一种二维纳米材料作为脱氢酶的应用的制作方法

本发明涉及一种二维纳米材料作为脱氢酶的应用，属于纳米生物学技术领域。

背景技术：

二维纳米材料是指具有纳米片层结构的多元素纳米材料，具有比表面积大，表面活性高的特点。常见的二维纳米材料为氧化石墨烯、含硒化合物、含硫化合物、氮化硼等。二维纳米材料可根据制备方法的不同合成出不同层数/厚度(2-1000nm)的纳米结构，还可以在表面进行官能团的修饰。

二维纳米材料具有良好的电学特性、丰富的表面活性基团，在材料、生物工程等领域具有广泛应用。二维过渡金属二硫化物电子能带结构具有直接的带隙，使其在光致发光、吸收光谱以及光伏效应等性质上相较于过渡金属二硫化物都有所改变。直接的能带带隙对于光的吸收和发散都有很大的影响，其对于光的利用更加完全，利用二维结构对于这种材料对于光敏性能的提升，人们用单层mos2薄膜制作了光电晶体管，单层mos2薄膜也被用于制作led器件。极大的比表面积,较高的近红外区吸收,以及原子序数大是二维纳米材料的另一大特点,基于该特性以mos2，ws2，tis2为代表的二维纳米材料在生物医药领域也被应用于生物成像，肿瘤光热治疗，生物检测等领域。

脱氢酶(dehydrogenase)是生物体内最重要的一类酶，不但参与三羧酸循环，并且是呼吸链上的关键酶，因此经常作为临床诊断中重要的生理生化指标。该类酶通常以nad为辅酶，完成h的转移与传递。例如乳酸脱氢酶将乳酸转化成丙酮酸，乙醇脱氢酶将乙醇转化成乙醛等。然而基于蛋白质的生物酶具有成本高、不易保存(对极端环境如高温、极端ph，高离子强度的抗性差)、在有机试剂中立刻变性，无法重复利用等缺点。因此，发展具有类酶活性的模拟酶是近年来的研究热点。

纳米酶是一类具有类似酶功能催化活性的纳米材料，自2007年被提出以来，受到广泛关注，众多纳米材料被报道具有类酶活性。例如，目前已发现二氧化铈纳米粒、二氧化锰纳米颗粒、氧化铜纳米粒、四氧化三钴纳米颗粒、五氧化二钒纳米线等都具有过氧化物酶催化活性；贵金属(noblemetal)纳米材料同样具有过氧化物酶催化活性，包括金纳米颗粒、铂纳米颗粒以及多金属形成的复合纳米材料等；以石墨烯、富勒烯为代表的碳纳米材料具有核酸酶、超氧化物歧化酶的活性。然而，目前的纳米酶种类有限，只能催化无机氧族(活性氧，过氧化氢，超氧自由基等)的反应，针对生物体系的有机物催化的纳米酶尚未发现。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明利用二维纳米材料的结构和元素特性，实现脱氢酶底物的催化，在无需nad参与的条件下，可将乳酸、乙醇等生命有机体内的重要小分子进行脱氢反应，生成与生物酶相同的反应产物。与蛋白酶比较，二维纳米材料类酶具有可大批量制备、成本高、可多次重复利用、稳定性更强、易于修饰改性等优点。

本发明的第一个目的是提供一种二维纳米材料作为脱氢酶的应用，所述的二维纳米材料为含ivb族、vb族、iva族或via族元素的二维纳米材料。

进一步地，所述的二维纳米材料为厚度为2-1000nm的片层纳米结构。

进一步地，所述的二维纳米材料为snse、ti3c2或nb2c的二维纳米片层。

进一步地，所述的二维纳米材料优选为snse二维纳米片层。

进一步地，所述的snse二维纳米片层是从现有的具有片层结构的块状snse原料中剥离出来的，具有单层结构的纳米材料。随着纳米片的厚度增加，催化活性会下降。

进一步地，所述的应用具体是在氢受体存在的条件下，二维纳米材料催化底物进行脱氢反应。

进一步地，所述的底物具有如下结构通式的化合物中的一种或一种以上组合：

其中，r1、r2独立选自h、醇、酸、醚、醛、磷酯或ch3(ch2)n直链烷烃基团；其中n为0～5中的整数，h为氕、氘或氚，r1、r2不能同时为h。

进一步的，所述的氢受体不局限于蛋白脱氢酶的辅酶(nad，nadp，fad等)。

进一步地，所述的底物为乳酸、甘油三磷酸、苹果酸或乙醇中的一种或一种以上组合。

进一步地，所述的脱氢反应的底物浓度范围为10mm-5m。

进一步地，所述的脱氢反应的温度为4-60℃，离子强度为0-1.5mol/kg，ph为2-11。

进一步地，所述的应用具体用于鉴定细胞代谢产物、检测环境有害物质、环境污染物处理或用于制备预防监控脱氢酶异常指征疾病的产品。

进一步地，所述的应用是配合具有显色特性的氢受体进行应用。

进一步地，所述的具有显色特性的氢受体包含但不局限于3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazolium(mts)、3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(mtt)或脱氢酶活性检测试剂盒。

本发明的有益效果是：

本发明利用二维纳米材料的结构和元素特性，实现脱氢酶底物的催化，在无需nad参与的条件下，可将乳酸、乙醇等生命有机体内的重要小分子进行脱氢反应，生成与生物酶相同的反应产物。本发明所述二维纳米材料可用于替代昂贵的脱氢酶，可应用于生物医药领域，极大程度上降低成本，并且可以用于一些极端环境中，甚至是工业合成的反应中，替代某些关键步骤。

附图说明

图1为二维纳米材料snse(终浓度200μg/ml)在乳酸为底物的前提下可催化mtt、mts、商品化的乳酸脱氢酶检测试剂盒(sigma)发生显色反应，tio2纳米粒为阴性对照，商品化乳酸脱氢酶(ldh,sigma)为阳性对照；cas：显色底物；

图2为二维纳米材料snse使乳酸脱氢酶检测试剂盒发生显色反应，该反应具有浓度依赖性，随着纳米酶浓度的增加，显色反应增强，ldh(200mu/ml)为阳性对照；

图3为以乳酸为底物时snse催化产物的三重四级杆液质联用鉴定，乳酸脱氢酶(ldh)为对照，以丙酮酸标品的出峰时间(1.53min)为对照，二级质谱鉴定产物分子量(pa-h)为87，与丙酮酸相符；

图4为二维纳米材料snse(200μg/ml)与乳酸脱氢酶(ldh，200mu/ml)的重复利用性比较；

图5为snse二维纳米材料催化乳酸的表观酶促反应动力学拟合米氏方程曲线，乳酸脱氢酶(ldh)为对照；

图6为snse二维纳米材料的催化效率随温度，离子强度，有机溶剂浓度和ph的变化，乳酸脱氢酶(ldh)为对照组；

图7为23种纳米材料，六种脱氢酶(乳酸脱氢酶ldh，苹果酸脱氢酶mdh，乙醇脱氢酶adh，乙醛脱氢酶aldh，甘油-3磷酸脱氢酶gpdh，葡萄糖-6磷酸脱氢酶g6pdh)，一种过氧化氢酶的酶活比较；商品化酶均购买自sigma，统一浓度为12.5mu/ml、25mu/ml、50mu/ml、100mu/ml；纳米材料浓度为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml；反应时间0-60min；

图8为snse的脱氢酶活性与商品化脱氢酶的比较，氧化钛纳米粒为阴性对照；

图9为以苹果酸为底物时snse催化产物的三重四级杆液质联用鉴定，苹果酸脱氢酶为对照，以草酰乙酸标品的出峰时间(1.12min)为对照，二级质谱鉴定产物分子量为130.9，与草酰乙酸相符；

图10为以乳酸为底物时nb2c和ti3c2纳米片催化mtt发生显色反应，其脱氢酶活性呈现浓度依赖特性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：snse二维纳米材料具有乳酸脱氢酶活性

试剂：乳酸，乳酸脱氢酶，mtt，ldh活性检测试剂盒，dmso，购自sigma-aldrichinc.。mts购买自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)方法：取分散在水相的snse纳米片层材料(5mg/ml，icp-oes法测定浓度)8μl，配置0.3m乳酸水溶液，用高浓度氢氧化钠将乳酸ph调至中性，取中性乳酸溶液50μl，mtt水溶液(5mg/ml)40μl，或mts溶液(2.5mg/ml)40ul，dmso补足体积至200μl，37℃孵育6h，观察颜色变化。商品化乳酸脱氢酶，取5μl(200mu/ml)，取中性乳酸溶液(0.3m)50μl，中性nad溶液(50mg/ml)50μl，mtt水溶液(5mg/ml)40μl，或mts溶液(2.5mg/ml)，pbs补足体积至200ul，37℃孵育2h，观察颜色变化。

结果如图1所示，结果显示：snse纳米片和乳酸脱氢酶均可以在乳酸为底物的条件下，催化mts、mtt和ldh活性检测试剂盒发生显色反应，证明脱氢反应的发生。

实施例2：snse二维纳米材料的脱氢酶活性符合米氏方程

试剂：乳酸脱氢酶，ldh活性检测试剂盒，dmso，购自sigma-aldrichinc.。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：参照乳酸脱氢酶活性检测试剂盒的说明书，取assaybuffer92μl，取substratemix4μl，加入分散在水相的不同浓度的snse纳米片层材料4μl，或加入商品化乳酸脱氢酶标准品4μl，室温孵育2h，观察颜色变化。

结果如图2所示，结果显示：snse纳米片和乳酸脱氢酶均可以在乳酸为底物的条件下，使乳酸脱氢酶活性检测试剂盒发生显色反应，证明snse纳米片具有类脱氢酶活性，并且该活性具有浓度依赖的特性，随着纳米材料浓度的增加，显色反应增强。

实施例3：snse二维纳米材料催化乳酸的产物鉴定

试剂：乳酸，乳酸脱氢酶，dmso，购自sigma-aldrichinc.；mts购自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：取分散在水相的snse纳米片层材料(5mg/ml，icp-oes法测定浓度)8μl，配置0.3m乳酸水溶液，用高浓度氢氧化钠将乳酸ph调至中性，取中性乳酸溶液50μl，mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，dmso补足体积至200μl，37℃孵育12h，观察颜色变化。商品化乳酸脱氢酶取5μl，取中性乳酸溶液(0.3m)50μl，中性nad溶液(50mg/ml)50μl,mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，pbs补足体积至200ul，37℃孵育6h。将显色后反应产物进行三重四极杆液质联用检测，鉴定反应产物。

结果如图3所示，结果显示：snse纳米片和乳酸脱氢酶均可以在乳酸为底物的条件下，催化mts发生显色反应，并且经由三重四级杆液质联用对产物进行鉴定，证明snse催化反应产生的产物中有丙酮酸生成，与丙酮酸标准品相同，出峰时间为1.53分钟，分子量86.9da。

实施例4：snse二维纳米材料重复利用性能测试

试剂：乳酸，乳酸脱氢酶，dmso，购自sigma-aldrichinc.；mts购自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：取分散在水相的snse纳米片层材料(5mg/ml，icp-oes法测定浓度)8μl，取中性0.3m乳酸溶液50μl，mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，dmso补足体积至200μl，37℃孵育12h，作为一个循环。随后将反应体系进行高速离心，20000rpm,10min离心，回收纳米材料，加入等量底物后进行二次循环，如此反复。取5μl商品化乳酸脱氢酶，取中性乳酸溶液(0.3m)50μl，中性nad溶液(50mg/ml)50μl,mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，pbs补足体积至200ul，37℃孵育12h，作为一个循环。随后将反应体系用超滤管(3kda)进行7500rpm，10min离心，对乳酸脱氢酶进行超滤回收，加入等量底物后进行二次循环，如此反复，直至完全失活。

结果如图4所示，结果显示：snse作为一种纳米类酶具有可以多次利用，循环反应的特点，第四次催化反应后活性才下降至50％以下；而蛋白酶不具有重复利用性，第二次反应活性已不足20％，第四次反应完全丧失活性。

实施例5：snse二维纳米材料催化乳酸的表观酶促反应动力学

试剂：乳酸，乳酸脱氢酶，dmso，购自sigma-aldrichinc.；mts购自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：配置不同浓度的中性乳酸水溶液(0.01-5m)50μl，取snse(5mg/ml)8μl，mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，dmso溶液102μl，加入96孔板，酶标仪检测吸光度490nm，37℃连续检测20min，求斜率作为催化反应的速率，以乳酸脱氢酶为对照。

结果如图5和表1所示，结果显示：以不同乳酸浓度为横坐标，不同底物浓度条件下反应的速率为纵坐标，经origin拟合酶促反应动力学曲线符合米氏方程。分析结果，snse纳米材料表现的酶促反应动力学曲线与乳酸脱氢酶类似，计算得到表观米氏常数km＝1.57m。

表1snse二维纳米材料与乳酸脱氢酶(ldh)动力学参数比较

实施例6：snse二维纳米材料酶学性质

试剂：乳酸，乳酸脱氢酶，dmso，购自sigma-aldrichinc.；mts购自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：取中性乳酸水溶液(0.1m)50μl，取snse(5mg/ml)8μl，mts水溶液(2.5mg/ml，inpbs)40μl，将反应体系调节为不同ph(2-12)的pbs；不同浓度甲醇(0％-100％)与pbs的混合溶液；不同离子强度的氯化钠水溶液(0-3.0mol/kg)，补足体积至200μl，加入96孔板，在不同温度条件下(4℃-90℃)进行反应，连续检测20min，酶标仪检测吸光度490nm，以乳酸脱氢酶为对照。

结果如图6所示，结果显示：snse纳米材料具有与蛋白酶类似的特点，其催化反应活性受温度，ph，有机溶剂浓度和离子强度的影响。但是相比于蛋白酶，纳米类酶对极端条件的耐受性更强。

实施例7：snse二维纳米材料与其他常见纳米材料的酶学特性比较

试剂：ldh活性检测试剂盒、mdh活性检测试剂盒、adh活性检测试剂盒、aldh活性检测试剂盒、gpdh活性检测试剂盒、g6pdh活性检测试剂盒和过氧化氢酶均购自sigma-aldrichinc.；tmb(100mm)，h2o2(10m)购自sigma-aldrichinc.；纳米材料的来源及理化性质见表2。

表2纳米材料的来源及理化性质

方法：每种纳米材料分别按照25、50、100、200μg/ml的终浓度进行配制，按照试剂盒的说明书加入反应体系，以试剂盒中相应的商品化蛋白酶为对照，37℃，反应时间0-60min。蛋白酶终浓度为12.5、25、50、100mu/ml。

结果如图7所示，以heatmap表现酶活，以蛋白酶最高浓度(100mu/ml)的酶活进行归一化。传统的纳米酶如fe3o4、ag、au、ceo2等具有过氧化物酶活性，但是并不具有任一脱氢酶活性，其他常见的纳米材料包括二维纳米材料、碳纳米材料、金属氧化物等也不具有脱氢酶活性。说明纳米材料的类脱氢酶活性不仅与材料的二维结构有关，也受元素组成的影响。

实施例8：snse二维纳米材料的酶活专一性

试剂：ldh活性检测试剂盒、mdh活性检测试剂盒、adh活性检测试剂盒、aldh活性检测试剂盒、gpdh活性检测试剂盒、g6pdh活性检测试剂盒和过氧化氢酶均购自sigma-aldrichinc.。

方法：snse(5mg/ml)8ul，按照试剂盒说明书要求加入反应体系，以相应试剂盒的buffer补足反应体积至200μl，以商品化蛋白酶作为阳性对照，tio2纳米粒为阴性对照，37℃反应2h后，检测酶活。

结果如图8所示，snse具有ldh、adh、mdh和gpdh的脱氢活性，其酶活效率与200μg/ml的蛋白酶具有可比性。

实施例9：snse二维纳米材料催化苹果酸生成草酰乙酸产物鉴定

试剂：苹果酸脱氢酶检测试剂盒，购自sigma.；mts购自promega。使用的二维snse纳米材料是通过密度梯度离心法制备(joohoonkang,jung-woot.seo,diegoalducin,arturoponce,migueljoseyacamanandmarkc.hersam,naturecommunication,2014,5:5478.)

方法：取分散在水相的snse纳米片层材料(5mg/ml，icp-oes法测定浓度)8μl，按照商品化苹果酸脱氢酶活性检测试剂盒的说明书要求，加入反应体系中，37℃孵育2h，发生明显的显色反应，与试剂盒提供的苹果酸脱氢酶阳性对照结果相近。将显色后的产物经20000rpm，5min离心，去除纳米材料，再经超滤去除蛋白后，进行三重四极杆液质联用检测，鉴定反应产物。

结果如图9所示，结果显示：snse纳米片和苹果酸脱氢酶均可以在苹果酸为底物的条件下，催化反应生成草酰乙酸，经鉴定生成的草酰乙酸与标准品相同，出峰时间为1.12分钟，分子量130.9da。

实施例10：nb2c、ti3c2二维纳米材料具有乳酸脱氢酶活性

试剂：乳酸，mtt购买自sigma。使用的二维nb2c和ti3c2纳米材料是依据参考文献合成(hanlin,youweiwang,shanshangao,yuchen,andjianlinshi，advancedmaterials,2018,30,1703284.)

方法：取分散在水相的nb2c和ti3c2纳米片层材料(5mg/ml，icp-oes法测定浓度)梯度稀释至终浓度25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，配置0.1m乳酸水溶液，用高浓度氢氧化钠将乳酸ph调至中性，取中性乳酸溶液40μl，mtt水溶液(5mg/ml)40μl，水补足体积至200μl，37℃孵育6h，观察颜色变化。

结果如图10所示，结果显示：nb2c和ti3c2纳米片层材料可以再乳酸为底物的条件下，催化mtt发生显色反应，生成的紫色甲瓒结晶用dmso复溶后，测吸光度490nm检测酶活。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。