本发明属于体外诊断
技术领域：
，涉及一种样本前处理试剂及其应用，尤其涉及一种去除生物素干扰的样本前处理试剂及其构建的化学发光试剂盒和应用。
背景技术：
：磁微粒是指粒径在纳米至微米尺度的超顺磁材料，常作为免疫反应的固相载体。将抗体(或抗原)以共价或非共价方式包被在磁微粒表面形成的免疫磁微粒，可参与免疫反应，并借助磁微粒的超顺磁性实现免疫复合物的相分离，实现简便、快捷的体外诊断。链霉亲和素是一种四聚体蛋白质，与小分子生物素具有强亲和性，两者可以在短时间内形成链霉亲和素-生物素复合物，且复合物一旦形成、便很难解离开来。因此，链霉亲和素和生物素常做为桥体结构参与免疫反应。例如，标记有链霉亲和素的抗体和标记有生物素的辣根过氧化物酶可在短时间内形成抗体-链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物。链霉亲和素磁微粒指表面共价包被有链霉亲和素的磁微粒，可用于抓取标记有生物素的抗体(或抗原)分子，形成磁微粒-链霉亲和素-生物素-抗体(或抗原)免疫磁微粒复合物，进一步参与后续免疫反应。基于链霉亲和素的免疫技术操作方便，已广泛深入应用于体外诊断行业。生物素又名维生素b7，是存在于人体中的一种常规物质，正常情况下，患者样本(如血清、脑脊液)中的低水平生物素不会对基于链霉亲和素磁微粒的体外诊断技术造成干扰。随着生活水平提高，越来越多的人开始服用复合维生素等膳食补充剂，大剂量服用此类膳食补充剂导致人体内的生物素水平过高，可对基于链霉亲和素磁微粒的体外诊断技术造成干扰，导致误诊。生物素干扰是近年才显现出来的一个问题，学术界和工业界尚未见良好解决方法。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种样本前处理试剂及其应用，所述样本前处理试剂预先结合样本中的生物素，解决了免疫检测中存在的生物素干扰问题，由此制备的试剂盒具有准确性好、检测速度快、灵敏度高、自动化程度高的优势，有利于为真菌感染疾病的快速临床诊断提供有力依据。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种样本预处理试剂，所述样本预处理试剂包括链霉亲和素磁微粒和/或抗游离生物素抗体。本发明中，在进行真菌抗原的检测过程中，为避免待测样本中的生物素对结果造成的影响，首先将待测样本采用样本预处理试剂进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再进行抗原检测，消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰，显著提高了检测的准确性。本发明采用链霉亲和素磁微粒进行样本预处理，吸附样本中的游离生物素，并借助磁微粒的超顺磁性实现相分离，脱除了生物素的样本用于下一步检测。本发明中，采用抗游离生物素抗体进行样本预处理，中和样本中的游离生物素，但不与共价偶联在抗体(或抗原)上的生物素发生结合，使用该试剂后无须进行相分离，可直接用于下一步检测。优选地，所述样本预处理试剂还包括pbs和/或proclin-300。优选地，所述pbs缓冲液的浓度为0.01～0.05m，所述proclin-300作为防腐剂的浓度为0.1％～0.5％。第二方面，本发明提供了一种化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的样本预处理试剂。优选地，所述试剂盒还包括捕获抗体和信号抗体。优选地，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗真菌抗原的单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区包括如seqidno:2所示的氨基酸序列；seqidno:1：mtltcfcartisktstrltgleyigmisgatvdlkmygmdlwgpgtlvtvssvqcqsveevsgfslssyitnyyyvrqapgkdmnwvtyvtpgtplsggntgetglrwlllvavlkgyanwtspttedtangrf；seqidno:2：mdtraptqllgatfaivmtqseacagykytgllllnrlancqatevvvkwlpgtwyqftltisdgsvpvcdqdatlasgvpsrfkgsgatyytpssvggtidsqkpgssgtqvgdtvppkliafgliyqsvysn。本发明中，所述单克隆抗体为兔源抗念珠菌甘露聚糖的单克隆抗体，特异性好、稳定性好，解离常数相对于鼠源单克隆抗体小，与念珠菌甘露聚糖的亲和力强，可以快速与念珠菌甘露聚糖进行结合，有利于缩短检测时间。优选地，所述单克隆抗体的重链可变区包括如seqidno:3所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区包括如seqidno:4所示的氨基酸序列；seqidno:3：mevsgfslssyitapgksgrwlvdlkmgrltgletglygmdldtangwgpgtlvtvssllvavlkgvqcqsveeyigmisgantgyanwtsptterfdmnwvtyvtpgtpltlnyyyvrqtcfcartisktstt；seqidno:4：mllpseacagdqdaatyygatlivmgtqlwfsnnvpltllpklliyarlancqaviafgggtevvvktwyqftltisdgsvpvcykytgvydsqkpsgsgtqvgsstgstlasgvdtqsdtraptppsrfkgiq。本发明中，所述单克隆抗体为兔源抗隐球菌荚膜多糖的单克隆抗体，特异性好、稳定性好，解离常数相对于鼠源单克隆抗体小，与隐球菌荚膜多糖的亲和力强，可以快速与隐球菌荚膜多糖进行结合，有利于缩短检测时间。优选地，所述捕获抗体上修饰有生物素。优选地，所述捕获抗体的浓度为0.5～3μg/ml，例如可以是0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3.5μg/ml或3μg/ml。优选地，所述信号抗体上修饰有化学发光基团。优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、吖啶磺酰、异鲁米诺、鲁米诺、辣根过氧化物酶、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或碱性磷酸酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为吖啶酯。优选地，所述信号抗体的浓度为0.5～3μg/ml，例如可以是0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、3.5μg/ml或3μg/ml。优选地，所述试剂盒还包括固相载体。优选地，所述固相载体包括磁微粒、酶标板、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合，优选为磁微粒。优选地，所述固相载体表面修饰有链霉亲和素。优选地，所述磁微粒的浓度为100～1000μg/ml，例如可以是100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1000μg/ml。优选地，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品为真菌抗原。优选地，所述真菌抗原包括念珠菌甘露多糖和/或隐球菌荚膜多糖。优选地，所述校准品的浓度分别为0.2～25.0ng/ml，例如可以是0.2ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml或25ng/ml，优选为0.2～1.0ng/ml(念珠菌甘露多糖)或5.0～25.0ng/ml(隐球菌荚膜多糖)。第三方面，本发明提供了一种真菌抗原的检测方法，所述检测方法采用如第二方面所述的试剂盒。优选地，所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样本采用样本预处理试剂进行预处理，去除待测样本中的生物素；(2)加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素包被固相载体和信号抗体，混合孵育后去上清。本发明中，在进行真菌抗原的检测过程中，为避免待测样本中的生物素对结果造成的影响，首先将待测样本采用样本预处理试剂进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素包被固相载体和信号抗体，完成抗原抗体的结合反应，消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。本发明的方法显著降低了待测样本中的生物素对结果造成的干扰，对检测浓度的影响小于10％。优选地，步骤(1)所述预处理的时间为1～10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。优选地，步骤(2)所述混合孵育的时间为1～20min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。优选地，所述检测方法在抗原结合后还包括化学发光检测的步骤。优选地，所述化学发光检测包括加入底物，测定化学发光强度；根据标准曲线，计算得到所述待测样本中抗原的浓度。第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的样本预处理试剂和/或如第二方面所述的试剂盒在制备真菌感染疾病检测试剂中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的样本预处理试剂在进行真菌抗原的检测过程中，首先与待测样本共孵育，去除待测样本中游离的生物素，再进行抗原检测，消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰，显著提高了检测的准确性；(2)本发明的试剂盒采用兔源单克隆抗体作为捕获抗体和信号抗体，特异性好、稳定性好，与真菌抗原的亲和力强，可以快速与抗原进行结合，有利于将检测时间缩短至15min以内；(3)本发明的试剂盒特异性强，临床符合率达94％，灵敏度高，检测限达0.05ng/ml，优于市场上现有的试剂盒，在真菌感染疾病的早期快速临床诊断方面具有广阔的应用前景。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1试剂盒的制备(1)生物素标记捕获抗体的制备长链活化生物素按浓度为1mg/ml溶解于二甲基亚砜中；将待偶联且已经纯化的抗念珠菌甘露聚糖单克隆抗体(重链为seqidno:1，轻链为seqidno:2)按浓度为1mg/ml溶解于0.1mol/lph＝9.0的碳酸氢钠溶液中；将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1:8混合，在室温下温育4h；在4℃下在0.05mol/lph＝7.2的pbs缓冲液中透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离生物素，得到生物素标记捕获抗体。(2)链霉亲和素标记的磁微粒的制备将磁微粒用2-吗啉乙磺酸缓冲液(mes)重悬，使磁微粒的浓度适宜，将链霉亲和素加入上述磁微粒溶液中，在37℃混悬60min，其中磁微粒与链霉亲和素的质量比为25:1；加入新鲜配制的碳二亚胺水溶液，在37℃下混悬6h，其中2-吗啉乙磺酸缓冲液(mes)与碳二亚胺水溶液的体积比为15:1，孵育结束后，磁分离；用2％牛血清白蛋白的封闭液封闭，混合，37℃孵育1h，磁分离，去上清，用含1％bsa的tris-hcl缓冲液(0.01mol/l，ph＝7～7.5)重悬偶联有链霉亲和素的磁微粒，置4℃备用。(3)吖啶酯标记信号抗体的制备向吖啶酯溶液中依次加入等体积的12.8mg/ml高碘酸钠溶液和1％乙二醇溶液，2-8℃避光反应1h；按吖啶酯溶液:抗体的摩尔比为(0.5-2):1向混合液中加入mn单克隆抗体，置于0.05m碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；取出混合液，向混合液中按照每毫克抗体加入20μl硼氢化钠溶液的比例加入5mg/ml硼氢化钠溶液，2-8℃避光反应2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，2-8℃避光反应1h；在2-8℃下，8000rpm离心30min，弃上清，用适量0.01m磷酸盐缓冲液溶解沉淀，2-8℃透析过夜；采用0.05m2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(ph＝6.0)稀释吖啶酯标记的信号抗体。实施例2念珠菌甘露聚糖的一步法检测本实施例采用一步法进行念珠菌甘露聚糖的检测，步骤如下：(1)10μl浓度为1ng/ml的甘露聚糖与150μl浓度为1mg/ml的链霉亲和素标记磁微粒(生物素载荷为5000pmol/mg)在37℃下共孵育10min，磁分离1min，保留上清；(2)向上清液中加入150μl浓度为0.3μg/ml的生物素标记捕获抗体、150μl浓度为0.3mg/ml的链霉亲和素标记磁微粒和150μl浓度为0.3μg/ml的吖啶酯标记信号抗体，充分混合，37℃下孵育10min，磁分离1min，去上清，采用洗涤液清洗5次；(3)加入200μl激发液，充分混合后采用全自动化学发光仪lumiray系列，测定溶液的化学发光强度。实施例3试剂盒的制备(1)生物素标记捕获抗体的制备长链活化生物素按浓度为1mg/ml溶解于二甲基亚砜中；将待偶联且已经纯化的抗隐球菌荚膜多糖单克隆抗体(重链为seqidno:3，轻链为seqidno:4)按浓度为1mg/ml溶解于0.1mol/lph＝9.0的碳酸氢钠溶液中；将活化生物素液与待偶联的抗体溶液按1:8混合，在室温下温育4h；在4℃下在0.05mol/lph＝7.2的pbs缓冲液中透析24h，其中换液4次，以除去未结合的游离生物素，得到生物素标记捕获抗体。(2)吖啶酯标记信号抗体的制备向吖啶酯溶液中依次加入等体积的12.8mg/ml高碘酸钠溶液和1％乙二醇溶液，2-8℃避光反应1h；按吖啶酯溶液:抗体的摩尔比为(0.5-2):1向混合液中加入gxm单克隆抗体，置于0.05m碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；取出混合液，向混合液中按照每毫克抗体加入20μl硼氢化钠溶液的比例加入5mg/ml硼氢化钠溶液，2-8℃避光反应2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，2-8℃避光反应1h；在2-8℃下，8000rpm离心30min，弃上清，用适量0.01m磷酸盐缓冲液溶解沉淀，2-8℃透析过夜；采用0.05m2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(ph＝6.0)稀释吖啶酯标记的信号抗体。实施例4隐球菌荚膜多糖的一步法检测本实施例采用一步法进行隐球菌荚膜多糖的检测，步骤如下：(1)10μl浓度为10ng/ml的荚膜多糖与150μl浓度为1μg/ml的抗游离生物素抗体37℃下共孵育10min；(2)向混合液中加入150μl浓度为0.3μg/ml的生物素标记捕获抗体、150μl浓度为0.3mg/ml的链霉亲和素标记磁微粒和150μl浓度为0.3μg/ml的吖啶酯标记信号抗体，充分混合，37℃下孵育10min，磁分离1min，去上清，采用洗涤液清洗5次；(3)加入200μl激发液，充分混合后采用全自动化学发光仪lumiray系列，测定溶液的化学发光强度。实施例5特异性实验与鼠源单克隆抗体相比，兔源单克隆抗体具有识别位点多、亲和性强和特异性好等优点，本发明的试剂盒与市售试剂盒的测试数据见表1，本发明的试剂盒的特异性优于市场上现有的念珠菌甘露聚糖检测试剂盒。表1不同念珠菌甘露聚糖检测试剂盒的临床符合率检测试剂盒厂家dnk(本发明)biorad方法学化学发光法elisa法临床符合率94％76％实施例6灵敏度实验对隐球菌荚膜多糖进行梯度稀释后，进行灵敏度检测。结果发现，随着荚膜多糖浓度的上升，信号值也随之上升；检测限(lod)达到0.05ng/ml，与市售试剂盒的比较如表2所示。表2不同隐球菌荚膜多糖试剂盒的灵敏度品牌dnk(本发明)immyimmy方法学化学发光法胶体金法elisa灵敏度指标lodc5lod抗原浓度ng/ml0.051.001.70实施例7抗生物素干扰能力实验现有的化学发光诊断试剂盒，为了缩短反应时间，大多采用一步法操作，由于生物素标记抗体与样品和亲和素磁珠同时进行反应，样品中的生物素必然会干扰生物素标记抗体与亲和素磁珠的结合，影响结果的准确性。本发明中，在进行真菌抗原的检测过程中，为避免待测样本中的生物素对结果造成的影响，采用实施例2或4的方案实现待测样本中抗原与抗体的结合，其中，实施例2首先将待测样本采用链霉亲和素包被固相载体进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素包被固相载体和信号抗体，完成抗原抗体的结合反应；实施例4首先将待测样本采用抗游离生物素抗体进行预处理，吸附去除待测样本中的生物素后，再加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素包被固相载体和信号抗体，完成抗原抗体的结合反应；彻底消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。结果见表3。表3实施例的抗生物素干扰能力对比综上所述，本发明的样本预处理试剂在进行真菌抗原的检测过程中，首先与待测样本共孵育，去除待测样本中游离的生物素，再进行抗原检测，消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰，显著提高了检测的准确性；由此构建的试剂盒采用兔源单克隆抗体作为捕获抗体和信号抗体，特异性好、稳定性好，与真菌抗原的亲和力强，可以快速与抗原进行结合，有利于将检测时间缩短至15min以内；所述试剂盒特异性强，临床符合率达94％，灵敏度高，检测限达0.05ng/ml，优于市场上现有的试剂盒，在真菌感染疾病的早期快速临床诊断方面具有广阔的应用前景。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>丹娜（天津）生物科技有限公司<120>一种样本前处理试剂及其应用<130>20191217<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>134<212>prt<213>兔源<400>1metthrleuthrcysphecysalaargthrileserlysthrserthr151015argleuthrglyleuglutyrileglymetileserglyalathrval202530aspleulysmettyrglymetaspleutrpglyproglythrleuval354045thrvalserservalglncysglnservalglugluvalserglyphe505560serleusersertyrilethrasntyrtyrtyrvalargglnalapro65707580glylysaspmetasntrpvalthrtyrvalthrproglythrproleu859095serglyglyasnthrglygluthrglyleuargtrpleuleuleuval100105110alavalleulysglytyralaasntrpthrserprothrthrgluasp115120125thralaasnglyargphe130<210>2<211>134<212>prt<213>兔源<400>2metaspthrargalaprothrglnleuleuglyalathrphealaile151015valmetthrglnserglualacysalaglytyrlystyrthrglyleu202530leuleuleuasnargleualaasncysglnalathrgluvalvalval354045lystrpleuproglythrtrptyrglnphethrleuthrileserasp505560glyservalprovalcysaspglnaspalathrleualaserglyval65707580proserargphelysglyserglyalathrtyrtyrthrproserser859095valglyglythrileaspserglnlysproglyserserglythrgln100105110valglyaspthrvalproprolysleuilealapheglyleuiletyr115120125glnservaltyrserasn130<210>3<211>134<212>prt<213>兔源<400>3metgluvalserglypheserleusersertyrilethralaprogly151015lysserglyargtrpleuvalaspleulysmetglyargleuthrgly202530leugluthrglyleutyrglymetaspleuaspthralaasnglytrp354045glyproglythrleuvalthrvalserserleuleuvalalavalleu505560lysglyvalglncysglnservalgluglutyrileglymetileser65707580glyalaasnthrglytyralaasntrpthrserprothrthrgluarg859095pheaspmetasntrpvalthrtyrvalthrproglythrproleuthr100105110leuasntyrtyrtyrvalargglnthrcysphecysalaargthrile115120125serlysthrserthrthr130<210>4<211>134<212>prt<213>兔源<400>4metleuleuproserglualacysalaglyaspglnaspalaalathr151015tyrtyrglyalathrleuilevalmetglythrglnleutrppheser202530asnasnvalproleuthrleuleuprolysleuleuiletyralaarg354045leualaasncysglnalavalilealapheglyglyglythrgluval505560valvallysthrtrptyrglnphethrleuthrileseraspglyser65707580valprovalcystyrlystyrthrglyvaltyraspserglnlyspro859095serglyserglythrglnvalglyserserthrglyserthrleuala100105110serglyvalaspthrglnseraspthrargalaprothrproproser115120125argphelysglyilegln130当前第1页1 2 3