本发明涉及检测领域，特别是涉及保健品中非法添加利巴韦林的检测方法。
背景技术：
利巴韦林化学名为1-β-d-呋喃核糖-1，2，4-三氮唑-3-羟酰胺，是广谱强效的抗病毒药物，主要用于治疗各种病毒性感染疾病，目前广泛应用于普通病毒性疾病的防治。常用剂型有注射剂、片剂、口服液、气雾剂等。现已报道的利巴韦林不良反应有过敏反应、过敏性休克、血液系统反应、神经系统反应、循环系统反应、皮肤黏膜及其附件损伤、致畸、致死胎等。因此，利巴韦林应在医师的指导下服用，且应明确适应证与禁忌证，合理应用。
然而，一些不法分子为了提高所谓的抗病毒疗效，在健康产品尤其是保健品中非法添加利巴韦林，让消费者在不知情的情况下使用，容易发生不良反应，危害公众健康。
对于保健食品中非法添加的利巴韦林的检测，现阶段检测方法主要有以下两类：
（1）仪器检测类：分散固相萃取-高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。样品(胶囊、冲剂、片剂、口服液)提取后，加入固相萃取填料净化，采用强阳离子氢型交换色谱柱进行检测。阳性样品采用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)进行确证。该方法具有准确、灵敏检测药物的优点，但是同时也存在需要配备不方便携带的昂贵仪器、对检测环境有一定要求的局限性，不适用于现场快速检测；
（2）非仪器检测类：薄层色谱法、显色反应、胶体金法均可用于检验保健品中是否非法添加利巴韦林。其特征在于薄层色谱法的缺点是对点板技术有较高要求、边缘效应很难克服、干扰因素多，影响检验结果的准确度。显色反应分析成本低，但该方法专属性不强，灵敏度较差，抗干扰能力差。实验过程中产生的氨臭，气味较大，对人体和环境不够友好，因此使用限制大，另需要沸水浴加热，需配备加热工具，不适合现场快速检测。而且加热操作会出现溶液喷出等现象，不够安全。专利申请号为201711078153.8的一种利巴韦林检测试纸条的专利文献，公开了使用胶体金法对利巴韦林进行检测，但是，该检测方法需要使用专属胶体金卡，胶体金卡制作工艺难度大且不易复制，对技术及环境均有较高要求，而且成本过高，不适用于大批量检测。
技术实现要素：
根据本发明的一个方面，提供了保健品中非法添加利巴韦林的检测方法，包括以下步骤：
步骤a包括
取出样品的内容物，研磨，加入水中，振荡溶解，静置，制得样品溶液；
步骤b包括
向所述样品溶液中加入酚酞乙醇溶液，振荡摇匀，滴入氢氧化钠溶液，振荡摇匀，得混合溶液，观察所述混合溶液颜色变化，进行第一次判定，滴入氢氧化钠溶液后，所述混合溶液变为红色，振荡摇匀后，观察到所述混合溶液的红色未消失，判定样品中无利巴韦林，则终止检测；
当观察到所述混合溶液的红色消失，所述混合溶液的颜色为无色时，进行以下步骤：
步骤c包括
向所述混合溶液中加入叔丁基二苯基氯硅烷、吡啶水溶液和催化剂dmap水溶液，振荡混匀，进行水浴反应；
步骤d包括
向所述水浴反应后的溶液中加入氯仿，振荡混匀，静置后吸取全部上层液体，将所述上层液体转移到反应器皿中，经吹干后用缓冲液复溶，得到复溶液；
步骤e包括
步骤e1，向所述复溶液中加入盐酸溶液，振荡摇匀，加入一定量的氧化钙，振荡摇匀，加入的氧化钙溶解后继续加入，不断重复，直至所述反应器皿中有部分氧化钙不再溶解为止；
步骤e2，立即将湿润的红色石蕊试纸置于所述反应器皿正上方，进行第二次判定，所述湿润的红色石蕊试纸变为蓝色，判定样品中含有利巴韦林。
本发明的有益效果：本发明通过在待测样品中加入酚酞乙醇溶液、氢氧化钠溶液、叔丁基二苯基氯硅烷、吡啶水溶液、催化剂dmap水溶液、氯仿、盐酸溶液和过量氧化钙，使用湿润的红色石蕊试纸，根据两次显色反应，就可以判断样品中是否含有利巴韦林，所用试剂均为普通化学试剂，鉴别方法反应灵敏，专属性强，现象明显，不需要配备大型仪器，操作简单且安全，成本低，适用大批量现场快速检测。本发明对保健品中非法添加利巴韦林的检出限为1.0mg/次。
在一些实施方式中，样品为胶囊、片剂以及散剂中的任意一种。保健品主要以胶囊、片剂和散剂的形式存在，本发明的检测方法适用于检测以胶囊、片剂和散剂的形式存在的保健品。
在一些实施方式中，酚酞乙醇溶液中酚酞的质量分数为5%。用于进行显色反应，进行酸碱指示，当溶液为酸性或中性时，酚酞乙醇溶液为无色，加入氢氧化钠溶液后酚酞乙醇溶液显示红色，说明加入的氢氧化钠为碱性，振荡后，氢氧化钠与原溶液发生反应，原溶液中的利巴韦林释放出氢离子，溶液为酸性，酚酞乙醇溶液红色褪去，变为无色，说明样品溶液中可能存在利巴韦林。
在一些实施方式中，氢氧化钠溶液中氢氧化钠的质量分数为0.01%。使用低浓度的氢氧化钠溶液，在试验操作中安全性高，而且低浓度的氢氧化钠溶液加入到样品溶液中，电离的氢氧根离子较少，被利巴韦林释放的氢离子中和后样品溶液中还有氢离子存在，使酚酞乙醇溶液变为无色，保证第一次判定结果准确。
在一些实施方式中，吡啶水溶液中吡啶的质量分数为50%。质量分数为50%的吡啶水溶液作为反应物参与叔丁基二苯基氯硅烷与利巴韦林的伯醇基团进行反应，对利巴韦林的伯醇羟基进行保护，提高了反应产物的脂溶性，易于被氯仿萃取，提高利巴韦林的有效提取率，降低了检出限。
在一些实施方式中，催化剂dmap水溶液是质量分数为5%的dmap水溶液。质量分数为5%的dmap水溶液用于催化叔丁基二苯基氯硅烷、50%吡啶水溶液与利巴韦林的伯醇基团进行反应，对利巴韦林的伯醇羟基进行保护，提高了反应产物的脂溶性，易于被氯仿萃取，提高利巴韦林的有效提取率，降低了检出限。
在一些实施方式中，盐酸溶液为0.01mol/l的盐酸溶液。与反应产物反应生成氯化铵。
在一些实施方式中，缓冲液是ph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液。用于保护反应产物处于稳定状态。
在一些实施方式中，ph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液由94ml0.2mol/l的乙酸钠溶液与6ml0.3mol/l的乙酸溶液混合均匀制得。用于保护水浴反应的产物处于稳定状态。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中的浓盐酸选择南京化学试剂股份有限公司供应的分析纯浓盐酸，乙酸选择西陇科学股份有限公司供应的分析纯乙酸，乙酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯无水乙酸钠，酚酞选择西陇科学股份有限公司供应的分析纯酚酞，乙醇选择西陇科学股份有限公司供应的分析纯无水乙醇，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，氯仿选择南京化学试剂股份有限公司供应的分析纯三氯甲烷，氧化钙选择南京化学试剂股份有限公司供应的分析纯氧化钙，叔丁基二苯基氯硅烷（tbdpscl）选择阿法埃莎（中国）化学有限公司供应的分析纯叔丁基二甲基氯硅烷，吡啶选择西陇科学股份有限公司供应的分析纯吡啶，dmap（4-二甲氨基吡啶）选择广东翁江化学试剂有限公司供应的分析纯4-二甲氨基吡啶，红色石蕊试纸选择上海三爱思试剂有限公司供应的红色石蕊试纸。
本实施例中的涡旋振荡器选择上海达姆实业有限公司供应的mit135c多管涡旋振荡器，恒温水浴锅选择金坛区华城润华实验仪器厂供应的hh-4a数显恒温水浴锅，氮吹仪选择上海乔跃电子科技有限公司供应的joyn-dcy-24型水浴氮吹仪。
本实施例中需要配制的试剂：
0.01mol/l盐酸溶液：量取0.85ml浓盐酸，用水定容至1l；
0.01%氢氧化钠溶液：称取0.1g氢氧化钠，用水溶解并定容至1l；
ph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液：分别量取94ml0.2mol/l的乙酸钠溶液与6ml0.3mol/l的乙酸溶液，混合均匀即可；
质量分数为50%的吡啶水溶液：称取50g吡啶，与50ml水混合均匀即可；
质量分数为5%的dmap水溶液：称取5gdmap溶解于95ml水中即可；
湿润的红色石蕊试纸：将水滴加在红色石蕊试纸上，使红色石蕊试纸处于湿润状态。
以下实施例2-7均采用本实施例1中的试剂、仪器、试纸、配制的溶液。
实施例2
一种保健品中非法添加利巴韦林的检测方法，包括以下步骤：
步骤a：取出1粒胶囊的样品，取出胶囊内容物，研磨，加入3ml水中，振荡溶解，静置，制得样品溶液；
步骤b：向所述样品溶液中缓慢加入0.01ml酚酞乙醇溶液，振荡摇匀，缓慢滴入0.03ml0.01%氢氧化钠溶液，振荡摇匀，得混合溶液，观察所述混合溶液颜色变化，进行第一次判定，滴入所述0.01%氢氧化钠溶液后，所述混合溶液变为红色，振荡摇匀后，观察到所述混合溶液的红色未消失，判定样品中无利巴韦林，终止检测；
样品溶液加入酚酞乙醇溶液后为无色，说明样品溶液为中性或酸性，加入氢氧化钠溶液后显示红色，说明加入的氢氧化钠为碱性。样品中没有利巴韦林，混合溶液的红色不会消失。
实施例3
一种保健品中非法添加利巴韦林的检测方法，包括以下步骤：
步骤a：取出1粒胶囊的样品，取出胶囊内容物，研磨，加入3.0ml水中，振荡溶解，静置，制得样品溶液；
步骤b：向所述样品溶液中缓慢加入0.01ml酚酞乙醇溶液，振荡摇匀，缓慢滴入0.03ml0.01%氢氧化钠溶液，振荡摇匀，得混合溶液，观察所述混合溶液颜色变化，进行第一次判定，滴入所述0.01%氢氧化钠溶液后，所述混合溶液变为红色，振荡摇匀后，观察到所述混合溶液的红色消失，所述混合溶液的颜色变为无色，判定样品中有可能存在利巴韦林，进行以下步骤。反应式为：
样品溶液加入酚酞乙醇溶液后为无色，说明样品溶液为中性或酸性，加入氢氧化钠溶液后显示红色，说明氢氧化钠提供了氢氧根离子，使酚酞乙醇溶液变为红色。
利巴韦林具有环状结构有较强的吸电子能力，使氧的电子向环状结构移动，从而导致了环上羟基的氧上的电子云密度变小，吸引力减弱，氢容易失去，体现酸性。氢氧化钠作为强碱，在水溶液中可以电离出氢氧根离子。振荡后，利巴韦林释放的氢离子与氢氧化钠的氢氧根离子发生中和反应。由于氢氧化钠浓度很低，溶液中氢氧根离子浓度低于氢离子，氢离子没有被完全中和。所以，混合溶液中如果有利巴韦林，震荡后混合溶液中仍存在氢离子，混合溶液为酸性，酚酞乙醇溶液显示由红色变为无色，可以判定样品中可能含有利巴韦林。
步骤c：向所述混合溶液中加入20mmol叔丁基二苯基氯硅烷、0.5ml质量分数为50%的吡啶水溶液和0.5ml质量分数为5%的dmap水溶液，振荡混匀10min，在35℃条件下进行水浴反应30min；反应式为：
叔丁基二苯基氯硅烷可以保护利巴韦林中的伯醇羟基，同时提高了反应产物的脂溶性，便于后续使用氯仿进行萃取，提高对利巴韦林的有效提取率，降低检出限，提高检测准确性；
步骤d：向所述水浴反应后的溶液中加入2.0ml氯仿，振荡混匀2min，静置，出现分层后吸取全部下层液体，将所述下层液体转移到试管中，经65℃氮气吹干后用1.0mlph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液复溶，得到复溶液；使用氯仿，可以提高对反应产物的萃取量，氯仿容易被吹干，节省检测时间，有助于后续检测进行，提高检测准确性；
步骤e：
步骤e1，向所述复溶液中加入0.5ml0.01mol/l盐酸溶液，振荡摇匀，加入0.2g氧化钙，振荡摇匀20s，加入的氧化钙溶解后继续加入，不断重复，直至所述反应器皿中有部分氧化钙不再溶解为止；反应式为：
加入0.01mol/l的盐酸溶液后，盐酸与利巴韦林的酰胺键发生反应，生成氯化铵，加入过量氧化钙后，在溶液中形成氢氧化钙，氢氧化钙与氯化铵发生反应，生成氨气；
步骤e2，立即将湿润的红色石蕊试纸置于所述试管正上方，进行第二次判定，所述湿润的红色石蕊试纸变为蓝色，判定样品中含有利巴韦林。步骤e1中生成的氨气，从试管口扩散，氨气为碱性气体，遇到湿润的红色石蕊试纸，使红色石蕊试纸变为蓝色。说明样品的成分含有酰胺键。
综上所述，通过本实施例3的方法，检测到样品中既有连接在环状结构上的羟基，又存在伯醇羟基，而且同时还含有酰胺基，利巴韦林同时具有这三个基团。而且在保健品中常用于抗病毒、增强抵抗力的添加成分，主要有金刚烷、金刚乙烷、阿昔洛韦、沙奎那韦、干扰素、利巴韦林。利巴韦林是广谱类抗病毒成分，其他几种成分是非广谱类成分，保健品中很大概率是添加广谱类成分。而且除利巴韦林以外的几种成分，结构均与利巴韦林不同，不可能同时具有以上三个基团。因此只要检测确定样品中的成分同时具有连接在环状结构上的羟基、伯醇羟基和酰胺基，可以确定样品中含有利巴韦林。
实施例4
一种保健品中非法添加利巴韦林的检测方法，包括以下步骤：
步骤a：取出1片片剂样品，研磨，加入4.5ml水中，振荡溶解，静置，制得样品溶液；
步骤b：向所述样品溶液中缓慢加入0.02ml酚酞乙醇溶液，振荡摇匀，缓慢滴入0.04ml0.01%氢氧化钠溶液，振荡摇匀，得混合溶液，观察所述混合溶液颜色变化，进行第一次判定，滴入所述0.01%氢氧化钠溶液后，所述混合溶液变为红色，振荡摇匀后，观察到所述混合溶液的红色消失，所述混合溶液的颜色变为无色，判定样品中有可能存在利巴韦林，进行以下步骤；
步骤c：向所述混合溶液中加入30mmol叔丁基二苯基氯硅烷、0.75ml质量分数为50%的吡啶水溶液和0.75ml质量分数为5%的dmap水溶液，振荡混匀15min，在40℃条件下进行水浴反应30min；
步骤d：向所述水浴反应后的溶液中加入3ml氯仿，振荡混匀3min，静置，出现分层后吸取全部下层液体，将所述下层液体转移到试管中，经70℃氮气吹干后用1.0mlph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液复溶，得到复溶液；
步骤e：
步骤e1，向所述复溶液中加入0.75ml0.01mol/l盐酸溶液，振荡摇匀，加入0.2g氧化钙，振荡摇匀20s，加入的氧化钙溶解后继续加入，不断重复，直至所述反应器皿中有部分氧化钙不再溶解为止；
步骤e2，立即将湿润的红色石蕊试纸置于所述试管正上方，进行第二次判定，所述湿润的红色石蕊试纸变为蓝色，判定样品中含有利巴韦林。
实施例5
一种保健品中非法添加利巴韦林的检测方法，包括以下步骤：
步骤a：取1包散剂的样品，从样品中取出半包内容物进行研磨，加入6ml水中，振荡溶解，静置，制得样品溶液；
步骤b：向所述样品溶液中缓慢加入0.03ml酚酞乙醇溶液，振荡摇匀，缓慢滴入0.05ml0.01%氢氧化钠溶液，振荡摇匀，得混合溶液，观察所述混合溶液颜色变化，进行第一次判定，滴入所述0.01%氢氧化钠溶液后，所述混合溶液变为红色，振荡摇匀后，观察到所述混合溶液的红色消失，所述混合溶液的颜色变为无色，判定样品中有可能存在利巴韦林，进行以下步骤；
步骤c：向所述混合溶液中加入40mmol叔丁基二苯基氯硅烷、1.0ml质量分数为50%的吡啶水溶液和1.0ml质量分数为5%的dmap水溶液，振荡混匀15min，在40℃条件下进行水浴反应30min；
步骤d：向所述水浴反应后的溶液中加入3.0ml氯仿，振荡混匀3min，静置，出现分层后吸取全部下层液体，将所述下层液体转移到试管中，经70℃氮气吹干后用1.1mlph值为5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液复溶，得到复溶液；
步骤e：
步骤e1，向所述复溶液中加入1.0ml0.01mol/l盐酸溶液，振荡摇匀，加入0.2g氧化钙，振荡摇匀20s，加入的氧化钙溶解后继续加入，不断重复，直至所述反应器皿中有部分氧化钙不再溶解为止；
步骤e2，立即将湿润的红色石蕊试纸置于所述试管正上方，进行第二次判定，所述湿润的红色石蕊试纸变为蓝色，判定样品中含有利巴韦林。
实施例6
本实施例中采用内标法，在已知阴性样品中分别按照0.1g、0.5g、1.0g、2.0g共四个添加量梯度添加利巴韦林，得到样品1-4，对添加利巴韦林后的样品按照实施例3的方法进行定性检测，每个试验重复3次，得到以下检测结果，见下表1：
注：lc-ms检测方法的检出限为0.125ppm。
由表1可知，采用实施例3的检测方法对保健品中添加的利巴韦林进行检测，检出限为1.0mg。利巴韦林作为广谱强效的抗病毒药物成分，在口服药物（如：片剂、颗粒剂、胶囊）中的添加规格是20-200mg/次，添加量远远高于实施例3的检出限。因此，在保健品中非法添加利巴韦林，希望达到相应的抗病毒的药效，那么保健品中的非法添加利巴韦林的含量也是大大超出了实施例3的检出限，所以，采用本发明的检出限位1.0mg的检测方法是可以对保健品中非法添加的利巴韦林进行准确检测的。如果保健品中非法添加的利巴韦林低于1.0mg，虽然使用本发明的检测方法无法检出利巴韦林，但是添加量低于1.0mg的利巴韦林对人体健康不会产生不良反应，不会危害公众健康。
实施例7
本实施例中采用内标法，在已知阴性样品中添加1.0mg的利巴韦林，按照不同的试验条件，分别按照实施例3、对比例1和对比例2的方法进行利巴韦林定性检测，每个试验重复3次，得到以下结果，见表2：
注：lc-ms检测方法的检出限为0.125ppm。
由上表2可知，在利巴韦林添加量相同的情况下，实施例3的检测方法中加入叔丁基二苯基氯硅烷，加入的叔丁基二苯基氯硅烷在质量分数为5%的dmap水溶液的催化作用下，在水浴条件下与伯醇羟基发生反应，得到的反应产物的脂溶性提高，可以被氯仿更高效的萃取。从而提高了利巴韦林的有效提取率，保证鉴定结果的准确度。对比例1中没有加入叔丁基二苯基氯硅烷，无法与伯醇羟基反应，氯仿无法对有效成分进行萃取，无法进行后续反应，不能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色，得到错误的检测结果。所以，本发明的检测方法中使用叔丁基二苯基氯硅烷、质量分数为50%的吡啶水溶液和质量分数为5%的dmap水溶液进行反应，可以保证对保健品中非法添加的利巴韦林进行准确定性鉴定。
综上所述，本发明的检测方法是针对于具有抗病毒、增强抵抗力等宣传效果的保健品进行非法添加利巴韦林检测，通过加入低浓度氢氧化钠、酚酞乙醇溶液、叔丁基二苯基氯硅烷、盐酸、氧化钙等，根据溶液颜色变化和石蕊试纸颜色变化来判断样品的成分中是否连接在环状结构上的羟基、伯醇羟基和酰胺基，最终确定保健品中是否非法添加利巴韦林。方法操作简便、快速，专属性强，灵敏度高，检验结果正确率高，检测限为1.0mg，不需要大型的分析仪器，耗时较少，成本低，对实验环境要求低，适用于保健品的快速监督检验，适合普通基层使用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。