基于Ts31基因的旋毛虫抗体检测试纸条及其应用的制作方法

本发明属于胶体金免疫层析检测领域，涉及一种旋毛虫抗体检测试纸条及其制备方法与应用。

背景技术：

猪旋毛虫病是由毛首目毛形科的旋毛形线虫成虫寄生于猪的小肠、幼虫寄生于横纹肌而引起的严重危害人类健康的畜牧业发展的人畜共患寄生虫病。猪是人感染旋毛虫病的重要来源之一，人主要因食用生的或未煮熟含有活的旋毛虫幼虫的肉品而感染。本病分布于世界各地，对人类健康造成很大威胁，同时对养猪业、肉食品加工业、外贸出口业也造成了巨大的经济损失，是我国肉品首检和必检项目。在旋毛虫流行还不断扩大的形势下，要控制旋毛虫病的流行发展，必须要研发出有效的检测旋毛虫的方法。

我国检测猪旋毛虫病的国标方法是在屠宰过程中取猪膈肌，进行压片镜检或者对猪肉消化法检查虫体，虽然比较直观，但检出率低而且费时费力，且无法进行屠宰前诊断，影响生猪产业发展。目前旋毛虫诊断主要有血清学诊断（凝集试验、间接荧光抗体试验、沉淀试验、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析试纸条法）和分子生物学诊断（常规pcr、pcr构象多态性分析、多重pcr、实时荧光定量pcr）。其中分子生物学诊断方法均需要严格的实验室环境，特殊的试验条件，且不能够同时检测大量样本。血清学诊断方法中间接荧光抗体试验、沉淀试验同样对试验的环境、条件要求较高。酶联免疫吸附试验目前是诊断旋毛虫病最常用的方法之一，且方法简单，不需要特殊的环境，但是需要专业的人员进行操作，时间上也相对较长。

旋毛虫肌幼虫的蛋白es是诊断旋毛虫病最常使用的诊断抗原，被国际旋毛虫病委员会推荐通过elisa方法检测血清中的旋毛虫抗体，但其在旋毛虫感染早期检出率较低，容易出现假阴性，并且与其他寄生虫病感染者之间存在交叉反应。因此，寻找新的特异性早期诊断抗原就显得尤为重要。研究表明，ts31基因在旋毛虫各发育阶段（成虫、初生幼虫、成囊前期幼虫和肌幼虫）均有表达。免疫定位分析发现ts31存在于旋毛虫的角质层和粘液细胞中。ts31-elisa检测旋毛虫病患者血清中抗旋毛虫igg抗体的敏感性显著高于es抗原elisa，可以作为重要的旋毛虫诊断抗原使用。

本发明采用高度纯化的ts31重组抗原作为诊断抗原，结合胶体金免疫层析技术，制备旋毛虫抗体检测试纸条产品，具有敏感性高、特异性强、方法简便、快速实用等特点，且屠宰猪的旋毛虫病检测结果与酶联免疫吸附试验符合率高达100%。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于ts31基因的旋毛虫抗体检测试纸条，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜、吸水垫和背板，所述样品吸收垫上有加样孔；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的spa（金黄色葡萄球菌蛋白a）；所述反应膜上有检测区和质控区，其中检测区包被旋毛虫ts31重组蛋白，所述旋毛虫ts31重组蛋白是使用ts31基因构建重组表达质粒pet28a-ts31，经大肠杆菌表达系统表达纯化获得的；所述质控区包被鸡抗spa。

上述胶体金试纸条中，所述样品吸收垫材质为滤血膜；所述胶体金垫材质为玻璃纤维素膜；所述反应膜材质为硝酸纤维素膜；所述吸水垫材质为吸水纸；所述背板为pvc。

本发明还提供了上述旋毛虫抗体检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）旋毛虫ts31重组蛋白的制备：以旋毛虫cdna文库为模版，针对旋毛虫ts31基因序列设计特异性引物，通过pcr扩增目的片段并克隆至表达载体pet28a，将成功构建的重组表达质粒pet28a-ts31转化至大肠杆菌bl21（de3）中，iptg诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到ts31重组蛋白；

2）胶体金垫的制备：将金标记的spa喷涂在胶体金垫上，真空抽干后干燥保存备用；

3）检测区和质控区的制备：将步骤1）中获得的旋毛虫ts31重组蛋白稀释为1.0mg/ml的ts31溶液与1.5mg/ml鸡抗spa分别喷涂在反应膜上，形成检测线与质控线，37℃干燥16h，密封保存备用；

4）试纸条的组装：在背板上沿试纸条的轴向依次将样品吸收垫、胶体金垫、反应膜、吸水垫粘贴在背板上，制成试纸条。

上述胶体金试纸条中，步骤1）所述旋毛虫ts31重组蛋白制备时所用的引物如序列表的序列1-2所示，旋毛虫ts31重组蛋白核酸序列如序列表的序列3所示。

上述胶体金试纸条中，步骤2）所述喷涂，喷膜量为1.5μl/cm。

上述胶体金试纸条中，步骤3）所述喷涂，喷膜量为0.8μl/cm。

本发明还提供了上述旋毛虫抗体检测试纸条在旋毛虫病检测中的应用。

上述胶体金试纸条中，是指将待测血清用样品稀释液稀释后，加入到试纸条加样孔中，10min后观察显色区，判定结果。质控线显色，检测线不显色，判为阴性；质控线显色，检测线线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阳性；质控线不显色，无论检测线线是否显色，该试纸条均判为无效。

本发明利用旋毛虫ts31重组蛋白建立的旋毛虫抗体检测试纸条具有较高的敏感性和特异性，且操作简单、快速、结果易判读，易保存，便于同时检测大量样本，实用性较强。在旋毛虫病的抗体水平检测、流行病学调查方面提供了重要方法。

附图说明

图1为旋毛虫抗体检测试纸条结构示意图；其中1为背板；2为样品吸收垫；3为胶体金垫；4为反应膜；5为检测区；6为质控区；7为吸水垫；a为加样孔；b为视窗。

图2为旋毛虫抗体检测试纸条检测结果判定示意图；其中a为阳性结果；b为阴性结果；c为无效。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、旋毛虫抗体检测试纸条的制备

1、旋毛虫抗体检测试纸条的组成

旋毛虫抗体检测试纸条由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜、吸水垫和背板组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的spa；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（t线）和质控区（c线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被旋毛虫ts31重组蛋白，质控区包被鸡抗spa。

样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

2、旋毛虫抗体检测试纸条的制备

1）旋毛虫ts31重组蛋白的制备：

a.引物设计

根据genebank中u01847.1序列设计引物：

ts31-f：ggatccgaaaatgcaactgagac

ts31-r：aagcttttagccttgcttagagagca

下划线部分为引入的bamhi和hindiii酶切位点。

b.提取旋毛虫肌幼虫总rna

按rnaisoplus（totalrna）提取试剂盒说明书进行提取，简单如下：

①样品的研磨和匀浆：将旋毛虫肌幼虫约100mg放入研钵，加1mlrnaisoplus溶液充分研磨1min，将匀浆液转移至离心管中，室温（20-25℃）静置5min；12000g4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）；

②totalrna的提取：向上述匀浆裂解液中加入0.2ml氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色；室温静置5min；12000g4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含rna）、中间的白色蛋白层（大部分为dna）及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）；

③rna沉淀的清洗：向上清中加入1ml的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。12000g4℃离心10min，试管底部会出现rna沉淀。小心弃去上清，切勿触及沉淀。加入与1ml的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀；

④rna的溶解：打开离心管盖，室温干燥沉淀5min。沉淀干燥后，加入50μl的rnase-free水溶解沉淀；

1％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取总rna的完整性，核酸蛋白测定仪检测其纯度。稀释各组样品总rna浓度至100ng/μl，-70℃保存备用。

c.逆转录反应获得cdna

取肌幼虫总rna0.3μg，加入如下反应体系：5×m-mlv反应缓冲液5μl，dntp1μl，m-mlv逆转录酶1μl，rna酶抑制剂0.5μl，oligo(dt)1μl，加入rnaase-free水至25μl。混匀42℃水浴60min。

d.表达载体的构建

①pcr扩增31kda抗原基因片段：pcr反应体系：ddh2o36.5μl，10×pcr反应冲液5μl，dntp1μl，taqdna聚合酶0.5μl，上、下游引物各2μl，cdna模板3μl。95℃预变性5min，95℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，经30个循环后72℃终延伸10min；胶回收pcr产物。

②双酶切目的基因ts31和质粒dna：目的基因酶切反应体系：目的基因10μl，bamhi酶2μl，hindiii酶2μl，10×双酶切反应缓冲液2μl，ddh2o4μl。pet28a质粒酶切反应体系：pet28a质粒dna(pet28a)10μl，bamhi酶2μl，hindiii酶2μl，10×双酶切反应缓冲液2μl，ddh2o4μl。37℃水浴120min，胶回收酶切产物。

③连接双酶切后的目的基因片段与pet28a质粒片段：连接反应体系：目的基因片段4μl，pet28a质粒片段1.5μl，t4dna连接酶1μl，10×连接反应缓冲液1μl。16℃连接过夜。

④转化dh5a感受态细胞：将连接产物采用低温氯化钙共沉淀法转化ecolidh5a感受态细胞，取单菌落进行pcr鉴定和测序。

⑤转化bl21（de3）感受态细胞：将测序正确菌株，提取pet28a-ts31表达载体，采用化学转化法转化bl21（de3）感受态细胞，取单菌落进行pcr鉴定和保种。

e.重组蛋白诱导表达与纯化

取10ml表达菌株菌液接种于新鲜lb（50μg/ml，kana）培养液中，于37℃摇床180r/min振荡培养至菌液od600为0.4～0.6时，加入终浓度为1mm的iptg，37℃诱导表达6h。将iptg诱导后的1l菌液收集，5000rpm4℃离心20min，弃去上清，沉淀用20mlpbs悬起，超声破碎（工作4s，间歇5s，时长35min），8000rpm4℃离心30min，吸取上清。

f.高度纯化ts31重组蛋白：

采用亲和层析和分子筛层析高度纯化ts31重组蛋白，具体的方法如下：

缓冲液：50mmph7.4的pbs缓冲液（19ml0.5mnah2po4，81ml0.5mna2hpo4，29.3gnacl，溶于水，定容至1000ml）。

①亲和层析纯化：镍琼脂糖凝胶装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；用缓冲液平衡2-5个床体积，流速为2ml/min；将20ml大肠杆菌细胞破碎液（50mmpbs，ph7.4，0.5mnacl）0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；用缓冲液再洗2-5个床体积，流速为2ml/min；用分别含30、80、120、500咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰；纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4~8℃环境中保存；sds-page检测不同浓度咪唑洗脱液中目的蛋白的大小、纯度，分装后，-80℃保存备用。

②分子筛纯化：使用美国gehealthcare公司的aktapurifier100系统预装sephadexg-75柱进一步纯化表达蛋白。将sephadexg-75柱与akta系统连接，流速为1ml/min，用5-10个柱体积的0.02mol/l磷酸缓冲液（ph6.5）平衡sephadexg-75柱至紫外吸收曲线平稳；紫外吸收峰调零后用0.1ml上样环进行蛋白上样，使用0.02mol/l磷酸缓冲液（ph6.5）进行洗脱，调节流速为0.2～0.5ml/min，打开收集器每10min收集一管（3ml/管）。sds-page验证大小和纯度，将相似管进行合并；依次经透析及3kda超滤管浓缩后即得到旋毛虫ts31重组蛋白，经sds-page检验纯化结果。

2）样品吸收垫的制备：将1张滤血膜浸泡于400ml滤血膜处理液（1.5gs9，1gtween-20，2gbsa，0.4g酪蛋白钠，100μlproclin300，溶于20mlmtris-hcl缓冲液，定容至200ml）待其浸湿完全后将滤血膜取出，放置于35℃~37℃的恒温干燥箱中，烘干16h，然后将其放入铝箔袋中，并加入适量干燥剂，真空抽干后干燥保存备用。

3）反应膜的制备：取ts31重组蛋白和包被缓冲液（海藻糖0.25g，0.1ml1mtris-hcl，0.02mlproclin300，溶于纯化水，定容至10ml），制成1ml终浓度为1.0mg/ml的检测线划膜液。准确量取鸡抗spa和包被缓冲液适量，制成1ml终浓度为1.5mg/ml的质控线划膜液。设置喷金划膜仪的喷膜量为0.8μl/cm，检测线划在距膜底端8mm处，质控线与检测线相距4mm。将质控线划膜液和检测线划膜液均匀的喷涂在nc膜上，35℃~37℃恒温干燥16h，烘干后备用。

4）胶体金垫的制备

移取90ml纯化水至洁净三口烧瓶中，600rpm的速度搅拌，水浴加热至100℃。加入4ml1%氯金酸溶液（1g氯金酸溶于30ml纯化水，定容至100ml），待温度升至100℃之后加入5ml1%柠檬酸三钠水溶液（1.25g柠檬酸三钠溶于30ml纯化水，定容至125ml），溶液变为葡萄酒红色后，继续匀速搅拌加热15min，静置待其自然冷却至室温，用纯化水恢复至100ml，得到溶液ⅰ。

分别移取溶液ⅰ和纯化水各15ml置于烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，用移液器缓慢加入450μl的0.1mk2co3溶液后，加入72μl的spa溶液（1ml10mg/mlspa蛋白溶于适量纯化水，定容至10ml）搅拌30min，再加入750μl封闭液（2gbsa溶于适量纯化水溶解，定容至10ml）搅拌30min。10000rpm离心30min，弃上清液，收集沉淀，用1.5ml复溶液（0.075gpvp-40，1.5g蔗糖，0.15gbsa，0.15ml1mtris-hcl（ph8.5）缓冲液，8μlproclin300，溶入5ml纯化水，定容至15ml）复溶，得到溶液ⅱ。

将1张胶体金垫浸泡于200ml胶体金垫处理液（pvp-151g，bsa2g，海藻糖2g，蔗糖4g，2ml1mtris-hcl缓冲液，100μlproclin300，溶于50ml纯化水，定容至200ml）中，待其浸湿完全后取出，35℃~37℃恒温干燥16h，取出装入铝箔袋中并加入适量干燥剂，真空抽干后干燥保存备用。

量取1.5ml溶液ⅱ，以1.5μl/cm的喷金量，用喷金仪将其均匀喷涂到处理剪裁后的胶体金垫上后35℃~37℃恒温干燥16h，然后取出放入铝箔袋中，并加入适量干燥剂，真空抽干后干燥保存备用。

5）组装：将样品吸收垫、胶体金垫、反应膜、吸水垫粘贴到pvc背板的对应位置上，吸水垫覆盖反应膜2mm；胶体金垫覆盖反应膜2mm；样品吸收垫覆盖胶体金垫2mm，用斩切机裁成宽度为4mm的试纸条，即可检测。

3、旋毛虫抗体检测试纸条性能验证

1）敏感性：分别使用3个批次旋毛虫抗体检测试纸条检测5份猪旋毛虫阳性质控品、15份检测为阳性的临床血清样品，同时使用集体消化法对上述血清样品相对应的20份猪只膈肌样品进行检测，比较检测结果。

集体消化法检测方法

消化液的配制：胃蛋白酶10g，盐酸10ml，定容至1000ml，40℃搅拌均匀；

采集膈肌：每头猪取1个肉样（100g），将肉样放入组织捣碎机内捣碎；

检测：肉样放入消化液中，比例为1:20，40~43℃搅拌30~60min；过80目筛，滤液沉淀10~20min，分几次将沉淀物放于凹面皿中；沿凹面皿边缘，用吸管加入37℃温自来水，沉淀1~2min吸出液体，反复多次后将带有沉淀物的凹面皿放入显微镜下捕捉虫体、包囊等，发现虫体时再对这一样品采用分组消化法进一步复检（或压片镜检），直到确定病猪为止。

旋毛虫抗体检测试纸条与集体消化法检测结果如表1所示，均为阳性，与集体消化法一致，敏感性100%。

表1敏感性检验结果

2）特异性：分别使用3个批次旋毛虫抗体检测试纸条检测5份猪旋毛虫阴性质控品、1份猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性样品（c1）、1份猪伪狂犬病病毒抗体阳性样品（c2）、1份猪蛔虫病抗体阳性样品（c3）、1份猪弓形虫病抗体阳性样品（c4）、1份猪圆环病毒2型抗体阳性样品（c5）、15份临床血清样品，同时使用集体消化法对上述血清样品相对应的25份猪只膈肌样品进行检测，比较检测结果。旋毛虫抗体检测试纸条与集体消化法检测结果如表2所示，阴性质控、c1、c2、c3、c4、c5样本均符合，临床样品有1份不符合，表明该试剂盒特异性96%，且与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性样品、猪伪狂犬病病毒抗体阳性样品、猪蛔虫病抗体阳性样品、猪弓形虫病抗体阳性样品、猪圆环病毒2型抗体阳性样品无交叉。

表2特异性检验结果

3）重复性：使用同一个批次的旋毛虫抗体检测试纸条检测5份猪旋毛虫阳性质控品、5份猪旋毛虫阴性质控品、1份猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性样品（c1）、1份猪伪狂犬病病毒抗体阳性样品（c2）、1份猪蛔虫病抗体阳性样品（c3）、1份猪弓形虫病抗体阳性样品（c4）、1份猪圆环病毒2型抗体阳性样品（c5）及15份临床血清样品，比较检测结果，计算批内重复性；使用3个批次的旋毛虫抗体检测试纸条检测上述样品，比较检测结果，计算批间重复性。旋毛虫抗体检测试纸条重复检测结果如表3、表4所示，样品检测结果100%符合。

表3批内重复性检验结果

表4批间重复性检验结果

4）稳定性：对旋毛虫抗体检测试纸条成品及其组分中的样品稀释液进行长期稳定性试验和加速稳定性试验，长期试验条件为2~30℃，频率为0个月、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、15个月，结果显示样品稀释液和成品分别在18个月和15个月检测结果未见明显变化；加速试验条件为37℃，频率为0日、1日、2日、3日、6日、12日、15日、18日，结果显示样品稀释液和成品分别在18日和15日内未见明显变化。综合长期试验和加速试验，旋毛虫抗体检测试纸条保存期定为2~30℃保存12个月。

5）符合率：分别使用3个批次旋毛虫抗体检测试纸条检测100份临床血清样品，同时使用集体消化法对上述血清样品相对应的100份猪只膈肌样品进行检测，比较检测结果。旋毛虫抗体检测试纸条符合率验证结果如表5-表7所示，本研究建立的三批旋毛虫抗体检测试纸条与集体消化法检测结果符合率均大于95%。

表5批20180501产品检测血清与集样消化法结果

表6批20180502产品检测血清与集样消化法结果

表7批20180503产品检测血清与集样消化法结果

实施例2、旋毛虫抗体检测试纸条检测旋毛虫病

1、样品前处理

将全血室温3000rpm离心5min，得血清或血浆。

2、检测

取出试纸条，开封后平放于桌面，使用本产品附带滴管吸取待检样品，缓慢地滴加2滴到装有样品稀释液（0.045gna2edta，3μlproclin300，溶于2ml0.01mpbst，定容至3ml）的滴瓶内，盖上瓶盖，摇晃混匀，用滴瓶缓慢、逐滴的滴加3滴稀释后的样品于样品孔中。加样10min后，观察显色区，判定结果，15min后的结果无效。

结果判断标准：阴性：c线显色，t线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阳性；阴性：c线显色，t线不显色，判为阴性；无效：c线不显色，无论t线是否显色，该试纸卡均判为无效。

序列表

<110>北京维德维康生物技术有限公司

<120>基于ts31基因的旋毛虫抗体检测试纸条及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>ts31-f(artificialsequence)

<400>1

ggatccgaaaatgcaactgagac23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>ts31-r(artificialsequence)

<400>2

aagcttttagccttgcttagagagca26

<210>3

<211>798

<212>dna

<213>ts31(trichinellaspiralis)

<400>3

gaaaatgcaactgagactcttgcattagtatacaaaccagtgcagcaaggttcaaaacgt60

gtacttggcattgcatgtcagggtacaattgttccaggaaaacatcaaaaccacactgat120

actgttttggtatcgtcatactgcattatggaagatccgccggaaggttatgttgtcagt180

gtcggttctcctgatcctcatggagatcttcaatcaagtgcaaaacagttcagggcgcaa240

cgaattctaaattttccattcgaaaaacatccagttggaattttgaaaactccacaacct300

atcatttacagtgatacagttcaacctatgtgcatagcaagcgttcctttaccagatgaa360

catgcatgcataatgggagttgtaacaaagggaggtttaatgacactgcgtcatgtgcaa420

atgttatatgaaagtgattgtgaaccacttgcggaaggtttgagttcatacttgtgtgca480

aaagtgaaagaaattgatgcagaagtaggtgaaactcttggtctagatccatcaatggat540

atatatccattttctgctccacttgattttgatatcaatggtgtaaaagctggaagtatg600

gaaaatccactattctgtcttaccaatgagcatccaacatggtcagtttacggatttgca660

ttaaatgcatataatgtaacagatcctgaaagtcctattttgttttctgatgtatcaagt720

gatctgacagccataaaagaacacagtgacatcagttatcagcaatgggtacaacgtatg780

ctctctaagcaaggctaa798