本发明属于指纹图谱建立方法
技术领域：
：，具体涉及一种鸢都感冒颗粒指纹图谱的构建方法及应用。
背景技术：
：：公开该
背景技术：
：部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。鸢都感冒颗粒是由忍冬藤、葛根、牛蒡子(炒)、板蓝根、桔梗、甘草、前胡七味中药组成，功能主治为：清热解表，宣肺止咳，用于风热感冒，头疼身痛，发热恶寒，咽痛咳嗽。七味药材均收载于《中国药典》2015版一部中，其中甘草收载了豆科植物甘草、胀果甘草、光果甘草三个来源，其余为单一来源。忍冬藤为君药，板蓝根、葛根为臣药，牛蒡子为佐药。忍冬藤中绿原酸具有保护心血管、降糖、降脂、抗菌及抗病毒、抗白血病等作用；葛根中的异黄酮等成份：葛根素、大豆苷、大豆苷元，3’-甲氧基葛根素具有保肝护肝、免疫调节、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗炎等作用；牛蒡苷是有多种生物活性的木脂素类化合物，具有抗流行性感冒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、神经保护等多种药理活性作用；甘草苷具有抗氧化，改善抑郁症的作用。中药指纹图谱是从中药物质多成分的基础的角度出发，运用现代的分析检测手段，使系统，整体，专属的来表征中药中共有的，以及中药内在特征，成为有效评价中药质量的一种方法，被世界所接受。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，可以系统的，整体的评价中药。目前该制剂的标准过于简单，只有一个薄层的定性鉴别，无指标性成分的含量测定，无法有效的控制鸢都感冒颗粒的质量。技术实现要素：针对上述研究现状，发明人认为建立鸢都感冒颗粒的指纹图谱、通过指纹图谱对鸢都感冒颗粒进行全面的评价和控制，有利于保证产品质量的稳定性及临床用药的有效性及安全性。为了解决该技术问题，本发明建立了该制剂的君药、臣药等几个主要药物的指标性成分的含量测定和hplc指纹图谱的方法，从定量和定性的角度对鸢都感冒颗粒进行质量分析和控制。基于本发明提供的指纹图谱建立方法，能够从上述制剂中分析得到25个共有峰(去除22号样品后为31个共有峰)个共有峰，分离效果良好；经23批样品测定，该质量评价方法准确可靠，能够为鸢都感冒颗粒的质量分析控制提供参考。基于上述研究成功，本发明提供以下技术方案：本发明第一方面，提供一种鸢都感冒颗粒的指纹图谱建立方法，所述建立方法包括以下步骤：1)供试品及对照品的制备；所述供试品的制备方法如下：向待测鸢都感冒颗粒中加入甲醇，密闭条件下称重后超声提取，取续滤液部分作为供试品；所述对照品的制备方法如下：精密称取新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷对照品加入甲醇配置成为对照品；2)高效液相测定：分别通过高效液相测定对照品及供试品。优选的，所述供试品的制备还包括以下步骤：超声后放冷称重，加入甲醇补足失重部分。优选的，所述供试品的制备中，所述鸢都感冒颗粒与甲醇的比例为1.8～2.2g：18～22ml。优选的，所述供试品的制备中，超声时间为25～35min。优选的，在本发明提供的又一种指纹图谱建立方法中，所述供试品采用加热回流方法提取。优选的，所述高效液相色谱条件如下：采用c18色谱柱，流速：1.0ml·min-1，流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)。优选的，所述高效液相色谱采用梯度洗脱，所述洗脱程序如下：0～15min，5％a；15～20min，5％a～8％a；20～30min，8％a；30～45min，8％a～11％a；45～58min，11％a～12％a；58～65min，12％a～18％a；65～75min，18％a～25％a；75～90min，25％a～30％a；90～110min，30％a～40％a；110～120min，40％a～60％a；120～121min，60％a～90％a；121～125min，90％a～5％a。优选的，所述高效液相色谱分析的柱温为35～42℃。优选的，所述高效液相色谱分析的检测波长为278nm。优选的，所述供试品及对照品的进样体积为5μl。本发明第二方面，提供一种鸢都感冒颗粒的质量控制方法，所述控制方法包括以下步骤：(1)取多个批次的鸢都感冒颗粒按照第一方面所述指纹图谱建立方法构建鸢都感冒颗粒指纹图谱，将待测样品按照第一方面所述指纹图谱建立方法获得待测样品图谱；(2)将待测样品图谱与鸢都感冒颗粒指纹图谱进行相似度比较，相似度不低于0.90为质量合格产品。优选的，所述指纹图谱建立需要采集至少10批次的样品进行建立。优选的，所述相似度比较采用国家药典委员会相似度评价系统(2012版)。本发明第三方面，提供第一方面所述指纹图谱建立方法在鸢都感冒颗粒质量评价领域的应用。与现有技术相比，本公开的有益效果是：本发明首次提供了一种鸢都感冒颗粒的指纹图谱建立方法，基于本发明提供了指纹图谱建立条件，能够分析得到25个共有峰(去除22号样品后为31个共有峰)，对于药物提供了一种分离效果良好的色谱分析条件。基于该色谱条件，本发明选定了，新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷八种有效成分进行方法学分析，证实了该检测方法具有良好的检测精确度。进一步的，通过23批样品验证，该指纹图谱用于质量评价具有良好的效果。附图说明构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。图1为实施例1中对照品指纹图谱；其中，图1a为对照指纹图谱，图1b为不含22的对照指纹图谱。图2为实施例1中八种对照品混合溶液图谱。图3为实施例1中共有峰自动匹配图。图4为实施例1中共有峰药材归属图；其中，a-对照图谱，b-忍冬藤，c-葛根，d-板蓝根，e-牛蒡子，f-甘草，g-前胡，h-桔梗。图5为实施例1中主成分得分投影图结果图。图6为实施例1中相对峰面积及参考峰面积结果图；其中，图6a为实施例1中色谱峰相对峰面积比较结果图；图6b为实施例1中葛根素峰面积直方图。图7为实施例1中去掉22号样品后主成分分析结果图；图8为实施例1中聚类结合热图分析；其中，图8a为不含22号样品；图8b为包括22号样品；图8c为基于八种成分含量。图9为实施例1中鸢都感冒颗粒中八种成分含量随样品批次波动图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属
技术领域：
：的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
背景技术：
：所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提供了鸢都感冒颗粒指纹图谱的建立方法及其在质量评价方面的应用。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。实施例11.仪器与试药aglient1260系列高效液相色谱仪(dad检测器)，phenomenexc18柱(250mm×4.6mm，4μm)，分析天平(mettlerae240)，ks-300e超声波清洗器(宁波科生仪器厂，300w，40hz)。新绿原酸(e0420010)对照品购自anpel，绿原酸(110753-201817)，葛根素(110752-201615)、3’-甲氧基葛根素(t3530010)、大豆苷(111610-201607)、甘草苷(111610-201607)、大豆苷元(11502-200402)，牛蒡苷(110819-201611)对照品购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、磷酸为分析纯。23批样品均为市购，其中1-21号样品为a厂，批号分别为：170202，170203，161104，161105，161104，161107，161106，121202，121003，120409，120206，121205，121104，120208，120202，121205，181101，181102，181103，181104，181105；样品22为b厂，批号为：161101；样品23为c厂，批号为：170101；规格均为：15g/袋。忍冬藤、板蓝根、前胡、葛根、桔梗、甘草、牛蒡子均为市购。2方法与结果2.1对照品溶液制备对照品贮备液配制：精密称取各对照品适量，分别制成混合对照品溶液1(分别含新绿原酸0.003913mg·ml-1，绿原酸0.007930mg·ml-1，葛根素0.1335mg·ml-1，3’-甲氧基葛根素0.03801mg·ml-1，大豆苷0.02418mg·ml-1，甘草苷0.02935mg·ml-1，大豆苷元0.003480mg·ml-1，牛蒡苷0.10443mg·ml-1)和混合对照品溶液2(分别含新绿原酸0.004843mg·ml-1，绿原酸0.007030mg·ml-1，葛根素0.13006mg·ml-1，3’-甲氧基葛根素0.03501mg·ml-1，大豆苷0.02418mg·ml-1，甘草苷0.02935mg·ml-1，大豆苷元0.003380mg·ml-1，牛蒡苷0.10443mg·ml-1)。2.2供试品溶液取本品研细，精密称取约2g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声(300w，40hz)提取30min，放冷，再称定，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。2.3含量测定及指纹图谱色谱条件色谱柱：phenomenexc18柱(250mm×4.6mm，4μm)；流速：1.0ml·min-1；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)，梯度洗脱0～15min，5％a；15～20min，5％a～8％a；20～30min，8％a；30～45min，8％a～11％a；45～58min，11％a～12％a；58～65min，12％a～18％a；65～75min，18％a～25％a；75～90min，25％a～30％a；90～110min，30％a～40％a；110～120min，40％a～60％a；120～121min，60％a～90％a；121～125min，90％a～5％a；柱温：40℃；对照品、供试品溶液进样量均为5μl，指纹图谱波长278nm；新绿原酸、绿原酸吸收波长为327nm，葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元吸收波长为250nm，甘草苷、牛蒡苷吸收波长为278nm。2.4方法学考察2.4.1线性关系考察精密称取各对照品适量，制成含新绿原酸0.01174mg·ml-1，绿原酸0.02379mg·ml-1，葛根素0.4004mg·ml-1，3’-甲氧基葛根素0.1140mg·ml-1，大豆苷0.07254mg·ml-1，甘草苷0.08805mg·ml-1，大豆苷元0.01044mg·ml-1，牛蒡苷0.3133mg·ml-1的混合对照品储备液。用倍比稀释的方法制成系列对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，详细结果见表1。2.4.2定量限、检测限确立精密吸取2ml混合对照品溶液1，置100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，同法制成一系列浓度对照品混合溶液。按2.3项中色谱条件进行hplc分析，信噪比3和10分别确定检测限和定量限，详细结果见表1。2.4.3精密度考察分别精密吸取混合对照溶液5μl，重复进样6次，新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷峰面积的rsd分别为1.4％、1.3％、0.84％、0.67％、0.47％、0.61％、0.78％、0.60％。2.4.4重复性考察按“2.2”供试品溶液的制备项下方法平行制备6份样品(a厂，批号：161106)供试品溶液，测定新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷8种成分的峰面积，计算含量。结果样品中8种成分含量的rsd分别为1.1％、1.2％、0.93％、0.87％、1.5％、和1.7％。同时记录指纹图谱，以葛根素为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰相对保留时间的rsd＜1.0％，相对峰面积rsd＜2.5％，表明该方法的重复性良好。2.4.5稳定性考察取供试品溶液(a厂，批号：161106)分别间隔0h，6h，12h，18h，30h和40h进样分析，测定新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷8种成分的峰面积，rsd分别为1.3％、0.89％、1.5％、1.7％、0.99％、1.9％、1.0％、1.2％。同时记录指纹图谱，以葛根素为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明共有峰相对保留时间的rsd＜1.0％，相对峰面积rsd＜2.5％，表明这种条件下样品在40h内稳定。2.4.6加样回收率实验精密称取已知含量(新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷分别为：0.05204mg·g-1、0.07200mg·g-1、1.375mg·g-1、0.2780mg·g-1、0.2563mg·g-1、0.2962mg·g-1、0.03705mg·g-1、1.082mg·g-1)的鸢都感冒颗粒样品(a厂，批号：161106)1g，共称取6份，分别精密加入10ml混合对照品溶液2，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下进样测定，计算平均回收率。详细结果见表2.2.5含量测定将“2.2”项下制备的鸢都感冒颗粒的样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，分别计算23个批次样品中新绿原酸、绿原酸、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、甘草苷、大豆苷元、牛蒡苷8种成分的含量，详细结果见表3。表1八种成分的标准曲线和定量限、检测限结果table1calibrationcurves,lodandloqforeightanalytes表2回收率试验(n＝6)table2resultsofrecoveries表3八种成分的含量结果table3contentsofeightcompounds2.6建立鸢都感冒颗粒指纹图谱和标定共有峰2.6.1鸢都感冒颗粒指纹图谱的建立取“2.2”项下23批供试品溶液，精密吸取5μl，按.“2.3”项下色谱条件依次测定，记录23批次鸢都感冒颗粒色谱图。以出峰时间适中和峰面积较大的9号峰葛根素峰作为参照峰，采用国家药典委员会相似度评价系统(2012版)软件对23批鸢都感冒颗粒进行相似度评价，共标定了25个共有峰(图1a)，在剔除样品22后，共标定了31个共有峰(图1b)。图3为23批样品的指纹图谱匹配图。23批样品相似度分别为0.990、0.993、0.992、0.993、0.987、0.995、0.994、0.995、0.990、0.995、0.996、0.991、0.998、0.996、0.990、0.996、0.995、0.996、0.996、0.996、0.997、0.501、0.983，其中22号样品相似度小于0.90，其余均在0.98以上。在250nm时葛根的峰面积占共有峰总面积的77.7％-84.4％左右(除样品22外)，非共有峰占面积比26.77％-34.69％，278nm时葛根的峰面积占比为63.8％-76.3％左右(除样品22外)，非共有峰占面积比19.86％-23.54％，250nm葛根的共有峰占比过大，而非共有峰占比更大。3.评价分析将所得23批样品共有峰和8种成分的含量数据导入matalab(2016版)，进行分析。3.1主成分分析(pca)对收集到的23批样品进行主成分分析，观察样品之间的类别差异。pca主成分得分投影图(图5)，按照hotellingt2检验(α＝0.05，图中椭圆表示0.95的置信限)，22号样品为异常样品，该样品与其他样品存在显著性差异，与相似度的分析结果一致，说明化学组成及含量有显著差异。将13、14和22号峰相对峰面积进行比较(图6a)，22号样品中这些色谱峰的相对峰面积比其他样品的对应色谱峰相对峰面积较大，特别是22号峰。22号样品中13、14和22号峰相对峰面积较大，是由于22号样品的参比峰(9号葛根素峰)面积太小(见图6b)所致。将异常22样品剔除后，剩余样品再进行pca分析，结果如图8a所示，所有样品都在95％的置信限内(hotellingt2)，没有异常样品。虽然23号样品和其他样品来自不同厂家，与1-21号样品有一定差异，5和15号样品也与其他样品有一定差异，但仍在95％的置信限内，差异不显著。3.2聚类分析为观察样品之间是否有类别差异，对不包含22号的其他样品，采用聚类分析结合热图的方法将不同样品进行分析，聚类方法采用ward法。为使各个色谱峰对聚类分析有相近的影响，对峰面积数据进行了归一化。聚类结果如图8a所示，样品大体可以分为3大类，第三类只有一个样品23号。可见，23号样品与1-21号样品来自不同厂家，存在有类别差异，主要表现在该样品的指纹图谱共有峰面积相对较小，对应成分含量较低。虽然1-21号样品来自同一生产厂家，但各批次样品总体可以分为两大类。相对于第二类样品，第一类样品各特征峰的面积相对较大，对应成分含量相对较高，存在批次间差异，如色谱峰1号，2号和13号有较为明显的类别差异。将全部样品(包括22号样品)进行聚类分析，聚类结果见图8b。样品分为3大类，第三类包括样品22号和23号。可见，22号和23号样品与1-21号样品来自不同厂家，存在明显的类别差异，主要表现在该样品的指纹图谱共有峰面积相对较小，对应成分含量较低，其他样品的聚类结果与图8a一致。将8种成分的含量聚类分析及热图分析，见图8c。1-21号样品归为一类，号和23号聚为一类(与图8b所示结果相似)。由聚类分析(图8c)结合成分测定结果(见表3)可见22号及23号样品所有成分均较低，显示这两个厂家与a厂生产的鸢都感冒颗粒存在较大的质量差异。3.3八种成分含量的波动分析将23批样品中八种成分含量的波动情况进行分析，如图9所示。图中间虚线表示每种成分均值，靠近均值的虚线表示均值加减2倍标准偏差(即警戒线)，图最外侧虚线表示均值加减3倍标准偏差(即临界线)，22号及23号样品与1-21号样品八种成分含量的平均水平相比有较大差距。22号样品中只有牛蒡苷的含量在临界线以内，其他成分含量较低，均超出临界线。23号样品中，除了牛蒡苷、大豆苷元、甘草苷及新绿原酸的含量在临界线以内，其他4种成分含量超出临界线。以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。当前第1页1 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