一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法与流程

本发明涉及一种测定前列腺癌特异靶标肌氨酸的检测方法，具体涉及一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法。本发明属于化学检测领域。

背景技术：

前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤之一，特别随着中国社会老龄化的加剧，前列腺癌确诊率和死亡率随之升高，因此对前列腺癌患者的早期筛查能显著提高和改善患者的生存率。现有的对前列腺癌诊断方法主要基于前列腺特异抗原（psa）进行，其检测灵敏度和特异性存在较大问题，假阳性率和假阴性率皆较高，许多患者因此进行了不必要的活检，造成了巨大的痛苦。因此急需一种新的标志物检测方法和有效的筛查手段。

2009年，一项试点研究创建了一种非侵入性方法来识别前列腺癌的存在和发展过程，并表明甘氨酸的代谢物-肌氨酸-可以在患者尿液和血液中检测，可以作为前列腺癌预测的标志物。传统的肌氨酸测定方法有：电化学方法（中国专利：一种用于肌氨酸的电化学检测方法，公开号：cn106596693a。）；电泳法：（中国专利：一种肌氨酸的检测方法，公开号：cn101718746a。）；荧光光谱法：（中国专利：定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒，公开号：cn101587076a。）；色谱质谱法（文献：areproducibleandhigh-throughputhplc/msmethodtoseparatesarcosinefromα-andβ-alanineandtoquantifysarcosineinhumanserumandurine.anal.chem.83(2011):5735-5740）。这些技术的主要缺点仪器成本高，样品制备复杂熟练操作人员要求，不适合日常操作分析，因此急需研发一种灵敏、稳定的肌氨酸的检测方法。

对肌氨酸直接测定比较困难，可以采用肌氨酸氧化酶（sarcosineoxidase，sox）和辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，hrp）这一级联酶，利用催sox催化肌氨酸生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢，进一步利用hrp催化过氧化氢生成显色反应从而对肌氨酸含量进行测定。然而溶液中sox与hrp处于无序状态，随机的底物碰撞显著降低了级联反应的催化效率。金属有机框架（mofs）是一类由无机金属中心（金属离子或金属簇）与有机配体通过自组装相互连接，形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料。特别的zif-8材料具备较大的比表面积、较好的生物相容性、稳定的化学和物理性能的优点，在载药、催化、生物传感和物质富集及分离测定等领域的应用极具潜力。因此利用zif-8材料包裹sox和hrp，设计一种限域的级联酶的结构，对肌氨酸进行检测具有较高的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法。

本发明目的通过下述方案实现：一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定，具体包括以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.1~0.5mgsox和0.2~0.5mg的hrp溶解于1ml2-甲基咪唑（2-mim，1m）水溶液，使sox与hrp的质量比为1:1~1:5，于室温下混合均匀后孵育10分钟，随后，在混合液中快速加入1ml醋酸锌或硝酸锌（20mm）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜，混合液于5000rpm/min离心15min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr，然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液；

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置显色反应底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（abts，10mm），配置肌氨酸（5-100µm）溶液，冰浴保存，打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线，依次取10µl肌氨酸溶液，10µlabts显色溶液与70µlpbs溶液（ph7.4），混合均匀，转移至比色皿中，随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

在上述方案基础上，sox与hrp的更佳质量比为1:3。

在本发明的技术方案中，设计zif-8材料包裹肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，肌氨酸氧化酶可以催化肌氨酸生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢。进一步地，氧化氢酶可催化过氧化氢氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（abts）生成蓝绿色的自由基阳离子（abts^.+）从而实现检测信号的输出。

本发明为一种限域级联酶结构从而对肌氨酸进行测定的方法，通过mofs材料包裹肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，促使sox和hrp限制在数百纳米的空间内，通过酶促级联反应产生的化学发光信号从而定量肌氨酸的浓度。该方法可调控级联酶的距离，提高级联酶反应速率，具有较高的灵敏度，可快速对血液和尿液中肌氨酸含量进行定量检测。

本发明的优点在于：

（1）本发明采用zif-8包附sox与hrp。zif-8具有较大的比表面积和多孔孔道，有益于溶液中反应底物穿过孔道与sox和hrp反应，并且利于底物在酶周围富集，增加局部的底物浓度；

（2）同时zif-8的包裹使sox与hrp限制在数百纳米范围内，调控了sox与hrp的间距，sox催化肌氨酸产生的过氧化氢可以有效传递给hrp进行显色反应，提高反应级联酶反应速率。

附图说明

图1为实施例1中制备的pvp-sox-hrp@zif-8的透射电镜表征图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。

实施例1

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定，按以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.1mgsox和0.2mg的hrp溶解于1ml浓度为1m的2-甲基咪唑（2-mim）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1ml浓度为20mm的醋酸锌溶液中，混合均匀后，室温机械搅拌过夜。混合液于5000rpm/min离心15min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr；然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液。采用tem表征所得pvp-sox-hrp@zif-8纳米结构，其尺寸约在130nm范围。见图1，为本实施例制备的pvp-sox-hrp@zif-8的透射电镜表征图。

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置10mmabts溶液，配置5-100µm肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µl各浓度肌氨酸溶液，分别10µlabts显色溶液与70µlpbs溶液（ph7.4）混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

实施例2

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.1mgsox和0.3mg的hrp溶解于1ml浓度为1m的2-甲基咪唑（2-mim）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1ml浓度为20mm的醋酸锌溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000rpm/min离心15min得到的沉淀物，采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr；然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液。

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置10mmabts溶液，配置5-100µm肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µl肌氨酸溶液，10µlabts显色溶液与70µlpbs溶液（ph7.4），混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

实施例3

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.2mgsox和0.3mg的hrp溶解于1ml浓度为1m的2-甲基咪唑（2-mim）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1ml浓度为20mm的醋酸锌溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000rpm/min离心15min得到的沉淀物采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr；然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液；

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置10mmabts溶液，配置5-100µm肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µl各浓度肌氨酸溶液，分别与10µlabts显色溶液和70µlpbs溶液（ph7.4）混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

实施例4

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.2mgsox和0.5mg的hrp溶解于1ml2-甲基咪唑（2-mim，1m）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟；随后，在混合液中快速加入1ml醋酸锌（20mm）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000rpm/min离心15min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr；然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液；

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置10mmabts溶液，配置5-100µm肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线。依次取10µl肌氨酸溶液，10µlabts显色溶液与70µlpbs溶液（ph7.4），混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

实施例5

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：

（1）zif-8包裹sox和hrp：

称取0.1mgsox和0.4mg的hrp溶解于1ml2-甲基咪唑（2-mim，1m）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟。随后，在混合液中快速加入1ml醋酸锌（20mm）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜。混合液于5000rpm/min离心15min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2%pvp（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr。然后，以转速5000rpm/min离心20min，收集pvp稳定的sox-hrp@zif-8，将沉淀分散于2ml磷酸盐缓冲液中（pbs，ph7.4），即可得到pvp-sox-hrp@zif-8溶液。

（2）肌氨酸含量测定：

用pbs配置10mmabts溶液，配置5-100µm肌氨酸溶液，冰浴保存。打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线。依次取10µl肌氨酸溶液，10µlabts显色溶液与70µlpbs溶液（ph7.4），混合均匀，转移至比色皿中。随后加入10µlpvp-sox-hrp@zif-8溶液，混合均匀后，反应10min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。