溶液稀释得第二高值浓度点，后使用1倍体积的空白血浆基质溶液进行逐级稀释，得其他六个校准浓度点。每个浓度点样品取20μl分装，加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液移入色谱瓶中上样进行lc-ms/ms分析。b血浆样品前处理：取20μl血浆于1.5ml离心管中，向其中加入1200μl内标液b，涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液移入色谱瓶中上样进行lc-ms/ms分析。c质控品前处理：分别取质控品溶液qc(l)、qc(m)、qc(h)各20μl于1.5ml离心管中，然后跟血浆样品前处理方法一致，此处不再赘述。分析试剂盒中各组分见表7：表格7其中试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相a和b，左下方分别放置4*1ml安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放置10ml稀释液和100ml萃取液。3.方法验证(1)总离子流色谱图：adma和sdma的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为adma和sdma及其同位素内标的总离子流色谱图，图2为血浆中adma和sdma及其同位素内标的总离子流色谱图。(2)基质效应(matrixeffect，me)和提取回收率(extractionefficiency，ee)考察：由于本实验空白血浆基质为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液(5％bsa)，且定量标曲(定量标准曲线)由5％bsa配制而得，因此对5％bsa和血浆均进行基质效应和提取回收率考察，基质效应由提取后基质加标和同浓度标样纯溶液相比较而得，浓度越高，基质效应的影响越小，因此高浓度只考察了提取回收率(浓度越高，提取回收率可能越小)。a：在同浓度标样纯溶液采用id-uplc-ms/ms测试得到的峰面积；b：提取后基质加标的溶液采用id-uplc-ms/ms测试得到的峰面积。基质效应me(％)＝b/a×100。adma和sdma在5％bsa中基质效应和提取回收率结果如表8所示：表格8adma和sdma在血浆中基质效应和提取回收率结果如表9所示：表格9结果显示，adma和sdma在5％bsa中几乎无基质效应(低浓度和高浓度均在85％-115％之间)，且提取回收率较高(≥80％)；同样，adma和sdma在血浆中的基质效应经内标校正后，也在85％-115％之间；且高浓度样品提取回收率在80％以上。(3)校准曲线：采用同位素内标定量法，利用targetlynx软件以标准物与内标物的浓度比为x轴，标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。adma和sdma在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，满足定量要求，adma和sdma线性回归方程及线性相关系数的如表10所示：表格10分析物曲线浓度(μm)线性方程线性系数(r)adma0.08-5y＝0.892x+0.05920.9990sdma0.08-5y＝1.11x+0.05720.9974.(4)精密度试验：取正常人血浆样品一天内重复处理8批，以同位素内标法定量测定adma和sdma的浓度，批内精密度为5.54％，结果见表11：表格11分析物12345678xscv,％adma0.610.540.600.510.740.560.540.620.590.0712.0sdma0.920.900.960.921.030.850.831.000.920.077.35。三日内分3批处理，计算批间精密度为3.78％，结果见表12：表格12分析物123xscv,％adma0.590.590.530.570.035.93sdma0.960.920.840.910.066.65。adma和sdma日内精密度分别为12.0％和7.35％，日间精密度分别为5.93％和6.65％，方法的重现性良好。结论：本发明采用id-uplc-ms/ms(同位素稀释超高效液相色谱串联质谱)方法测定了人体血浆中的非对称二甲基精氨酸(adma)和对称二甲基精氨酸(sdma)。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。本发明通过对adma、sdma在5％bsa(50mg/ml牛血清白蛋白水溶液)和血浆中的基质效应及提取回收率考察发现，adma和sdma在5％bsa中几乎无基质效应(低浓度和高浓度均在85％-115％之间)，且提取回收率较高(≥80％)；同样，adma和sdma在血浆中的基质效应经内标校正后，也在85％-115％之间；且高浓度样品提取回收率在80％以上。说明5％bsa可作为空白血浆替代基质，用于血浆中adma和sdma的准确定量。本发明通过精密度试验对方法的重现性进行考察，结果表明，adma和sdma日内精密度分别为12.0％和7.35％，日间精密度分别为5.93％和6.65％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离。且血浆样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血浆用量仅20μl。综上所述，本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果准确且前处理过程较简单的优点，6min之内可完成化合物的分离和检测，基质效应、提取回收率以及精密度满足要求，可用于临床上血浆adma和sdma的定量分析，为临床上心脑血管疾病风险的健康评估提供一种可靠的检测方法。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12