一种检测抗PD-1抗体表达阳性免疫效应细胞的方法及其应用与流程

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种检测抗pd-1抗体表达阳性car-t细胞的方法及其应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(car)是一类杂合抗原受体，一部分是抗体，另一部分是tcr，包括了胞外抗原结合区域胞内信号传导结构域。通过将衍生自肿瘤特异性抗体的单链抗体(single-chainvariablefragment,scfv)作为car的胞外抗原结合结构域，表达car的t细胞(car-t细胞)被赋予了全新的抗原靶向性。靶向肿瘤相关抗原的car基因通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mrna电转被转导进入淋巴细胞内，并表达融合的car蛋白于细胞表面，使形成的car-t淋巴细胞能够通过非mhc限制性的方式识别特定肿瘤相关抗原，从而增加其识别和杀伤肿瘤的能力。car-t细胞在治疗血液肿瘤上虽然取得了较为显著的效果，但是在治疗实体瘤的过程中遇到了很多困难，其中一个重要原因是pd-1/pd-l1抑制性免疫检查点通路在肿瘤细胞中的激活。pd-1是一种免疫抑制性受体，属于cd28家族成员的ⅰ型跨膜蛋白，在激活的t细胞、b细胞、单核细胞和树突状细胞表面广泛表达。pd-1结构上与ctla-4有30％的同源性,胞内区存在两个酪氨酸残基,分别参与构成了n端的一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotif,itim)和c端的一个免疫受体酪氨酸依赖的转换基序(immunoreceptortyrosin-basedswitchmotif,itsm)；胞外区则是由一个igv样结构域组成,含有多个糖基化位点并被重度糖基化,该结构域可以与配体结合,从而发挥抑制t细胞活化的功能。pd-l1又名cd274,属于b7家族的成员命名为b7同源1(b7-h1)。pd-l1在活化的t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肿瘤细胞广泛表达。pd-1与pd-l1结合促使pd-1的itsm结构域中的酪氨酸发生磷酸化,进而引起下游蛋白激酶syk和pi3k的去磷酸化,抑制下游akt、erk等通路的活化,最终抑制t细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译,发挥负向调控t细胞活性的作用。多项研究发现，恶性肿瘤中，肿瘤细胞、肿瘤间质细胞及免疫细胞表面都存在着pd-1表达上调。此外肿瘤微环境中细胞因子的异常分泌，如干扰素g的过度分泌可以诱导肿瘤细胞表面及其他细胞pd-l1的过度表达，而过表达pd-l1的细胞可以通过pd-1/pd-l1通路或其他未知机制逃脱t细胞的免疫监控，还可以诱导t细胞凋亡，或者导致t细胞免疫耗竭。因此，car-t细胞进入肿瘤组织后的功能失活是car-t细胞治疗实体瘤的一个重要障碍。而通过将pd-1抑制剂，如pd-1抗体与car-t细胞联用能够减少肿瘤细胞对t细胞的抑制作用，显著提高car-t细胞的肿瘤杀伤效果，目前已经成为car-t治疗方法的一个重要方向。pd-1抗体是pd-1抑制剂中使用频率最高，使用范围最为广泛的一种。pd-1抗体与car-t细胞联用的方法之一是构建自表达分泌型抗pd-1抗体的car-t细胞，即在t细胞的基因组上整合了car基因之外再进一步整合表达分泌型抗pd-1单链抗体(single-chainvariablefragment,scfv)(“表达pd-1抗体的靶向间皮素嵌合抗原受体修饰t细胞治疗胆道恶性肿瘤初步探索”倪庆强苏州大学博士学位论文2017.5)。与联合pd-1单抗药物使用的方法相比，自表达分泌型pd-1scfv的car-t细胞的优势在于1)抗pd-1抗体药物价格高昂，能够显著降低治疗的成本，；2)由于car-t细胞自身表达分泌型抗pd-1抗体，pd-1抗体在肿瘤组织局部的浓度较高，并且与car-t细胞的物理距离较近，能够更有效解除肿瘤细胞对car-t细胞的免疫抑制作用，促进car-t细胞对肿瘤的杀伤；3)目前pd-1单抗药物尚未在中国上市，已经向中国提交上市申请的企业也仅有3家(bms、默克和信达生物)，即使在今后这3家企业的pd-1单抗在中国上市，可预见的近期能够供选择使用的抗pd-1抗体的药物种类也比较有限，而自表达的分泌型抗pd-1抗体一般为单链抗体，结构上更简单，可以有更多的选择。当采用自表达分泌型抗pd-1抗体的car-t细胞这种策略时，分泌型抗pd-1抗体在car-t细胞中表达的阳性率则成为重要的指标。在car-t细胞中表达抗pd-1scfv可以采用car与抗pd-1scfv融合表达(enhancedcancerimmunotherapybychimericantigenreceptor-modifiedtcellsengineeredtosecretecheckpointinhibitors.lis,siriwonn,zhangx,yangs,jint,hef,kimyj,macj,luz,wangs,hanx,wangpclincancerres.2017nov15；23(22))或分开表达两种方式。融合表达的优势在于抗pd-1scfv与car基因同框融合表达，在car阳性的t细胞中抗pd-1scfv的表达也肯定是阳性，无需进一步检测，但缺陷在于增加了car基因表达框的长度，对car基因的表达产生了负担，并且当采用慢病毒包装法制备car-t细胞时表达框长度过长还会增加病毒包装的负担，降低病毒包装效率。car与抗pd-1scfv分开表达能够克服上述缺陷，但由于是分别表达，抗pd-1scfv的表达阳性率需要另外单独检测。因此，本领域迫切需要开发一种检测抗pd-1scfv在car-t细胞中表达的阳性率的检测方法。技术实现要素：本发明的目的就是提供一种特异性好、假阳性率低的检测抗pd-1抗体表达阳性car-t细胞的方法。在本发明的第一方面，提供了一种用于检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的检测试剂，所述检测试剂包括：特异性结合于抗pd-1抗体或偶联于抗pd-1抗体的标记物，所述抗pd-1抗体为所述免疫效应细胞分泌的。在另一优选例中，所述免疫效应细胞选自car-t细胞、car-nk细胞、car-til细胞、car-cik细胞、car-巨噬细胞和tcr-t细胞、或其组合。在另一优选例中，所述免疫效应细胞包括car-t细胞。在另一优选例中，所述抗pd-1抗体为融合蛋白。在另一优选例中，所述抗pd-1抗体具有式i所示的结构:a-b-c(i)式中，a为抗pd-1的单链抗体(scfv)；b为任选的连接元件；c为fc片段；并且，“-”为连接肽或肽键。在另一优选例中，所述的scfv的结构如式a1或a2所示：vl-vh(a1)；或vh-vl(a2)其中，vl为抗pd-1抗体的轻链可变区；vh为抗pd-1抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。在另一优选例中，所述的vl和vh通过柔性接头相连。在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个，更佳地，3-4个)连续的(g)4s所示的序列。在另一优选例中，vl的氨基酸序列如seqidno.:4的第21-131位所示，且vh的氨基酸序列如seqidno.:4的第147-266所示。在另一优选例中，所述连接元件的长度为1-50nt，较佳地，1-30nt。在另一优选例中，所述fc片段选自下组：igg4fc、igg1fc、igg2fc或其组合。在另一优选例中，所述抗pd-1的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.:4所示。在另一优选例中，编码抗pd-1的单链抗体的核苷酸序列如seqidno.:3所示。在另一优选例中，所述特异性结合于抗pd-1抗体或偶联于抗pd-1抗体的标记物为pd-1抗原，所述pd-1抗原的货号为h82e4。此处货号为h82e4的商品为acrobiosystems公司的生物素标记的pd-1抗原在另一优选例中，所述检测试剂为抗pd-1抗体的抗体，所述抗pd-1抗体的抗体购自金斯瑞公司，货号为a01853-40。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞包括car免疫细胞和car非免疫细胞。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞选自下组：t细胞、nk细胞、cik细胞、nkt细胞、或其组合。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞包括：hek-293t细胞、jurkat细胞、或其组合。在另一优选例中，所述阳性免疫效应细胞特异性表达抗间皮素的car。在另一优选例中，所述抗间皮素的car具有式ii所示的结构：l-scfv-h-tm-c-cd3ζ-z-p(ii)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；l为无或信号肽序列；scfv为靶向间皮素的单链可变区序列；h为无或铰链区；tm为跨膜结构域；c为共刺激信号分子；cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列；z为任选的自剪切蛋白的编码序列；p为包含抗pd-1抗体的融合蛋白的编码序列。在另一优选例中，所述自剪切蛋白包括t2a。在另一优选例中，所述融合蛋白具有式i所示的结构:a-b-c(i)式中，a为抗pd-1的单链抗体(scfv)；b为任选的连接元件；c为fc片段；并且，“-”为连接肽或肽键。在另一优选例中，所述的scfv的结构如式a1或a2所示：vl-vh(a1)；或vh-vl(a2)其中，vl为抗pd-1抗体的轻链可变区；vh为抗pd-1抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。在另一优选例中，所述的vl和vh通过柔性接头相连。在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个，更佳地，3-4个)连续的(g)4s所示的序列。在另一优选例中，vl的氨基酸序列如seqidno.：4的第21-131位所示，且vh的氨基酸序列如seqidno.:4的第147-266位所示。在另一优选例中，所述的scfv为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的单链抗体可变区片段。在另一优选例中，所述l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、csf2rb、cd4、cd137、il-2、ifnr、或其组合。在另一优选例中，所述h为选自下组的蛋白的绞链区：cd8、cd28、cd137、cd80、cd86、或其组合。在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。在另一优选例中，所述的c为cd28和/或4-1bb(cd137)来源的共刺激信号分子。在本发明的第二方面，提供了一种检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的试剂盒，所述检测试剂盒包括：(t1)第一容器，以及位于第一容器内的检测试剂，所述检测试剂为特异性结合于抗pd-1抗体或偶联于抗pd-1抗体的标记物，所述抗pd-1抗体为car-t细胞分泌的；和(t0)说明书。在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：pd-1抗原、抗pd-1抗体的抗体、或其组合。在另一优选例中，所述的检测试剂是抗pd-1抗体的抗体。在另一优选例中，所述抗pd-1抗体的抗体购自金斯瑞公司，货号为a01853-40。在另一优选例中，所述的检测试剂为acrobiosystems公司的生物素标记的货号为h82e4的pd-1抗原。在另一优选例中，所述的检测试剂带有可检测标记。在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光。在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂：(t2)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂；(t3)第三容器，以及位于所述第三容器内的阳性对照(如pd-1carscfv重组蛋白)；和(t4)第四容器，以及位于所述第四容器内的阴性对照试剂。在另一优选例中，所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。在另一优选例中，所述的说明书记载了检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的方法。在本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的检测试剂的用途，用于制备检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞包括car免疫细胞和car非免疫细胞。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞选自下组：t细胞、nk细胞、cik细胞、nkt细胞、或其组合。在另一优选例中，所述的阳性免疫效应细胞包括：hek-293t细胞、jurkat细胞、或其组合。在本发明的第四方面，提供了一种检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的方法，包括步骤：(i)提供本发明第一方面所述的检测试剂；(ii)用所述的检测试剂对待检测的免疫效应细胞群进行检测，从而获得抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的定性或定量检测结果。在另一优选例中，所述方法为体外检测方法。在另一优选例中，所述方法为流式细胞术检测方法。在另一优选例中，所述方法是非诊断性和非治疗性方法。在另一优选例中，所述方法是质控方法。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了靶向间皮素结构域iii的car与抗pd-1抗体的结构示意图。图2显示了生物素标记的抗pd-1抗体通过流式细胞计数法检测表面抑制性表型pd-1抗原的表达结果。图2a为mock-t细胞的检测结果；图2b为meso-car-t-antipd1细胞的检测结果。图3显示了生物素标记的抗间皮素抗体、生物素标记的抗pd-1抗体的抗体、pe标记的羊抗人igg4fc抗体通过流式细胞计数法检测meso-car-t-antipd1阳性率结果对比。图3a显示用间皮素结构域iii抗原测得的间皮素car阳性细胞的比例；图3b显示用抗pd-1抗体测得的pd-1抗体阳性表达细胞的比例。图4显示了用抗pd-1抗体的抗体、igg4fc抗体与间皮素结构域iii抗原流式细胞仪检测阳性car-t细胞的结果。图4a为用抗pd-1抗体的抗体检测pd-1分泌阳性的meso3car-t细胞结果；图4b为用igg4fc抗体检测pd-1分泌阳性的meso3car-t细胞的结果；图4c为用间皮素结构域iii抗原检测间皮素结构域iiicar表达阳性细胞的结果。图5显示了用pd-1抗原流式细胞仪检测抗pd-1抗体分泌阳性的meso3car-t细胞的结果。图5a显示用pd-1抗原检测mock-t细胞的结果；图5b显示不同用量的pd-1抗原检测自分泌抗pd-1抗体的meso3car-t细胞的结果。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地开发了一种对分泌型抗pd-1scfv在细胞中表达的阳性率的检测灵敏度高、特异性好且假阳性率低的检测试剂。实验结果表明，本发明的检测试剂检测特异性远高于其他检测试剂，此外，本发明的检测试剂对于抗pd-1阳性免疫效应细胞的亲和力更高。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用，术语“car”是指嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。如本文所用，"单链可变区片段(scfv)"是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scfv的实例包括经重组dna技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(h链)和轻链(l链)片段的fv区经由间隔序列连接。改造scfv的各种方法是本领域技术人员已知的。检测用途本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。试剂盒本发明还提供了一种用于检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞试剂盒，所述检测试剂盒：(t1)第一容器，以及位于第一容器内的检测试剂，所述检测试剂为特异性结合于抗pd-1抗体或偶联于抗pd-1抗体的标记物，所述抗pd-1抗体为car-t细胞分泌的；和(t0)说明书。在另一优选例中，所述的检测试剂选自下组：pd-1抗原、抗pd-1抗体的抗体、或其组合。在另一优选例中，所述的检测试剂是抗pd-1抗体的抗体。在另一优选例中，所述抗pd-1抗体的抗体为金斯瑞公司货号为h82e4的抗pd-1抗体的抗体。在另一优选例中，所述的检测试剂带有可检测标记。在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光。在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括含有一种或多种选自下组的额外的检测试剂：(t2)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂；(t3)第三容器，以及位于所述第三容器内的阳性对照(如pd-1carscfv重组蛋白)；和(t4)第四容器，以及位于所述第四容器内的阴性对照试剂。在另一优选例中，所述的额外的检测试剂位于相同或不同的容器中。在另一优选例中，所述的说明书记载了检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的方法。检测方法本发明还提供了一种基于本发明抗体，对阳性免疫效应细胞进行检测的方法。由于本发明的抗体对于相匹配或相应的car的抗原结合区有高亲和力和高特异性，因此本发明的多抗可用于高效、灵敏而准确地检测阳性免疫效应细胞。对于可用本发明方法检测的阳性免疫效应细胞，代表性的例子包括(但并不限于)：t细胞、nk细胞、nkt细胞、cik细胞等多种不同细胞。本发明的检测方法，可用于科研、细胞药品研发、细胞药品质量控制，细胞药品临床治疗监测、临床病人伴随诊断等方面。本发明的主要优点包括：(1)基于本发明抗体开发的试剂盒检测灵敏度高、特异性好。(2)使用本发明的抗体检测抗pd-1scfv表达阳性的细胞相比于使用抗igg4fc片段抗体或pd-1抗原检测假阳性率低，检测结果更加准确。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。通用方法本发明实施例用到的抗体或抗原来源如下：pd-1抗原购自acrobiosytems，货号为h82e4；抗pd-1抗体的抗体购自金斯瑞，货号：a01853-40；pe标记的抗igg4fc抗体购自abcam，货号：ab99825；链霉素-pe购自bd，货号为554061；expicho表达系统试剂盒购自thermofisher，货号：a29133mabselectsuretmlx购自gehealthcare，货号：17547403抗cd28抗体：购自abcam，货号：ab88034间皮素结构域iii抗原的制备方法如下：人工合成seqidno:5所示的序列，连接到pcdna3.4载体多克隆位点，构建得到过表达间皮素结构域iii抗原与igg4fc片段融合蛋白的表达载体。根据expichotm表达系统说明书，使用expichotm表达系统对上述融合蛋白进行过表达后，使用gehealthcare的mabselect亲和层析树脂按说明书操作步骤对表达产物进行纯化，具体如下：1.细胞复苏与培养从液氮罐中取出一支expicho-s细胞，按程序复苏到125ml锥形瓶内，并加入30ml预热的expicho表达培养基，细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％co2的湿化空气条件下)培养，摇床转速设置为125rpm。三天后，取样计数，当细胞密度达到4×106-6×106个活细胞/ml时，进行细胞传代。2.细胞转染与蛋白收集按下表配制转染体系培养瓶体积125ml所需细胞量1.5×108转染的培养物体积25mloptiprosfm①1mlexpifectaminecho试剂80μloptiprosfm②920μlexpicho增强剂150μlexpicho辅料(标准)③6mlexpicho辅料(高滴度)6mlexpicho辅料(最大滴度)④第1天和第5天，4ml最终培养体积～35ml将质粒dna按重链﹕轻链＝1﹕1；总质粒dna为0.8ug/ml转染培养体积，加入25ml调节细胞密度为6×106个活细胞/ml，配置expifectaminecho/质粒dna混合物，室温孵育上述expifectaminecho/质粒dna混合物1-5分钟，加入细胞悬液中，细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％co2的湿化空气条件下)培养。转染后18-22小时，吸取50μl的细胞悬液计数、并按比例添加expifectaminecho增强和expicho辅料。转染后第8-10天，结束培养，4000rpm离心30min澄清本次转染的细胞悬液，然后进行深层过滤。3.蛋白纯化mabselectsurelx亲和层析3.1准备：将mabselectsurelx层析柱装在对应akta纯化仪上，确认层析柱填料为：mabselectsurelx，确认层析柱型号以及填料体积；打开akta纯化仪，打开unicorn软件并连接仪器。3.2清洗平衡：用纯化水冲洗系统管路后，使用20mmpb平衡层析柱，xk16×20柱平衡流速不大于6ml/min，xk50×20柱平衡流速不大于30ml/min；平衡体积2-3cv，直到紫外基线及电导基线走平。3.3紫外校零：确认紫外吸收波长为280nm并按autozero键进行紫外校零。3.4上样：确认样品名称、编号、体积、ph后上样。上样流速：xk16×20柱不大于6ml/min，xk50×20柱不大于30ml/min；根据表达量和柱体积计算上样体积，保证填料载量不超过6mg/ml，并记录实际上样体积。3.5淋洗：使用20mmpb进行淋洗，淋洗流速xk16x20柱不大于6ml/min，xk50×20柱不大于30ml/min，淋洗体积3-5cv，直到紫外基线及电导基线走平，紫外吸收值小于10mau。3.6洗脱：25mm、ph＝3.0的柠檬酸进行样品洗脱，洗脱流速xk16x20柱不大于6ml/min，xk50×20柱不大于30ml/min，收集紫外吸收＞10mau的洗脱峰，记录收集样品体积。3.7层析柱清洗保存：纯化水清洗2cv，0.1mnaoh清洗2cv，然后20％乙醇清洗2cv后封存层析柱，并置于2-8℃冰箱储存。3.8低ph孵育灭病毒：亲和层析收集到的样品室温静置1-1.5h，用1mph为8的tris缓冲液调节ph到5.0。3.9除菌过滤；0.22μm除菌过滤，可选用针式滤器、500ml过滤瓶(corning)或者1l过滤瓶(corning)。3.10样品保存：贴好标签：产品编号-m，置于2-8℃冰箱保，如果存放时间超过一周，需冻存于-20℃或-40℃冰箱。抗pd-1单链抗体(pd-1scfv)的制备方法：人工合成seqidno:3所示的序列，连接到pcdna3.4载体多克隆位点，构建得到过表达pd-1单链抗体与igg4fc片段融合蛋白的表达载体。其余同上述间皮素结构域iii抗原的制备方法。对间皮素结构域iii抗原、pd-1抗原、抗pd-1抗体的抗体和igg4fc抗体的生物素标记具体委托金斯瑞公司进行，标记方法按本领域常规的方法进行。实施例1.表达靶向间皮素的car的重组表达载体和表达抗pd-1单链抗体的重组表达载体的构建委托上海捷瑞合成meso3car基因的核苷酸序列(含有cd8信号肽、抗间皮素单链抗体、igg4ch2ch3铰链区、cd8跨膜区、cd28胞内结构域和cd3ζ的酪氨酸活化基序，其核苷酸序列如seqidno:1所示，编码的氨基酸序列如seqidno:2所示)，将其装入pnb328载体的ecori和sali酶切位点之间(pnb328的结构及序列参见cn201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，构建出的重组质粒命名为pnb328-meso3-car，结构模式图如图1所示。委托上海捷瑞合成抗pd-1scfv基因的核苷酸序列(含vl、接头、vh、igg4ch2ch3铰链区和igg4fc区)，其核苷酸序列如seqidno:3所示，编码的氨基酸序列如seqidno:4所示)，将其装入ps328载体(与pnb328相比，ps328缺少pb转座子序列，其它元件与pnb328载体相同)的ecori和sali酶切位点之间，构建得到质粒ps328-antipd-1，结构模式图如图1所示。实施例2.靶向间皮素的car-t细胞与自表达分泌型pd-1抗体的靶向间皮素的car-t细胞的制备外周血单核细胞(pbmcs)由ficoll分离法分离获得。将pbmc贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始t细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min,弃生理盐水，并重复此步骤；取2个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a和b，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(购自lonza公司)，a、b管按比例加入电转试剂共100μl，a管加入构建好的重组质粒pnb328-meso3car4μg，b管加入重组质粒pnb328-meso3car和ps328-antipd-1各4μg；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％fbs的aim-ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％co2培养箱培养，六小时后加入刺激因子il-2至终浓度为500iu/ml，并加入间皮素iii抗原与抗cd28抗体至终浓度均为0.5μg/ml，37℃，5％co2培养3～4天，观察t细胞的生长情况，获得靶向间皮素的car-t细胞meso3car-t与自表达分泌型pd1抗体的靶向间皮素的car-t细胞meso3car-t-antipd1。此外，在另一离心管中加入5×106个细胞，编号c，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自lonza公司)，按比例加入电转试剂共100μl，并加入pnb328空载和ps328空载各4μg，按前文所述方法构建得到对照t细胞，即mock-t细胞。实施例3.表面表达抑制性表型抗原pd-1的meso3car-t-antipd1细胞的检测1、生物素标记的pd-1抗体溶于pbs中配置成浓度为1mg/ml的工作液；2、分别取mock-t，meso3car-t-antipd1细胞各1×106个，1000rpm离心3min，弃去上层培养基，向2种细胞中分别加入2μl生物素标记的抗pd-1抗体工作液，37℃、5％co2孵育1h；3、用冷pbs洗涤步骤1孵育后的细胞三次，再次用100μl生理盐水重悬细胞，加入1μl的链霉素-pe，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤三次以后用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，分析各细胞表面pd-1抗原的表达。结果如图2a(mock-t)与图2b(meso3car-t-antipd1)所示。与mock-t细胞的0.62％相比，meso3car-t-antipd1细胞的pd-1抗原表达的阳性率有明显提升，达到25.81％，表明与mock-t细胞相比，meso3car-t-antipd1细胞中被激活细胞的比例明显升高。实施例4.间皮素阳性的meso3car-t与抗pd-1scfv阳性meso3car-t-antipd1细胞的检测1、生物素标记的抗pd-1抗体的抗体与生物素标记的间皮素iii抗原溶于pbs中配置成浓度为1mg/ml的工作液。2、分别取mock-t、meso3car-t和meso3car-t-antipd1细胞各2份，每组中每种细胞取1×106个，1000rpm离心3min，弃去上层培养基，向一份mock-t、meso3car-t和meso3car-t-antipd1细胞每种细胞中分别加入2μl步骤1的生物素标记的间皮素结构域iii抗原工作液，向另一份mock-t、meso3car-t和meso3car-t-antipd1细胞中分别加入2μl生物素标记的抗pd-1抗体工作液，37℃、5％co2孵育1h；3、用冷pbs洗涤步骤2孵育后的两组car-t细胞三次，再次用100μl生理盐水重悬细胞，加入1μl的链霉素-pe，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤三次以后用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，分析各car-t细胞的阳性率。结果如图3所示。图3a显示用间皮素结构域iii抗原测得的间皮素car阳性细胞的比例，meso3car-t细胞，meso3car-t-antipd1细胞明显高于对照组mock-t细胞的间皮素car阳性比例；图3b显示用抗pd-1抗体测得的pd-1抗体阳性表达细胞的比例，meso3car-t-antipd1细胞中的抗pd-1抗体阳性细胞的比例明显高于mock-t细胞与meso3car-t细胞的抗pd-1抗体阳性比例。实施例5.不同抗体检测抗pd-1scfv阳性meso3car-t-antipd1细胞阳性的特异性将生物素标记的抗pd-1抗体的抗体与间皮素结构域iii抗原溶于pbs中配置成浓度为1mg/ml的工作液。取mock-t细胞和meso3car-t-antipd1细胞各3份，每份1×106个，分为抗pd1抗体的抗体组、ig4fc抗体组和间皮素结构域iii抗原组，每组包括1份mock-t细胞和1份meso3car-t-antipd1细胞，1000rpm离心3min弃去上层培养基，向以上3组的每份细胞中分别加入2μl生物素标记的抗pd-1抗体的抗体、2μlpe标记的抗igg4fc抗体和2μl生物素标记的间皮素结构域iii抗原，37℃、5％co2孵育1h，用冷pbs洗涤细胞三次后，抗igg4fc抗体组直接用流式细胞仪检测荧光强度。抗pd1抗体的抗体组和间皮素结构域iii抗原组再次用100μl生理盐水重悬细胞，加入1μl的链霉素-pe抗体，4℃孵育30分钟，生理盐水洗涤三次以后用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图4所示。图4a显示抗pd1抗体的抗体检测组，图4b显示igg4fc抗体检测组，图4c显示间皮素结构域iii抗原检测组。图4a中，meso3car-t-antipd1细胞抗pd-1scfv表达阳性细胞的比例为31.56％，低于图4b显示的igg4fc抗体检测组中meso3car-t-antipd1细胞抗igg4fc细胞39.85％的阳性率。图4c显示间皮素car阳性细胞的比例约为39.85％。同时，图4a中的meso3car-t对照细胞的阳性率0.75％也远低于图4b中的meso3car-t对照细胞的阳性率9.15％，这表明与抗igg4fc抗体相比，本发明选用的抗pd-1抗体的抗体检测抗pd-1抗体表达阳性的car-t细胞特异性更好，能够有效地降低假阳性率。对比例1.不同剂量pd-1抗原检测抗pd-1scfv阳性meso3car-t-antipd1细胞阳性的特异性将生物素标记的pd-1抗原溶于pbs中配置成浓度为1mg/ml的工作液。取mock-t细胞1份，1×106个，meso3car-t-antipd1细胞3份，每份1×106个，1000rpm离心3min弃去上层培养基，向mock-t细胞加入2μl生物素标记的pd-1抗原，向meso3car-t-antipd1细胞分别加入1μl，2μl，5μl生物素标记的pd-1抗原，37℃、5％co2孵育1h，用冷pbs洗涤细胞三次后，每组用100μl生理盐水重悬细胞，加入1μl的链霉素-pe抗体，4℃孵育30分钟，生理盐水洗涤三次以后用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图5所示。图5a显示用pd-1抗原检测mock-t细胞的结果；图5b显示不同用量的pd-1抗原检测自分泌抗pd-1抗体的meso3car-t细胞的结果。根据图5的结果，使用不同剂量pd-1抗原测得的meso3car-t-antipd1细胞的car阳性率高于mock-t组，且随剂量升高而升高，但是与使用抗pd1抗体的抗体组，以及抗igg4fc抗体组相比比例仍然非常低，说明本发明选用的抗pd-1抗体的抗体与pd-1抗体的亲和力更高，在与pd-1抗原的竞争中占据优势，能较准确地鉴定出表达pd-1抗体的阳性细胞。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海细胞治疗集团有限公司上海细胞治疗研究院<120>一种检测抗pd-1抗体表达阳性免疫效应细胞的方法及其应用<130>p2018-0979<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2049<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gccaccatggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagatacc60accggagaggtgcagctggtggagtccgggggaggcctggtccagcctgggggatccctg120agactctcctgcgcagcctctggattcgacctcggtttctacttttacgcctgttgggtc180cgccaggctccagggaagggcctggagtgggtctcatgcatttatactgctggtagtggt240agcacgtactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccagagacaattcgaag300aacacgctgtatctgcaaatgaacagtctgagagccgaggacacggccgtgtattactgt360gcgagatctactgctaatactagaagtacttattatcttaacttgtggggccaaggcacc420ctggtcaccgtctcctcaggcggaggcggatcaggtggtggcggatctggaggtggcgga480agcgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtc540accatcacttgccaggccagtcagaggattagtagttacttatcctggtatcagcagaaa600ccagggaaagttcccaagctcctgatctatggtgcatccactctggcatctggggtcccc660tcgcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcag720cctgaagatgttgccacttactactgtcagagttatgcttattttgatagtaataattgg780catgctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaagagtccaaatatggtcccccatgc840ccaccatgcccagcacctcccgtggccggaccatcagtcttcctgttccccccaaaaccc900aaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagc960caggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgcc1020aagacaaagccgcgggaggagcagttccagagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc1080gtcctgcaccaggactggctg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