用核磁共振波谱法定量测定异核的方法、其参考物质和测定氘化化合物氘化度的方法与流程

本发明涉及一种使用nmr波谱仪定量测定试验品中分析物的方法，其中用于溶解所述分析物的氘化溶剂被用作内标物，用于本发明的方法的参考物质，和一种用于测定氘化化合物的氘化度的方法。

背景技术：

核磁共振波谱法，在下文中也被称为nmr波谱法，是有机化合物结构解析的基本方法之一。它基于这样的事实，即大量元素的原子核有非零的核自旋，且在施加外部磁场时得到的角动量允许作出关于所述原子化学环境的说明。

核自旋为零(i＝0)的原子，例如¹²c或¹⁶o，不能被nmr波谱法探测到。相反，所有有非零核自旋的原子可用nmr波谱法。值为1/2的核自旋是最有利的，因为在这种情况下只存在两种可能的本征态，m＝+1/2和m＝-1/2。可能的状态数量根据公式：2i+1计算。因此，当在有机化学中使用nmr波谱法时，最合适的核是¹h、¹³c、¹⁵n、¹⁹f、²⁹si、³¹p和⁷⁷se。

在纯结构解析之外，nmr波谱法还可被用于定量测定待研究的化合物，即分析物。在定量nmr波谱法中，通过比较分析物和同时测量的参考物质的信号强度，计算样品溶液中分析物的含量。通常，在样品溶液中添加一种内标物作为参考物质，已知所述内标物的纯度且所述内标物的信号不应该与所述分析物的那些重叠。所述参考物质也可用作外标物。在下文中，用于nmr波谱法的参考物质也被称作“标准物”。

在nmr波谱的定量评估中，所述分析物和所述参考物质的信号被分别积分。假定那些在波谱中出现信号的每个原子对信号的积分贡献相等分量，从而原子的数量与积分即积分面积成正比。所述样品溶液中所含的分析物的质量可以从积分比计算，并考虑到所述分析物和参考物质的质量和摩尔质量以及信号被积分的原子的数量。

与其他色谱方法不同，定量nmr波谱法并不要求被用作标准物的参考物质和待测定的分析物相同。所述分析物和标准物只需要包含相同类型的原子(相同的核素)，所述原子的信号在nmr实验中被记录。这使得使用如上所述的内标物成为可能，其中所述内标物被最适合地选择，从而在nmr波谱中它的信号和所述分析物的信号不重叠。在足够量的常用氘化溶液中溶解确定量的所述分析物和标准物(通过测量或称重来确定)，且随后在nmr波谱仪中测量。对于此方法，不需要知道所用溶剂的准确量。

对于每个待检查的核，或多或少存储了合适的标准物(标准物质)作为精确确定的标准溶液。如果要测定同一样品的其他核素类型，必须添加其他标准物，这非常耗时，因为必须制备且精确计量准确确定的标准溶液。此外，还必须定期检查这些其他标准溶液的纯度，这也意味着额外的努力。

为了减少不同标准物的数量和工作量，并提供一种对于有机分子的大多数重要的nmr活性核素而言通用的标准物，在de102012204701a1中提出了一种多核标准物，所述多核标准物除了包含碳原子和氢原子之外，还包含了磷原子、氮原子和氟原子。通过使用单一的标准物，可以在同一样品上测量几种类型的核素而不需要其他干预。多核标准物的另一个优点是这样的事实，即其中包含的所有类型的原子总是以准确的化学计量比例存在，因此当要测定所述标准物中的原子比时不会出现称重误差。

然而，如果需要测量其他活性核素，尤其来自于无机阴离子和阳离子的范围，例如钠(na)、钾(k)、氯(cl)、溴(br)或铝(al)，没有合适的物质能被用作标准物。na仅作为简单阳离子存在，k或ca也如此。碘(i)、br和cl类仅在水和有机溶液中以阴离子形式存在时稳定。原则上只有cl可以高氯酸根的形式被用作内标物。相反，高碘酸根在碘化物存在时反应过大而无法测定，并因此只能用作外标物，这有相应的缺陷。在这种情况下，必须建立校准线，这导致许多繁琐的参考测量。在nmr波谱法中外校准的另一个根本问题是没有确定体积的测量元件。例如，在hplc色谱法中，这样的元件被用于uv检测，其中使用永久可用的测量小室或可替换的标准化分析杯。市售的nmr测量试管的体积不是标准化的，且基于质量有0.5至10％的误差。或者，对每个测量可用同一试管，但这导致耗时的冲洗和质量检查，并且不实用，尤其是对于系列和常规测量而言。

在过去为了克服这些缺点的所有尝试中，各自的定量测定需要至少第二次测量，其不确定度高。eretic(获取体内浓度的电子参考)过程试图使用辐射电子参考信号来定量。然而，由于体积变化的原因，这项工作失败了。即便采用pulcon(基于脉冲长度的浓度测定)方法，也无法获得比所述nmr试管平均体积的标准偏差允许的更精确的结果。第二个问题是所述每个nmr试管必须根据灵敏度进行单独调谐，即所谓的“调谐与匹配”。体积变化和匹配引起了测量不确定度大。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是克服上述定量nmr波谱法的缺点并提供一种核磁共振波谱方法，即nmr波谱法，用所述方法可以简单但准确的方式定量测定所有的nmr活性核素。本发明的另一个目的是提供用于所述nmr波谱法的必需的确定参考物质。

这个任务通过权力要求1所述的方法来解决，所述方法使用nmr波谱仪定量测定试验品中的分析物。本发明的方法包含以下步骤：

通过将确定量的试验品溶解于确定量的氘化溶剂中，提供样品溶液，

通过确定与第一nmr活性核素和第二nmr活性核素相关的校准因子来校准nmr波谱仪，其中第一nmr活性核素是所述氘化溶液的组分且第二nmr活性核素是所述分析物的组分。

通过对样品溶液进行第一次nmr实验生成第一nmr波谱，测定第一nmr活性核素的共振频率；

通过对样品溶液进行第二次nmr实验生成第二nmr波谱，测定第二nmr活性核素的共振频率，且

考虑到第一和第二波谱中的信号并且考虑到校准因子，计算样品溶液中分析物的质量，

其中第一nmr活性核素和第二nmr活性核素彼此不同，

所述校准因子如下确定：在包含已知量的第一nmr活性核素和第二nmr活性核素的校准溶液中测定第一nmr活性核素和第二nmr活性核素的共振频率，生成两个校准波谱，以及比较所述校准波谱中第一nmr活性核素和第二nmr活性核素的信号，且

使用同一nmr波谱仪进行所述第一次nmr实验和第二次nmr实验以及校准因子的测定。

本发明基于发明人的发现，即在定量nmr波谱法中，用于制备样品溶液的氘化溶剂也可被用作内标物，并由此可定量测定所述样品溶液中的所有nmr活性核素。因此，本发明的方法也可被用于定量检测不是所用标准物组分的核素。在下文中，这一方法被称为“异核定量测定”或“异核定量”。

因此，本发明的方法的特征在于第一nmr活性核素和第二nmr活性核素彼此不同。“第一”或“第二”nmr活性核素的名称仅用于在两种不同的nmr活性核素之间进行区分。

因此，本发明与定量nmr波谱法的常规做法不同，常规做法中在所用的标准物和待测定的分析物中均定量检测相同的核素。因此，为了区分，常用的定量nmr波谱法可被描述为“同核定量测定”或“同核定量”。

本申请所指的nmr活性核素是所有具有非零核自旋并因此可被nmr波谱法检测到的核素，即单核素元素的原子核或一种元素的不同同位素。

本发明的方法用于测定几种物质的混合物(试验品)中的特定物质(分析物)的比例。

为了能够用本发明的方法作出定量说明，当制备待测量的样品溶液时，必须在确定量的氘化溶剂中溶解确定量的试验品。所述试验品和氘化溶剂的确定量可通过测量所需体积或称重所需质量彼此独立地获得。因此，在样品溶液中包含的试验品和氘化溶剂的质量是已知的。

所述试验品溶解于所述氘化溶剂是指所述试验品优选地完全溶解于所述溶剂。然而，仅试验品中包含的分析物完全被溶解也是足够的。

优选地，在适合进行nmr波谱法的容器，例如nmr试管中提供所述样品溶液。

可优选地使用d2o、dmso-d6、cdcl3、丙酮-d6、乙腈-d3、苯-d6作为氘化溶剂，但原则上可使用所有氘化溶剂。所用的氘化溶剂基于不同参数，例如所述试验品或分析物在溶剂中的溶解度或溶剂的惰性特性，而被合适地选择。

在本发明的方法中，对制备的样品溶液进行了两次nmr实验，其中分别测定了第一nmr活性核素和第二nmr活性核素的共振频率且将结果呈现于相应的nmr波谱中。原则上，第一次和第二次nmr实验的进行次序是无关的。然而，所述两次nmr实验必须在同一样品溶液上进行。这意味着样品溶液中氘化溶剂和分析物比例的比值在两次nmr实验之间必须既不变化也不改变。只有这样，才能对所述试验品中分析物的量作出定量说明。

nmr活性核素是“氘化溶剂的组分”的说法是指该核素被表示在所述溶剂的化学式(总分子式)中。类似地，nmr活性核素是“分析物的组分”的说法是指该核素被表示在所述分析物的化学式(总分子式)中。例如，如果用d2o作为氘化溶剂，则氘(²h)是所述氘化溶剂的组分。如果所述分析物例如是乙醇(c2h5oh)，则碳(c)和氢(h)都是所述分析物的组分。

然而，这并不排除在两个总化学式中都有这些核素中的一种或两种。例如，如果使用本发明的方法，使用丙酮-d6作为氘化溶剂进行有机烃化合物的定量测定，碳(c)既是所述氘化溶剂的组合也是分析物的组分。

以通常的方式进行两次nmr实验，并从结果中生成相应的nmr波谱，其中之一显示了用作内标物的氘化溶剂的nmr活性核素的信号，且其中之一显示了分析物的nmr活性核素的信号。例如，在第一次nmr实验中可以生成/准备²hnmr波谱，且在第二次nmr实验中可生成/准备¹hnmr波谱或¹³cnmr波谱。

相比之下，在通常的同核定量测定中，仅进行单次nmr实验且仅得到单一nmr波谱，其中既有内标物的信号，也有分析物的信号。

因此，在本发明的方法中，为了定量测定所述试验品中的分析物，使用来自两个不同nmr实验的测量结果。所述两个nmr实验的不同之处在于，在不同共振频率测定了不同核素的共振。对于定量说明，用此方法获得的测量结果，即来自不同波谱的信号积分，不能直接比较，下文中对此进行了解释。

量子物理学中的一个现象是，在同一磁场强度下，由于共振频率不同，不同的核的灵敏度不同。此效应通过被nmr波谱法检测到的核素的旋磁比γ来定量并以灵敏度值的形式来表示。这些值通常是已知的。例如，¹h是最灵敏的核素。下一个最灵敏的核素是¹⁹f，其灵敏度已经比¹h减小17％。²h的灵敏度相比于¹h已经只有1％(9.65×10^-3)。

在所研究的nmr活性核素并不是该元素的唯一的自然界存在的同位素的情况下，研究的核素在自然界存在的同位素混合物中的相对频率也起到作用。这一因素在感受度中被考虑，所述感受度是灵敏度和所述核素的自然频率的乘积。例如，核³¹p、¹⁹f和²³na是100％单同位素的。在没有明显误差的情况下，¹h可类似地被当做单同位素。另一方面，例如核¹⁵n和¹³c的自然频率必须被考虑到。这些值通常是已知的。

在本发明的方法中被用作内标物的氘化溶剂通常在氘含量方面高度富集，氘化度在99.5％和99.99％之间，即几乎100％。或者，使用本发明的方法，通过比较¹h信号和²h信号(并通过知道相应的校准因子)，可以简单、快速、可靠地测定所用溶剂的氘化度。

如果在第一次nmr实验中生成了²hnmr波谱且在氘化水平约为100％的情况下，相对于¹h的nmr信号测量，²h的nmr信号测量的感受度为约9.65×10^-3。

在上述量子力学和化学因素之外，仪器特有因素也使得很难直接比较来自不同nmr实验的测量结果。该因素由测量设备的几何结构引起，它对于每个nmr波谱仪而言是个别的且特定的，即使在比较相同设计的不同仪器时。因此，已表明波谱仪的线圈几何学和其他硬件参数有可识别的影响。因此，对于每个nmr波谱仪来说，仪器特有因素必须根据经验来确定，这并不十分复杂。只要不对测量装置进行改变，它就会保持不变。仪器特有因素的测定可作为系统适应性测试(sst)的一部分进行。

为了考虑到所述仪器特有因素，必须校准在本发明的方法中所用的nmr波谱仪。为了这个目的，测定每个nmr波谱仪和每个由第一nmr活性核素和第二nmr活性核素组成的核素对的校准因子。

特别地，可如下测定所述校准因子。首先，制备合适的校准溶液。此溶液包含已知量的第一nmr活性核素和第二nmr活性核素。例如，为了测定核素对¹h、²h的校准因子，h2o在d2o中的溶液是合适的，已知包含于其中的h2o和d2o的准确量。

随后，通过使用待校准的nmr波谱仪，从校准溶液中生成¹hnmr波谱和²hnmr波谱。

然后，通过比较两个波谱的各自峰的积分，并考虑到校准溶液中h2o和d2o的已知量，可计算此nmr波谱仪和此核素对所特有的校准因子。

通过使用特别合成的化合物，可以进一步简化测定d和所有其他活性核素x之间的校准因子的过程。这些化合物包含核d和x，其量由所述化合物的化学结构性质决定，并因此也确定了其摩尔比。由于所述比是已知的，因此没有必要称重所述样品。这样的参考物质可以以任何量被添加到由称重样品和氘化溶剂组成的分析溶液中。通过d和x特异信号的绝对积分的比，从一开始就测定了每个单独测量中的校准因子。合适的化学化合物的实施例，例如异丁醇-d6，如下所列。

此校准因子不仅考虑到所用nmr波谱仪的仪器特有因素，还考虑到上述所用核素对的化学和量子力学因素。由于所述校准因子也考虑到了仪器特有的性质，在根据本发明的过程中，所述第一次和第二次nmr实验和校准因子的测定必须使用相同的nmr波谱仪进行。

因此，本发明也公开了一种方法，所述方法用于校准进行本发明的异核定量测定方法的nmr波谱仪。

所述nmr波谱仪的校准可在进行第一次和第二次nmr实验之前或之后进行。

最后，在本发明的方法中，考虑到所述第一和第二波谱的信号和考虑到校准因子，计算所述样品溶液中包含的分析物的质量。下文会详细解释。

在本发明的方法中，优选地，所述nmr活性核素是²h(氢的氘同位素)，所述活性核素是氘化溶剂的组分并在上文中被称为第一nmr活性核素。

这利用了一个事实即氘原子²h(或d)的核自旋为1并可因此被nmr波谱法检测到。因此，任何氘化溶剂可被用作内标物。应注意到，²h的共振频率显著低于频率比为15.40％的¹h(相对于cdcl3中tms(四甲基硅烷)在0ppm时的质子频率)。

如上文所解释的，²h的灵敏度相对低，且²hnmr信号测量的感受度相对于¹hnmr信号测量只有约1％(9.65×10^-3)。然而，这通过nmr波谱法中溶剂以显著过量存在于样品溶液中的事实所弥补。

如果在本发明的方法中，以脉冲方式进行第一次和第二次nmr实验，则当比较来自两个波谱的信号时，必须考虑到进行第一次和第二次nmr实验的脉冲数(将积分值除以脉冲数)。

本发明的方法的最大优势在于溶剂被用作参考标准物或参考物质且另外作为内标物。这消除了在一开始提到的nmr试管体积变化的问题。由于溶剂已经在nmr波谱法中经常被使用，并不需要添加另外的物质作为标准物。所述溶剂，其在本文中也作为标准物，只需要被精确地测量(例如通过测量准确的体积或称重准确的质量)。此内标物，即溶剂，也可作为锁定物质以提高频率稳定性。在本文中，优选的物质例如d2o。因此，所述内标物同时作为溶剂和另外作为锁定物质。

此外，单一脉冲通常足够校准所述测量，即记录²hnmr波谱，这导致整个测量过程的总测量时间只需要延迟约10秒。

在下文中，对于已知的同核定量测定和根据本发明的异核定量测定，详细解释了试验品的nmr波谱检测如何被用来作出关于化合物即包含于所述试验品的分析物的定量说明。所用的变量和常量列于表1。

表1

*⁾在nmr波谱中引起用于定量测定的峰的nmr活性核素的原子数

同核定量测定的计算:

为了制备合适的样品溶液，同时称重已知质量的试验品mpg和已知质量的内标物mis并溶解于合适的溶剂。例如，所述内标物可为液体、固体或在合适溶剂中的溶液，并以精确已知的比例(质量分数wrs)包含所述参考物质。

所述参考物质的结构是已知的。所述试验品中分析物的结构通常也是已知的或可从nmr波谱确定。因此，在得到的nmr波谱中可见的单独信号/峰可被分别明确地归属于参考物质和分析物。

对于所述参考物质和分析物两者且对于每个情况下的选定峰，确定相应于各峰下的面积的积分irs的ia。此外，必须知道引起各峰的原子核数。例如，如果用二甲基砜作为参考物质，它的峰在¹hnmr波谱中由6个h原子引起。如果用单个ch3基团的峰来定量确定分析物，这个峰的积分由3个h原子引起。

用以下公式(1)，可用内标物的称重质量mis、内标物中参考物质的质量分数wrs和它的分子量mrs来计算样品溶液中参考物质的物量nrs：

用以下公式(2)，可通过比较在内标物中的分析物和参考物质各自的一个峰的积分ia和irs，并考虑到分别引起所述峰的原子数zaa和zars，来计算在样品溶液中的分析物物量na：

用以下公式(3)，可从样品溶液中分析物的物量na、它的摩尔质量ma和试验品的称重质量mpg计算试验品中分析物的质量分数wa：

异核定量测定的计算:

为了制备合适的样品溶液，同时称重已知质量的试验品mpg和已知质量的氘化溶剂mis并溶解于其中。由于氘化溶剂被用作内标物，没有必要向样品溶液中添加其他物质。

优选地，从样品溶液中记录²hnmr波谱(用合适的脉冲数nsrs)以及额外记录的另外的nmr波谱。所述另外的nmr波谱通常是合适于测定分析物(用合适的脉冲数nsa)的nmr波谱，例如¹h或¹³cnmr波谱。

自然地，所述氘化溶剂即参考物质的结构是已知的。所述分析物的结构通常也是已知的或可从nmr波谱确定。因此，在得到的nmr波谱中可见的单独信号/峰可被分别明确地归属于参考物质和分析物。

对于参考物质和对于²hnmr波谱中的选定峰测定积分irs。类似地，测定在另外的nmr波谱中的选定峰的积分ia。如在同核定量测定中，必须知道引起各峰的原子核数。

用以下公式(1)，可用内标物即氘化溶剂的称重质量mis、内标物中参考物质的质量分数wrs和它的分子量mrs来计算样品溶液中参考物质的物量nrs：

所述参考物质的质量分数wrs从氘化溶剂的纯度和氘化度得到且对于市场上可用的氘化溶剂是已知的。

用以下公式(2a)，可通过比较在内标物中的分析物和参考物质各自的一个峰的积分ia和irs，并考虑到分别引起峰的原子数zaa和zars，来计算在样品溶液中的分析物物量na：

由于nmr波谱中峰面积(积分)随着脉冲数的增加而增加，并可以假定线性相关，在上述等式(2a)中的积分ia和irs被设定为分别与脉冲数nsa和nsrs有关。

此外，等式(2a)考虑到了可通过校准测量测定的因子(x,y)。在本文中，x和y表示在两个nmr波谱中检测到的样品溶液中的各自的核，例如²h和¹h。

用以下公式(3)，可从样品溶液中分析物的物量na、它的摩尔质量ma和试验品的称重质量mpg计算试验品中分析物的质量分数wa：

在本发明的方法中，必须使用相同的nmr波谱仪进行第一次和第二次nmr实验和校准因子的测定。优选地，各自nmr实验中对峰的积分有影响的所有其他参数，都在这些测量期间保持不变。或者，这些参数中的某些改变可以在数学上被考虑到并加以校正。

可用来优化将模拟信号转化为数字信号的相应参数被称为rg(接收机增益)。优选地，对nmr实验设定该参数为1。原则上，用于等式的积分是rg的线性函数，因此对不同的rg进行数学校正是可行的。关于rg的校正必须考虑到上述等式2a。

nmr实验中的另一个相关参数是脉冲角度pw。在完全弛豫的状态下，来自核自旋的z磁化的总和被归一化为1。x、y的磁化强度是激发时长的函数，其通常在10到200微秒的范围内。由此，所述矢量z可以被带入圆周运动。根据所述激发时长，所述矢量也被称为脉冲角度。通过90°脉冲，实现最大强度的激发，所述z磁化的100％被转化成x、y磁化。加倍激发时间导致负的z磁化，x、y磁化为0。在这个情况下，激发的核自旋的宏观磁化描述了一个单位圆。在矢量场中，x、y的强度是正弦函数。由于数学上显而易见的原因，对于90°脉冲，由于脉冲角度设定或脉冲时间不精确而可能出现的任何误差都是最低的。因此，对于根据本发明的异核定量，90°脉冲是优选的。否则，必须对绝对积分进行校正。在同核定量的情况下，由于在数学上从等式中被减去，所述pw不起作用。

另一个参数是所谓的弛豫延迟d1。它定义了在两个脉冲(ns>1)之间的实验等待时间，且因此仅必须考虑ns>1的情况。这个值必须足够大，以确保两个测量的核素的完全弛豫。所述弛豫时间是一种材料性质，并因此对所有核素都是单独的，在不同的分子环境下也属于同核群。每此定量检测都必须观察到这个参数，不能从数学上加以考虑。在经典的t1测量之外，还有一个简单测试，其在nmr实验之后使用单90°脉冲而没有d1，这可被用于检查所述弛豫延迟d1是否足够大。

通过本发明的方法，nmr波谱法可被提升到主要定量测量方法的水平且因此等同于称重。类似于天平，nmr实验只需要被校准。

例如，在离子活性药学成分分析的领域，可通过单次nmr波谱分析同时定性和定量地测定待分析的阴离子和阳离子。

使用氘化溶液作为内标物的原则，这也是本发明的重点，也允许快速和简单地测定氘化化合物的氘化度。

化合物的氘化度通常以百分比(％)给出，并表示在化合物中被氘原子取代的氢原子的比例。类似地，可以确定质子化程度，其中：氘化度＝1-质子化程度。

根据本发明，也可提供一种测定第一氘化化合物的氘化度方法，所述方法包含步骤：

制备第一氘化化合物和具有已知氘化度的第二氘化化合物的混合物，使得两种氘化化合物都被溶解；

从所述混合物生成¹hnmr波谱并测定两个氘化化合物各自的至少一个峰的积分；

从所述混合物生成²hnmr波谱并测定相同峰的积分；

用测定的积分值和第二氘化化合物的已知氘化度计算第一氘化化合物的氘化度。

根据一个优选实施方式，第一氘化化合物和第二氘化化合物中的至少一种是用于nmr波谱的氘化溶剂。

第一和第二氘化化合物的混合比并不需要被准确地知道，只要得到有意义的nmr波谱即可。优选地按重量计的混合比是在1:99和99:1之间，更优选地在10:90和90:10之间，且特别优选的在30:70和70:30之间。最简单并因此特别优选地是以约1:1混合所述第一和第二氘化化合物。

从两个波谱中，测定第一和第二化合物的相同峰的积分并对两种化合物的每一种计算积分比d/h。使用计算的积分比并考虑到第二氘化化合物的已知的质子化程度，可以通过等式(4)的方法计算得到第一氘化化合物的质子化程度和由此的氘化度。

{d}vb1＝100-({h}vb2×(inthvb2/intdvb2)/(inthvb1/intdvb1)(4)

其中：

{d}vb1＝第一氘化化合物的氘化度

{h}vb2＝第二氘化化合物的氘化度

inthvb1＝¹hnmr波谱中第一氘化化合物峰的积分

intdvb1＝²hnmr波谱中第一氘化化合物相同峰的积分

inthvb2＝¹hnmr波谱中第二氘化化合物峰的积分

intdvb2＝²hnmr波谱中第二氘化化合物相同峰的积分

用此方法测定氘化度的优势在于，既不需要知道准确的混合比，也不需要知道上述的量子力学、化学或仪器特有的因素。所述方法尤其可被用于简单和精确地测定用于nmr波谱法的溶剂的氘化度。

如上所述，在根据本发明的用nmr波谱法进行异核定量测定的方法中，所用nmr波谱仪的一次性校准是必须的。为此目的所需的校准溶液包含已知量的第一nmr活性核素和第二nmr活性核素，且因此可通过准确地测量两种合适的化合物来制备。

或者，可被用于进行校准的化合物在它的结构式中包含确定数目的两种核素。例如，在¹h和²h作为两种核素的情况下，合适的化合物可为异丙醇-d6，(cd3)2choh，其可通过还原丙酮-d6得到。因为此化合物有确定和恒定的核素²h和¹h的比6:2，因此当用此化合物作为参考物质时，无需精准测量。

基于此，可以设想出除确定数目的氘原子之外，还含有一种或多种其他可被nmr波谱法检测到的核素，例如碳、氮、磷、氟、硅、硼、硒等的其他化学化合物。

可在校准中被用作参考物质的所述化合物的实例是异丙醇-d6的磷酸酯：

其中所述磷可有其他氧化态(例如膦酸酯)。

所述残基r可通过这样的方式选择，即使得其他nmr活性核素，特别是氟、硅和硼，成为参考物质的一部分。在r＝异丙基-d6的情况下，获得的化合物仅适合在氘、氢和磷的测定中用作校准参考物质。对于以下化合物，基团r的选择方式使得参考物质也包含确定数量的氟原子，因此当测定含氟化合物时，可获得同样适用于校准的参考物质：

基于根据本发明用nmr波谱法进行异核定量测定的方法的原则，另外地提供了如上所述化合物、即在它们的结构式中包含确定数量的氘原子和确定数量的至少一种可被nmr波谱法检测到的其他核素的化合物用于校准异核定量测定用nmr波谱仪。

如上文所解释的，本申请也公开了一种方法，所述方法用于校准为实施本发明的异核定量测定方法所用的nmr波谱仪。因此，类似地公开了如上所述化合物在这样的校准方法中的用途。

特别优选地，所述用作参考物质的化学化合物在室温或轻高的温度下是液体。这使得化合物更容易作为纯物质使用。

目前，定量异核nmr波谱法仅涉及一个纯粹数学的基础，其可被追溯到定义的有机分子的天然化学计量。这个体系可被描述为一个量子天平，因此是一个主要绝对分析方法，其在实际应用中变成一个主要相对方法。

通过本发明的方法，有可能在不添加迄今为止一直使用的特定标准物质的情况下实施定量nmr波谱法。

这种“无标准分析”的一个重要领域是诊断学或法医学。例如，相比于传统方法，使用溶剂d2o作为参考可以显著提升血液酒精的测定。关于用nmr波谱法测定血液酒精浓度，参考专利de102012224334b4。

类似于上述对溶剂氘化度的测定，组合¹h/²hnmr方法允许直接测定血液和血浆样品中的水含量。因此，不需要常用标准物，可直接测定血液样品中作为血液醇的乙醇含量，并只需要单一测定。

除了定量测定血液中的水和血液酒精之外，血液组合物的其他重要参数也变得可直接获得，即通过本发明的方法，可以以简单和精确的方式进行定量测定。其中包括葡萄糖、乳酸、特定氨基酸或adp/atp。复杂脂蛋白的信号是人类血液的一个清晰标志，这也可以被检测到并形成波谱指纹，所述波谱指纹，尤其在法医样品中，确定了作为人类血液的检查样品的身份和量。类似地，使用合适的测量条件，可检测到其他代谢物，包括被称为液体摇头丸的γ-羟基丁酸。

附图说明

本发明的其他优点和特征可通过实施例的描述和从图中看到，其中：

图1示出了d2o中na-肝素的²hnmr波谱。

图2示出了d2o中na-肝素的²³nanmr波谱。

图3示出了不同浓度的na肝素的²³nanmr波谱。

图4示出了有细节放大的dmso-d6的¹hnmr波谱。

图5示出了dmso-d6的²hnmr波谱(左)以及放大的与相应图4的¹hnmr波谱的重叠(右)。

图6示出了测定氘化dmso-d6的氘化度的图。

图7示出了dmso-d6和cdcl3的混合物的¹hnmr波谱(左)和相应的²hnmr波谱(右)。

具体实施方式

实施例1-肝素钠中钠的测定

以下，肝素钠中钠的测定被提供，作为一个本发明的方法即异核定量测定的实例。

为了这个目的，通过根据本发明所述的方法(nmr)测定了16种不同的钠-肝素溶液样品(s1-s16)的钠含量，并与通过常用于此目的通过原子吸收波谱法(aas)得到的值进行比较。

为了制备样品，称重确定量的na-肝素并溶解于确定体积的d2o中。或者，也可以称重确定量的合适的氘化溶剂。作为氘化溶剂，dmso-d6可被用作d2o的替代物。

特别地，依据本发明通过nmr测定钠是在欧洲和美国药典要求的¹hnmr研究之后进行的额外实验。为了这个目的，没有额外样品制备的情况下，可使用已经存在的样品溶液，因此每次测量所需的额外时间只有约2分钟。

nmr实验产生²hnmr波谱所需的时间少于10秒。d2o中na-肝素的示例性²hnmr波谱示于图1。它通过prodigy型的500mhz波谱仪(生产自brukercorporation)以一个脉冲生成。信号噪音比s/n是17000。

nmr实验产生²³nanmr波谱所需的时间约为2分钟。d2o中na-肝素的示例性²³nanmr波谱示于图2。它通过prodigy型的500mhz波谱仪(生产自brukercorporation)以128个脉冲生成。信号噪音比s/n是4900。

在图3所示的²³nanmr波谱种，有不同na肝素浓度的不同样品的na信号被叠加。

基于在各自²hnmr和²³nanmr波谱中的信号(积分)，并考虑到所用nmr波谱仪和核素对(²h、²³na)的校准因子，测定了在每个样品中的na含量。

下表1示出了用本发明的方法获得的结果与用原子吸收波谱法(aas)测定的结果的比较。

表1

发现，在测量精度的范围内，nmr检测的结果与用于na的经典aas方法的那些结果一致。

如上所述的过程可以简单地转换到所有其他活性nmr核素，例如³⁵cl或⁷⁹br。

实施例2-nmr溶剂氘化度的测定

nmr实验的合适溶剂必须包含非常高程度的氘²h，而不是天然更丰富的氢原子¹h。对于传统的nmr实验，规格“非常高”就足够了，即>99％d。剩余1％是¹h。

了解这个氘化度对于根据本发明的异核定量nmr方法是重要的。在溶剂具有非常高度氘化的情况下，例如氘化度>99.95％的d2o，0.05％的¹h的比例是不重要的，仅对测定的不确定度起作用。为了准确确定氘化度，nmr波谱法是天然合适的，因为它可用于测量²h(d)和¹h两者。积分比d/h直接与氘化度成正比。通过添加相同的非氘化溶剂并进行合适的计算，即可进行必要的校准。

在下文中，以氘化dmso-d6(cd3-so-cd3)为例进行说明。根据制造商的说法，在此实施例中所用的dmsod6的氘化度为约99.5％。因此，某些dmso分子不包含两个相同的cd3基团，而也含有cd2h或cdh2基团。在¹hnmr波谱中，基团cd2h的信号(由于²jd,h偶联产生的五重峰)和cdh2的信号(由于²jd,h偶联产生的三重峰)可以被分别展示(见图4)。在²hnmr波谱中，只有主要的cd3基团是可见的(见图5)。

图4中，dmso-d6的¹hnmr波谱显示在左侧。在图4的中间，垂直放大显示了chd2基团的三重峰。在向此样品添加了非氘化的dmso之后，ch3基团的单峰偏移向深场。所谓的氘同位素效应引起¹h共振的等距移动，每氘向高场的位移量相同。

由于硫中的ch3基团也以分离的信号显示出来(由于失去²jd,h产生的单峰)，在当前情况下，使用常规dmso作为内标物和作为标准物添加，对于准确测定dmso-d6中的质子量来说是合适的。通过知晓残余质子的量，这通过这种方法非常精确地测定，就可以简单地校准氘/氢比。因此，通过这种方法准确确定氘化度的氘化溶剂可被用作本发明的方法中异核定量的标准物。

图5在左边显示了dmso-d6的²hnmr波谱，并在右边显示了与来自图4的相应的¹hnmr波谱的放大重叠。所述右边的波谱被纵向放大以显示¹³cnmr卫星峰。

在不同的确定量的非氘化dmso被添加到此实施例所用的氘化dmso-d6中之后，所获得的混合物的每一种通过nmr波谱法测量，并确定积分比d/h，且随后获得的d/h比相对于对添加的非氘化dmso的比例(以重量％表示)绘图，所用dmso-d6的氘化度可用以下等式(5)的线性校正等式来计算。

氘化度＝100–截距/斜率(5)。

图6示出了根据此实施例获得的测量值和用线性回归创建的直线的相应图。测定系数r²为0.9999。通过直线方程y＝2.7877x+1.194，得到所用氘化dmso-d6的氘化度为99.57％。

现在，如上述实施例2中在氘化度方面被精确规定的溶剂可被用作测定其他氘化溶剂例如cdcl3的通用标准物，且因此可规定本发明的方法(异核定量)的其他标准物。

为了这个目的，将规定的氘化度的溶剂与之前限定的dmso-d6混合，且进行相应的¹h和²hnmr波谱测量。不需要知道混合比，因为影响所述测量的所有参数(例如量、个别仪器设定等)已经被考虑到。在以下实施例3中详细解释这个过程。

实施例3-用氘化度已知的其他氘化溶剂测定nmr溶剂的氘化度

在本实施例3中，测定了氘化cdcl3的氘化度。为此，以约1:1的混合比制备氘化cdcl3和用于实施例2的dmso-d6(氘化度99.57％)的混合物。由于不需要准确知道混合比，所述混合比可以是重量相关或体积相关的。也可以使用其他混合比，只要能够得到有意义的nmr波谱即可。测量所得混合物的²h和¹hnmr(各一个单脉冲)。

图7在左侧示出了所制备的cdcl3和dmso-d6混合物的¹hnmr波谱，并在右侧示出了相应的²hnmr波谱。

将来自dmso-d6波谱的积分比d/h与来自cdcl3波谱的积分比d/h比较，考虑到已知的质子化程度(dmso-d6的{h}dmso)，计算cdcl3的质子化程度和氘化度。表2示出了相应的测量值和计算结果。

表2

氯仿的氘化度{d}cdcl3的％可用以下等式(6)计算：

{d}cdcl3＝100-({h}dmso×(inthdmso/intddmso)/(inthcdcl3/intdcdcl3)(6)。

因此，获得所述氘化氯仿的氘化度为99.83％。