本申请要求分别于2018年1月30日和2017年12月1日提交的美国临时专利申请序列号62/623,992和62/593,504的优先权，其全部内容在此参考并入。本发明是在美国国立卫生研究院授予的r01ca218513和r01ca169416；美国国家癌症研究所授予的u01ca169538；以及美国国防部授予的w81xwh-13-10249和w81xwh-13-1-0425的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。发明领域本发明涉及用于癌症的检测和治疗的纳米颗粒和不同的外泌体子集。
背景技术：
：：细胞在生理和包括癌症在内的病理条件下会分泌各种各样的可溶性因子和细胞外囊泡(ev)来介导细胞间的通讯(局部性和全身性的)(etal.，“exosomes：composition，biogenesisandfunction，”natrevimmunol2：569-579(2002)；andaloussietal.，“extracellularvesicles：biologyandemergingtherapeuticopportunities，”natrevdrugdiscov12：347-357(2013)；raposo&stoorvogel，“extracellularvesicles：exosomes，microvesicles，andfriends，”jcellbiol200：373-383(2013))。ev是异质性的并且包含各种亚类，包括外泌体(exosome)和微囊泡(microvesicle)，外泌体是内体来源的小(50nm至150nm)的细胞外膜囊泡，微囊泡是通过从细胞质膜出芽而直接脱落的大(150nm至500nm或甚至更大至>10μm)的囊泡。癌细胞会脱落出超乎寻常的大囊泡，称为癌小体(oncosome)(0.5μm至10μm)，这是由于特定信号通路的改变(例如rashomolog家族成员a/rho相关蛋白激酶(rhoa/rock)信号传导)引起的(divizioetal.，“oncosomeformationinprostatecancer：associationwitharegionoffrequentchromosomaldeletioninmetastaticdisease，”cancerres69：5601-5609(2009)；morelloetal.，“largeoncosomesmediateintercellulartransferoffunctionalmicrorna，”cellcycle12：3526-3536(2013)；minciacchietal.，“mycmediateslargeoncosome-inducedfibroblastreprogramminginprostatecancer，”cancerres77：2306-2317(2017))。大量研究表明，包括蛋白质、遗传物质、代谢物和脂质在内的功能分子会被选择性地募集并包装到ev中，并横向地转移到受体细胞中，从而充当细胞间通讯的载体(balajetal.，“tumourmicrovesiclescontainretrotransposonelementsandamplifiedoncogenesequences,”natcommun2：180(2011)；choietal.，“proteomics，transcriptomicsandlipidomicsofexosomesandectosomes,”proteomics13：1554-1571(2013)；thakuretal.，“double-strandeddnainexosomes：anovelbiomarkerincancerdetection，”cellres24：766-769(2014)；tettaetal.，“extracellularvesiclesasanemergingmechanismofcell-to-cellcommunication，”endocrine44：11-19(2013))。此外，通过本文描述的工作，已经发现了被称为“外泌颗粒(exomere)”(～35nm)的新型非膜性纳米颗粒群，其实际上是由大多数类型的细胞分泌的主要细胞外纳米颗粒(enp)。外泌体是由包括癌细胞在内的大多数细胞类型分泌的内体来源的纳米级细胞外膜囊泡(theryetal.，“exosomes：composition，biogenesisandfunction，”naturereviews.immunology2：569-579(2002)；elandaloussietal.，“extracellularvesicles：biologyandemergingtherapeuticopportunities,”naturereviews.drugdiscovery12：347-357(2013)；raposoetal.，“extracellularvesicles：exosomes，microvesicles，andfriends,”thejournalofcellbiology200：373-383(2013))。蛋白质、遗传物质(例如，mrna、mirna、lnrna、dna)、代谢物和脂质被选择性地募集并包装到外泌体中，外泌体横向地将它们的负载物转移到受体细胞中，从而充当病理和生理条件下细胞间通讯的载体(balajetal.，“tumourmicrovesiclescontainretrotransposonelementsandamplifiedoncogenesequences,”naturecommunications2：180(2011)；choietal.，“proteomics，transcriptomicsandlipidomicsofexosomesandectosomes,”proteomics13：1554-1571(2013)；thakuretal.，“double-strandeddnainexosomes：anovelbiomarkerincancerdetection，”cellresearch24：766-769(2014)；tettaetal.，“extracellularvesiclesasanemergingmechanismofcell-to-cellcommunication,”endocrine44：11-19(2013))。通过利用这些知识，转化研究人员已经专注于开发基于外泌体的诊断/预后生物标志物和治疗策略。本发明旨在克服本领域中的这些和其他缺陷。发明概述本发明的第一个方面涉及一种诊断受试者的癌症的方法。这个方法涉及选择患有癌症的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤来诊断癌症。本发明的另一个方面涉及一种预后受试者的癌症的方法。这个方法涉及选择患有癌症的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤来预后癌症。本发明的另一个方面涉及一种管理受试者的治疗的方法。这个方法涉及选择正在接受癌症治疗的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤，调整治疗。本发明的另一个方面涉及一种适用于诊断癌症的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种适合检测以下内容的试剂：(1)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合，其中所述外泌颗粒的直径小于50nm，所述小外泌体的直径为60至80nm，且所述大外泌体的直径为90至120nm。通过本文所述的研究，评估了af4的几个关键参数的影响，这些参数对于不同外泌体子集的高分辨率分离至关重要。这些影响因素包括错流、通道高度、样品聚焦、膜的类型和上样量。应该注意的是，这些因素共同决定了分馏(fractionation)的质量，并且改变一个参数通常会影响其他因素对分辨力的影响。然而，测试这些因素的不同组合可能很昂贵、费时和费力，因此是不切实际的。了解af4的工作原理并确定所分析样品的复杂性将有助于指导方法开发过程。本发明描述了对由大多数细胞类型(包括癌细胞)分泌的新型纳米颗粒的鉴定，所述新型纳米颗粒被称为外泌颗粒。外泌颗粒是由细胞分泌的一群显著的且异质的小的(＜50nm流体动力学直径，峰值约35nm)、带微弱负电荷的(-2.7mv至-9.7mv)且高度刚性(～145-816mpa)的纳米颗粒。结构分析表明外泌颗粒缺乏外部脂质双层膜结构，分子表征显示了其组成为多种生物学功能分子，包括蛋白质、脂质、核酸(dna和rna)、代谢物和聚糖。除外泌颗粒外，还有两种不同的外泌体子集，即采用不对称流场-流分馏(af4)技术分离的小外泌体(exo-s，60-80nm)和大外泌体(exo-l，90-120nm)。与外泌颗粒相比，exo-s和exo-l都具有外部脂质双层膜结构，带有更多的负电荷，并且比外泌颗粒更柔软。本文所述的研究表明，当互相比较时，各纳米颗粒类型，即外泌颗粒、exo-s和exo-l包含独特的分子标记。这些纳米颗粒被分泌到细胞的周围环境和外周循环系统以及其他类型的体液中。因此，这些纳米颗粒代表了用于癌症诊断、预后和监测疾病进展以及治疗后复发的生物标志物库。此外，外泌颗粒和外泌体子集都可以将其负载物横向转移至受体细胞，从而在生理和病理条件下均充当细胞间通讯的载体，进而代表了治疗开发的靶标。具体地，外泌颗粒蛋白质组学分析显示富集代谢酶和缺氧、微管和凝血蛋白以及特定通路，例如糖酵解和mtor信号传导。exo-s和exo-l分别包含参与内体功能和分泌途径，以及有丝分裂纺锤体和il-2/stat5信号传导通路的蛋白质。生物分布检测显示，外泌颗粒主要靶向肝脏、脾脏和骨髓等器官，从而暗示其在肿瘤进展过程中的全身调节中的潜在作用。与对外泌颗粒观察到的不同，exo-s表现为被肺摄取较高以及exo-l被淋巴结摄取较高，表明它们在疾病进展过程中分别在介导器官特异性转移和免疫应答中的潜在作用。综上所述，新鉴定的外泌颗粒、exo-s和exo-l在充当癌症患者的生物标志物和治疗靶标方面表现出独特的潜力。附图简述图1a-1g显示了通过af4和em成像分析对由肿瘤细胞释放的外泌颗粒和两个不同的外泌体亚群的鉴定。图1a显示了源自b16-f10的外泌体的代表性af4分馏曲线。x轴，时间(分钟)；y轴(标尺)以及黑点，流体动力学半径(nm)；红线和蓝线分别示出了qels(dls)强度和uv吸光度(以相对标尺显示)。p1-p5标记基于uv吸收率检测到的峰。合并外泌颗粒(流体动力学直径＜50nm)；exo-s(60-80nm)；和exo-l(90-120nm)的馏分。图1b显示了在峰3(p3)，t＝25.1min处的代表性相关函数。对于1a和1b，实验独立重复50次，结果相似。图1c显示了外泌体输入混合物(分馏前)和分馏的外泌颗粒、exo-s和exo-l亚群的tem成像分析。箭头指向外泌颗粒(红色)，exo-s(蓝色)和exo-l(绿色)。比例尺，200nm。该实验独立重复7次，结果相似。图1d显示了分馏后的样品中外泌体标记蛋白的蛋白质印迹分析。分析了100μg全细胞提取物(wce)和10μg的外泌体和外泌颗粒混合物输入物，以及每个子集。该实验进行了一次。图1e显示了在合并了从单个af4分馏中收集的各纳米颗粒子集的馏分后，使用zetasizer以批处理模式对来源于代表性细胞系(即b16-f10(f10)、aspc-1、pan02、mda-mb-4175(4175)和4t1)的外泌颗粒、exo-s和exo-l的流体力学直径的测量结果。数据以平均值±sem(均值的标准误)表示，顺序为外泌颗粒、exo-s和exo-l：b16-f10(分别为n＝10、9和8次独立测量)；pan02(n＝11、6、11)；aspc-1(n＝5、5、5)；4175(n＝3、5、3)；4t1(n＝5、5、5)。图1f显示了从新鲜人黑素瘤组织外植体培养物中收集到的馏分的tem成像分析。比例尺，200nm。对两个独立的标本进行了该实验，结果相似。图1g显示了以批处理模式对图1f中所示的馏分的流体动力学直径的测量值。数据以平均值±sem表示(外泌颗粒和exo-l，n＝6；exo-s，n＝7次独立测量)。未处理的印迹提供于图14中。图2a-2k显示了使用tem成像和nta分析对af4馏分的表征以及在不同的培养和储存条件下对源自细胞的纳米颗粒的af4曲线的检查。图2a显示了对b16-f10的af4峰p1和p5中的颗粒的tem分析。实验独立重复3次，结果相似。比例尺，500nm。图2b显示了对通过af4-qels和nta确定的各馏分流体动力学直径的比较。在af4的时程中，从20至44分钟每2分钟提取一次单个馏分(时间片，0.5分钟/馏分)，并进行nta处理。结果以平均值±sem表示(n＝3个独立样品)。使用了nta的模式大小(modesize)。x轴，af4的时程(分钟)；y轴，流体动力学直径(nm)。图2c显示了由nta得到的代表性馏分的大小分布曲线(输入，未分馏样品；20、32和44分钟时的馏分)。nta对在20和44分钟时的馏分检测到了多个峰。输入的模式大小为126nm表示nta无法有效解析多分散样品，并且偏向大颗粒。将该实验独立重复3次，结果相似。图2d显示了通过nta测得的各馏分的颗粒浓度。峰馏分(28分钟)的流体力学直径为77nm。所示结果为平均值±sem(n＝3个独立样品)。图2e-2i显示了b16-f10sev的af4曲线，b16-f10sev收集自以下：技术重复(蓝线，重复编号1；红线，重复编号2)(图2e)，生物学重复(红线，qels；蓝线，uv；黑点(重复编号1)和绿点(重复编号2)，流体动力学半径；uv和qels信号强度的差异是由于两次重复的输入样品量的不同导致的)(图2f)，在4℃或-80℃保存一周(红线，qels；蓝线，uv；黑(新鲜)和绿点(冷冻)，流体动力学半径)(图2g)，来自不同传代数细胞(蓝线和红线，第10和18代细胞分别的uv；黑点，流体动力学半径)(图2h)，以及在低氧与常氧条件下持续48h的比较(蓝线和红线，分别用20％和1％o2培养的样品的uv；黑点，流体动力半径)的af4曲线(图2i)。图2e-2g和图2h的实验分别独立地重复3次和2次，结果相似。对于图2i，用3种不同的细胞系独立地重复实验，得到相似的结果。图2j和2k显示了从空白培养基对照和b16-f10及mda-mb-231-4175的3天培养物cm平行分离到的纳米颗粒的af4(图2j)和tem(图2k)分析。该实验进行了一次。(红线和蓝线，uv；黑点，流体动力学半径；比例尺，200nm。)图3a-3b显示了对由多种癌细胞系释放的外泌颗粒和外泌体亚群的鉴定。显示了来源于各种癌细胞系(包括aspc-1、pan02、mda-mb-231-4175和4t1)的未分馏的输入样品和外泌颗粒、exo-s及exo-l的合并馏分的af4曲线(图3a)和代表性tem图像(图3b)。进行了多个独立的实验，获得了相似的结果(图3a)(重复次数：aspc-1，9x；pan02，16x；4175，17x；4t1，10x)和(图3b)(aspc-1，3x；pan02，2x；4175，1x；4t1，4x)。比例尺，200nm。x轴，时间(分钟)；y轴(标尺)以及黑点，流体动力学半径(nm)；红线和蓝线分别示出了qels(dls)强度和uv吸光度(以相对标尺示出)。图4a-4b显示了在从组织外植体培养物中分离到的样品中检测外泌颗粒、exo-s和exo-l。图4a为从新鲜人黑素瘤组织的外植体培养物中分离到的外泌体的af4曲线。红线和蓝线分别描述了qels(dls)强度和uv吸收率。用4个独立的标本重复该实验，结果相似。图4b显示了从正常小鼠乳腺脂肪垫和肺组织的外植体培养物中分离到的外泌体样品的tem图像。将该实验独立重复2次，结果相似。比例尺，500nm。图5a-5d显示了对外泌颗粒和外泌体亚群的物理和机械性能的表征。使用zetasizer和afm压痕分别测量了来源于各种癌细胞的外泌颗粒和外泌体亚群的ζ电位(图5a)和刚度(图5b)。用杨氏模量表示颗粒刚度。分别对各组颗粒的至少3个和5个重复测量了ζ电位和刚度。数据表示为平均值±sem。对于图5a，按以下顺序：外泌颗粒、exo-s和exo-l：b16-f10(分别为n＝8、10和12次独立的测量)；pan02(n＝13，11，13)；aspc-1(n＝12，12，12)；4175(n＝17，9，6)；4t1(n＝13，3，9)；对于图5b，b16-f10(测量了n＝6、6、6个颗粒)；pan02(n＝6，6，6)；aspc-1(n＝21，19，16)；4175(n＝11，10，5)；4t1(n＝9，8，9))。图5c显示了来源于b16f10的外泌颗粒的代表性afm图像。用来源于3个不同细胞系的样品重复进行此实验，结果相似。图5d显示了对来源于b16f10(分析了n＝754个颗粒)，aspc1(n＝475)和mda-mb-4175(n＝160)的外泌颗粒的高度(z维度)的afm成像分析。描绘了平均值±sem。图6a-6g显示了对来源于各种癌细胞的外泌颗粒和外泌体亚群的蛋白质组学分析。图6a显示了在各颗粒子集中鉴定的蛋白质的维恩图。图6b和图6c显示了对来自人(mda-mb-4175和aspc1)和小鼠(b16f10、4t1和pan02)细胞系的基准化蛋白质组质谱数据集的主成分分析和一致性聚类分析。图6d显示了与外泌颗粒、exo-s和exo-l特异性相关的独特蛋白质的热图图示。显示的标尺为强度(面积)减去平均值并除以行标准差(即δ(面积-平均值)/sd)。图6e显示了分馏的样品中代表性特征蛋白的蛋白质印迹分析。分析了等量(10μg)的外泌体和外泌颗粒输入混合物和各子集。该实验进行了一次。图6f显示了在外泌颗粒、exo-s和exo-l中常规外泌体标志物的相对丰度的热图图示。显示的标尺为强度(面积)减去平均值并除以行标准差(即δ(面积-平均值)/sd)。图6g显示了通过基因集富集分析(gsea)鉴定的富集于外泌颗粒、exo-s和exo-l群体中的排名前列的候选基因集。纳米颗粒各子集中的蛋白质通过gsea根据其差异表达水平进行排名。使用基准化富集得分(绿线)评估预先确定的通路是否在纳米颗粒各子集中朝基因排名表的最高或最低的方向显著地过表达。黑色竖线标记特定通路的成员在基因排名表中出现的位置。在图的下方列出了对富集得分贡献最大的蛋白质。对于所有蛋白质组学分析(图6b-6d，图6f-6g)，对总共30个样品(来源于5个不同细胞系的3个纳米颗粒亚型；以及各纳米颗粒样品的两个独立的生物学重复)进行了统计分析。未处理的印迹提供于图14中。图7a-7e显示了来源于多个癌细胞系的外泌颗粒和外泌体亚群的蛋白质组学分析。图7a显示了来源于包括mda-mb-231-4175、aspc-1、4tl、b16f-10和pan02的多个细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l的基准化蛋白质组质谱数据的主成分分析。对于各纳米颗粒样品，分析了两个独立的生物学重复。图7b是rab家族蛋白在外泌颗粒、exo-s和exo-l中的相对丰度的热图图示。显示的标尺为强度(面积)减去平均值并除以行标准差(即δ(面积-平均值)/sd)。图7c显示了对在来源于不同细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l中检测到的总蛋白中脂蛋白-颗粒相关蛋白(表2所列)的存在的评估。显示的结果是2个生物学独立实验的平均值。图7d显示了hdl、ldl和vldl的tem成像分析。比例尺，200nm。该实验进行了一次，并且多个图显示了相似的结果。图7e显示了通过gsea鉴定的信号传导通路包括低氧(fdr，q值＝0.004)，微管(fdr，q值＝0.002)和凝血(fdr，q值＝0.013)与外泌颗粒的特异性关联(左图)和纳米颗粒的不同子集中相关蛋白的表达水平的热图图示(右图)。总共对n＝30个样品(来源于5个不同细胞系的3种纳米颗粒亚型；各纳米颗粒样品的两个独立的生物学重复)进行了kolmogorov-smirnov统计分析。图8a-8c显示了对与外泌颗粒、exo-s和exo-l相关的蛋白质的n-糖基化的表征。图8a显示了与外泌颗粒相关的蛋白质的n-聚糖谱的凝集素印迹分析和与外泌体亚群exo-s和exo-l相关的蛋白质的n-聚糖谱的凝集素印迹分析的比较。菜豆(phaseolusvulgaris)红细胞凝集素(e-pha)和菜豆(phaseolusvulgaris)白细胞凝集素(l-pha)分别识别对分和支链n-聚糖。橙黄网孢盘菌(aleuriaaurantia)凝集素(aal)识别fucα6glcnac和fucα3glcnac。西洋接骨木(sambucusnigra)凝集素(sna)识别α-2，6-连接的唾液酸。所有实验独立重复两次，结果相似，但针对b16-f10和4175的aal和e-pha印迹仅进行一次。图8b显示了对b16f10的外泌颗粒、exo-s和exo-l子集中存在的糖蛋白的n-聚糖进行的质谱分析。示出了两个生物学上独立的重复的一次代表性实验。图8c显示了b16f10的外泌颗粒、exo-s和exo-l中的六个最丰富的n-聚糖结构的相对丰度的比较。maldi-ms和纳米lc-esi-ms/ms的分配(assignment)(m/z)[电荷；中性交换]如下：(2015.8[-h；0]；1007.4a[-2h；0])，(2209.8[-h；0]；1104.4a[-2h；0])，(2237.7b[-h；na-h]；732.57a[-3h；0])，(2365.5b[-h；4k-4h]；783.9a[-3h；0]和1182.4a，b[-2h；4k-4h])，和(2404.8b[-h；2k-2h]；1201.9b[-2h；2k-2h])。所显示的数据已量化并对样品中最丰富的结构进行了基准化。结果表示为一个代表性实验的三次独立分析测量值的平均值。未处理的印迹提供于图14中。注意：a该物质的产物离子光谱不允许完整的结构分配。b分配允许唾液聚糖中质子与阳离子的中性交换，包括存在钾和钠。图9a-9j显示了对来源于aspc-1和mda-mb-231-4175的外泌颗粒、exo-s和exo-l中富集的n-聚糖的质谱分析。图9a显示了通过银染评估的源自aspc-1、mda-mb-231-4175和b16-f10的分离的外泌颗粒、exo-s和exo-l亚群的总蛋白谱含量。对于b16-f10和4175，该实验独立重复了两次，结果相似，而对于aspc-1，重复一次。图9b分别显示了来源于aspc-1(左图)和mda-mb-231-4175(右图)的颗粒的n-聚糖质谱。该实验进行了3次分析重复，结果相似。图9c和图9d显示了在对来源于aspc-1和mda-mb-231-4175的颗粒的研究中鉴定出的最丰富的六个n-聚糖结构的定量。所显示的数据已量化并对样品中最丰富的结构进行了基准化。结果分别表示为aspc-1和mda-mb-231-4175的2次和3次独立分析测量的平均值。nanohplc-pgc-hrms萃取离子色谱图(eic)和cid-ms/ms谱图，对于图9e-9gm/z1007.38(2-)处的离子，其对应于外泌颗粒特征性的核-岩藻糖基化复合型n-聚糖，以及对于图9h-9j为m/z1111.39(2-)处的离子，对应于b16f10所有馏分中发现的二唾液酸化的复合型n-聚糖。萃取离子色谱图m/z1007.38(2-)的的片段分析证实了外泌颗粒中该n-聚糖的结构(图9e和图9g)，并证明了exo-s中不存在该n-聚糖(图9f)。根据在pgc柱上的相对保留时间，外泌颗粒包含在m/z1111.39(2-)处离子的α2，3-连接和α2，6-连接的唾液酸糖型(sialoglycoform)(图9h)。来自exo-s的n-聚糖m/z1111.39(2-)显示在基于pgc-lc相对保留时间时，n-聚糖仅显示a2，3-连接的唾液酸(图9i)。该实验(图9e-9j)进行一次。图10a-10c显示了外泌颗粒和外泌体子集中脂质组成的表征。图10a显示了来源于不同细胞系的各纳米颗粒子集的总脂质含量的比较。将对样品重量和内标物基准化后的各样品的总信号强度与来自同一组样品的外泌颗粒的总信号强度进行比较(以倍数变化表示)。数据表示为平均值±sem(n＝3个生物学独立样品)。图10b显示了来自不同细胞系的各纳米颗粒子集中存在的各脂质类别的相对丰度。数据表示为平均值±sem(n＝3个生物学独立样品)。图10c显示了与外泌颗粒、exo-s和exo-l特异性相关的脂质类别的热图图示(anova测试，q＜0.05)。对各细胞系共9个样品进行统计分析(各纳米颗粒样品有3种不同的纳米颗粒亚型和3个独立的生物学重复)。缩写：cer，神经酰胺；cerg1-3，葡萄糖基神经酰胺；cl，心磷脂；dg，甘油二酯；lpc，溶血磷脂酰胆碱；lpe，溶血磷脂酰乙醇胺；lpg，溶血磷脂酰甘油；lpi，溶血磷脂酰肌醇；mg，甘油单酸酯；pc，磷脂酰胆碱；pe，磷脂酰乙醇胺；pg，磷脂酰甘油；pi，磷脂酰肌醇；ps，磷脂酰丝氨酸；sm，鞘磷脂；tg，甘油三酯。图11a-11d显示了与外泌颗粒和外泌体子集的相关的核酸的表征。图11a显示了与来自b16f10、aspc1和mda-mb-4175的代表性分馏的各颗粒亚群相关的dna的相对丰度。图11b显示了对与颗粒的不同子集相关的dna的大小分布的安捷伦生物分析仪分析。显示的数据是来自aspc1衍生颗粒的两个独立实验的代表性电电泳图谱(左)和电泳图像(右)。黑色箭头，内标(35bp和10380bp)。红线，外泌颗粒；蓝线，exo-s；绿线，exo-l。图11c显示了与来自b16f10和aspc1的代表性分馏的各颗粒亚群相关的总rna的相对丰度。图11d显示了从b16f10的不同馏分分离出的rna的大小分布。显示的是来自两个独立实验之一的代表性曲线。对于图11a和图11c，显示的数据是平均值(n＝2个生物学独立的样品)。图12显示了对与来源于b16-f10(上部)和mda-mb-231-4175(底部)的外泌颗粒、exo-s和exo-l相关的dna的大小分布的生物分析仪分析。该实验独立重复两次，得到相似的结果。图13a-13b显示了在同系初始小鼠中b16f10衍生的外泌颗粒和外泌体亚群的器官生物分布。图13a显示了使用odyssey成像系统(li-corbiosciences；n＝4个独立实验)对来自代表性实验的nir染料标记的外泌颗粒、exo-s和exo-l的全器官成像。针对各器官调整信号强度的动态范围，以便可以轻松识别这些纳米颗粒子集之间的差异。比例尺，2.5mm。图13b显示了在一个代表性实验中不同器官中纳米颗粒摄取的定量。该实验独立重复4次，结果相似。使用imagestudio(li-corbiosciences)获取各器官中的信号强度并将其对来自同一只动物的大脑进行基准化，这是由于大脑中无法检测到的纳米颗粒摄取。然后计算实验组(即输入，外泌颗粒、exo-s和exo-l)与模拟对照组之间各器官的倍数变化(y轴)。每组n＝3只动物，显示的结果为平均值±sem。使用单向anova确定统计学显著性(*p＜0.05；**p＜0.01，未标记，不显著)。对于淋巴结，输入与exo-l、外泌颗粒与exo-l以及exo-s与exo-l之间进行比较的p值分别为0.022、0.001和0.01。图14显示了图1、图6和图8中相关图的未处理的印迹。图15a-15c显示了af4工作原理的示意图。图15a-15c显示了af4通道的侧视图，其高度通常为数百μm。图中所示的部件尺寸仅供参考，未按比例绘制。图15a显示在聚焦阶段，相反方向的两个流从入口和出口泵入通道，并在注入口附近平衡。样品在聚焦阶段注入并聚焦在一条细带上。粒子达到与其扩散系数相关的水平高度。图15b显示了在普通(normal)模式的洗脱阶段中，具有较小流体动力学尺寸和高扩散系数的颗粒在较早的时间被洗脱，而具有较大流体动力学尺寸和低扩散系数的颗粒在较晚的时间被洗脱。图15c显示当颗粒的物理尺寸太大而与通道高度相比不能被认为是点质量时，其在空间(steric)模式下洗脱。与图15b所示的普通模型相反，大颗粒比较小颗粒更早洗脱。图16a-16c显示了错流对af4分馏的影响。图16a显示了通过在45分钟内以0.5ml/min的初始流速(峰标记为p0-p5；uv(红线)，qels(蓝线)，rh(黑点))，或者(图16b)初始流速为0.3ml/min(蓝线)，0.5ml/min(红线)或1.0ml/min(黑线)然后在45分钟内降到0ml/min，或者(图16c)初始流速为0.5ml/min，然后在15分钟(蓝色)、30分钟(黑色)或45分钟(红色)内降到0ml/min的方式施加线性错流梯度所收集到的b16-f10sev的代表性af4分馏曲线。顶部，100°处的qels；底部，在280nm处的uv吸收。af4的其他参数为：通道流速，1.0ml/min；通道高度490μm；样品聚焦时间，2分钟；膜，再生纤维素(rc)，输入量40μg。图17显示了通道高度对af4分馏的影响。显示的是通过使用垫片(spacer)为350μm(蓝色)和490μm(红色)的通道收集到的b16-f10sev的af4分馏曲线。顶部，100°处的qels；底部，在280nm处的uv吸收。af4的其他参数为：通道流速，1.0ml/min；错流的线性梯度在45分钟内从0.5ml/min减小到0ml/min；样品聚焦时间，2分钟；膜，再生纤维素(rc)，输入量40μg。图18显示了聚焦时间对af4分馏的影响。显示的是通过使用2分钟(红色)、5分钟(蓝色)或10分钟(黑色)的聚焦时间收集到的b16-f10sev的af4分馏曲线。顶部，100°处的qels；底部，在280nm处的uv吸收。af4的其他参数为：通道流速，1.0ml/min；错流的线性梯度在45分钟内从0.5ml/min减小到0ml/min；通道高度490μm；膜，再生纤维素(rc)，输入量40μg。图19显示了用于af4分析的样品(b16-f10sev)上样能力的检查。显示的是输入为15μg(黑色)、40μg(红色)、100μg(蓝色)或150μg(绿色)的b16-f10sev的af4分馏曲线。顶部，100°处的qels；底部，在280nm处的uv吸收。af4的其他参数为：通道流速，1.0ml/min；错流的线性梯度在45分钟内从0.5ml/min减小到0ml/min；通道高度490μm；样品聚焦时间，2分钟；膜，再生纤维素(rc)。图20显示了在使用不同的膜：再生纤维素(rc，红色)与聚(醚)砜(pes，蓝色)的情况下，af4分离ev的性能比较。使用以下af4参数分析b16-f10sev：通道流速，1.0ml/min；错流的线性梯度在45分钟内从0.5ml/min减小到0ml/min；通道高度490μm；样品聚焦时间，2分钟；输入量，40μg。顶部，100°处的qels；底部，在280nm处的uv吸收。图21a-21b显示了af4的整个程序和流动路径的示意图。图21a显示了用于细胞培养来源的sev的分离和af4分馏的实验设计概述。图21b是af4流动路径和在线检测器的布置的图示。图22a-22c显示了b16-f10sev的代表性af4分馏分析。示出了b16-f10sev的代表性af4分馏曲线(图22a)和在特定时间点的自相关函数(图22b)。图22c显示了峰p2(外泌颗粒)、p3(exo-s)和p4(exo-l)的合并馏分的tem成像分析。比例尺，200nm。彩色箭头指向各亚群中的代表性颗粒。图23a-23b显示了与pbs对照相比，来自注射了b16-f10衍生的外泌颗粒、exo-s和exo-l后24小时的小鼠的肝脏的基因表达分析。将10μg外泌颗粒，exo-s和exo-l以及等体积的pbs分别静脉注射到c57bl/6小鼠中。注射后24小时，收集小鼠的肝脏用于rna提取和测序分析。在各比较组中差异表达的基因总数列于图23a中，以及显示了与pbs对照相比显著改变的前2000个基因的聚类分析示于图23b中。每组n＝3。图24a-24b显示了与pbs对照组相比，经外泌颗粒、exo-s或exo-l处理的小鼠肝脏中前50个上调基因(图24a)和前50个下调基因(图24b)的热图图示。每组n＝3。图25a-25e显示了与pbs对照相比，在注射了b16-f10衍生的外泌颗粒、exo-s和exo-l后24小时的小鼠肝脏中差异性表达的基因的ingenuitypathwayanalysis(ipa)。显示的是在外泌颗粒和pbs(图25a)，exo-s和pbs(图25b)，exo-l和pbs(图25c)，外泌颗粒和exo-s(图25d)以及外泌颗粒和exo-l(图25e)之间的最被显著影响的代表性的通路。图26a-26c显示了与pbs对照相比，经b16-f10衍生的外泌颗粒、exo-s和exo-l处理的小鼠的肝脏的代谢质谱分析。丰度发生显著变化的代谢物通过使用不配对t检验(图26a)和单向anova分析来鉴定(图26b-26c)(通过单向anova检测到在各组中有差异的代谢物显示为(图26b)中的具体单个数据点，或(图26c)框中突出显示的聚群)。每组n＝3只小鼠。图27a-27b显示通过单向anova分析鉴定了与pbs对照相比，在外泌颗粒、exo-s和exo-l处理的所有三组小鼠肝脏中被上调或下调的代谢物，并且它们丰度的改变分别展示在图27a和图27b中。每组n＝3只小鼠。图28a-28c显示了与pbs对照相比分别在外泌颗粒(图28a)、exo-s(图28b)和exo-l(图28c)中特异性上调的代表性代谢物的例证。每组n＝3只小鼠。图29显示了免疫荧光共定位研究，该研究揭示了肝驻留巨噬细胞-库普弗细胞(kupffercell)是摄取b16-f10黑色素瘤来源的外泌颗粒的主要细胞类型。将用绿色荧光亲脂性pkh67染料或模拟标记反应混合物标记的外泌颗粒以静脉内的方式注射到初始的、同系c57bl/6小鼠中，并且注射后24小时，收集肝脏并固定用于免疫荧光共定位分析。每组n＝3只小鼠。染色f4/80(红色)以鉴定肝脏中的巨噬细胞。发明详述本发明的第一个方面涉及一种诊断受试者的癌症的方法。这个方法涉及选择患有癌症的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤来诊断癌症。本发明的另一个方面涉及一种预后受试者的癌症的方法。这个方法涉及选择患有癌症的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者取自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者取自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者取自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤来预后癌症。本发明的另一个方面涉及一种管理受试者的治疗的方法。这个方法涉及选择正在接受癌症治疗的受试者和从所述选择的受试者中获得直径小于50nm的外泌颗粒群，直径为60-80nm的小外泌体群或直径为90-120nm的大外泌体群。从所述样品中回收所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，并且使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体或其部分与一种或多种试剂接触，所述试剂适合检测以下内容：(1)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者获自所述受试者的先前样品中的水平的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的与癌症相关的核酸分子中存在或不存在一种或多种遗传突变，或(5)其组合。随后基于所述接触步骤来调整治疗。如本文所述的癌症预后包括确定癌性病症的可能进展和病程，以及确定患有癌症的受试者的恢复和生存的机会，例如，良好的预后表明癌症患者恢复和/或生存的可能性增加，而预后不良表明癌症患者恢复和/或生存的可能性降低。可以通过合适的治疗方法(即，能增加患有癌症的受试者的恢复和生存的可能性的治疗方法)的可用性来确定或调整受试者的预后。因此，本发明的另一方面包括基于所确定的预后选择合适的癌症治疗剂，并将所选择的治疗剂施用于受试者。预后还包括癌症的转移潜能。举例来说，基于蛋白质、n-聚糖、脂质和/或基因表型的存在或不存在的良好预后可以表明癌症是一种具有低转移潜能的癌症类型，并且患者长期恢复和/或生存的机率增加。或者，基于蛋白质、n-聚糖、脂质和/或基因表型的存在或不存在的不良预后可以表明癌症是具有高转移潜能的癌症类型，并且患者长期恢复和/或生存的机率降低。预后还包括对转移部位的预测，癌症阶段的确定，或确定受试者的原发性肿瘤的位置。某些蛋白质、n-聚糖、脂质的水平和/或与癌症相关的基因(例如，braf和/或egfr)的突变状态的改变指示存在癌症或随疾病的进展发生了癌症表型的变化。举例来说，从来自受试者的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dsdna样品中检测到遗传突变的存在，而在获自同一受试者的较早的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dsdna样品中未检测到遗传突变，可指示转移的特定部位或进展至癌症的更晚期。因此，定期监测外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dsdna突变状态能为检测原发性肿瘤的进展、转移以及促进对癌性病症的最佳靶向化或个性化治疗提供一种手段。在转移性癌症样品中对某些蛋白质、n-聚糖、脂质和/或外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dsdna突变的检测还可以鉴定原发性肿瘤的位置。举例来说，在转移性肿瘤或癌细胞衍生的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中检测到一个或多个braf突变可表明原发性肿瘤或癌症为黑色素瘤或脑癌的一种，例如胶质母细胞瘤。在转移性肿瘤或癌细胞衍生的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中检测到一个或多个egfr突变表明原发性肿瘤起源于肺部，或者原发性癌症为头颈癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌或食道癌。如上所述，本发明的另一个方面涉及一种管理患有癌症的受试者的治疗的方法。根据这个方面，基于所述接触步骤来调整癌症治疗。根据本发明的所有方面，“受试者”或“患者”涵盖任何动物，但优选哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、狗、猫、马、牛或啮齿类动物。更优选地，所述受试者或患者是人。在本发明的一些实施方案中，所述受试者患有癌症，例如但不限于，黑色素瘤、乳腺癌或胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是原发性肿瘤，而在其他实施方案中，所述癌症是继发性或转移性肿瘤。“外泌体”是从包括癌细胞(即“癌症衍生的外泌体”)在内的各种不同细胞中释放出的微囊泡。这些小囊泡(直径为50-100nm)来源于大的多囊泡内体，并被分泌到细胞外环境中。外泌体释放/脱落的确切机制尚不清楚；然而，这种释放是一种需要能量的现象，受到细胞外信号的调节。它们似乎是通过向晚期内体的限制膜进行内陷(invagination)和出芽而形成的，从而导致产生含有胞质溶胶的并在其表面暴露出膜结合细胞蛋白的细胞外结构域的囊泡。有研究通过使用电子显微镜显示了多囊泡内体与质膜的融合情况，导致内部囊泡被分泌到细胞外环境中。在大多数肿瘤细胞中，外泌体释放的速率是显著增加的并且持续发生。看起来外泌体的释放增加及其积累在恶性转化过程中是很重要的。如本文所述，已经鉴定出了两个外泌体亚群(即，exo-s和exo-l)。如本文所用，“exo-s”是指直径为60至80nm，平均表面电荷为-9.0mv至-12.3mv以及颗粒刚度为70至420mpa的小外泌体群体。exo-s还富集参与膜囊泡生物发生和运输、蛋白质分泌和受体信号传导的基因。如本文所用，“exo-l”是指直径为90至120nm，平均表面电荷为-12.3至-16.0mv，以及颗粒刚度为26至73mpa的大外泌体群体。exo-l还富集参与有丝分裂纺锤体、il-2/stat5信号转导、多器官细胞器组织和g蛋白信号转导的基因。除了exo-s和exo-l亚群之外，还已经鉴定出了一种新型的细胞外纳米颗粒。如本文所用，术语“外泌颗粒”是指直径小于50nm，通常为约35nm，平均表面电荷为-2.7mv至-9.7mv，以及颗粒刚度为145至816mpa的非膜性纳米颗粒。外泌颗粒富集代谢酶和缺氧、微管和凝血蛋白，以及参与糖酵解和mtor信号传导的蛋白根据本发明的方法，外泌颗粒、小外泌体和大外泌体可以从大多数生物流体中分离或获得，所述生物流体包括但不限于血液、血清、血浆、腹水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、脑脊液、眼泪、尿液、唾液、痰、乳头抽吸物、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道液、母乳、器官内系统液、腹膜液来自组织外植体培养物的条件培养基或其组合。可以使用本文所述的方法从生物样品获得外泌颗粒群、小外泌体群或大外泌体群。举例来说，可以从生物样品不对称流场-流分馏(af4)中浓缩或分离出外泌颗粒、小外泌体或大外泌体(fraunhoferetal.，“theuseofasymmetricalflowfield-flowfractionationinpharmaceuticsandbiopharmaceutics,”europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics58：369-383(2004)；yohannesetal.，“asymmetricalflowfield-flowfractionationtechniqueforseparationandcharacterizationofbiopolymersandbioparticles，”journalofchromatography.a1218：4104-4116(2011))。从体液(即外周血，脑脊液，尿液)分离出的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体可以被富集来自特定细胞类型的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体，例如，肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾脏、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳房、前列腺、大脑、食道、肝脏、胎盘和胎儿的细胞。由于外泌颗粒、小外泌体或大外泌体通常携带来自其供体细胞的表面分子(例如抗原)，因此表面分子可用于识别、分离或富集来自特定供体细胞类型的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体。这样，可以对源自不同细胞群的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体分析它们的核酸含量。举例来说，肿瘤(恶性的和非恶性的)外泌体携带肿瘤相关的表面抗原，可以通过这些特定的肿瘤相关表面抗原分离或富集这些外泌体。在一个实例中，肿瘤相关的表面抗原为上皮细胞粘附分子(epcam)，其对来自肺、结肠直肠、乳腺、前列腺、头颈和肝起源的癌症的外泌体具有特异性，但对血液细胞起源的癌症不具特异性(balzaretal..“thebiologyofthe17-1aantigen(ep-cam)，”jmolmed77(10)：699-712(1999)；wentetal.“frequentepcamproteinexpressioninhumancarcinomas,”humpathol35(1)：122-8(2004)，其全部内容在此参考并入)。在另一个实例中，表面抗原为cd24，其是对尿微囊泡特异的糖蛋白(kelleretal.“cd24isamarkerof外泌体ssecretedintourineandamnioticfluid，”kidneyint72(9)：1095-102(2007)，其全部内容在此参考并入)。在另一个实例中，表面抗原为cd70、癌胚抗原(cea)、egfr、egfrviii和其他变体、fas配体、trail、转铁蛋白受体、p38.5、p97和hsp72。或者，肿瘤特异性外泌体的特征可以在于缺乏表面标志物，例如缺乏cd80和cd86的表达。可以，例如，通过使用对所需的表面抗原具有特异性的抗体、适体(aptamer)、适体类似物或分子印迹聚合物，实现从特定细胞类型中分离外泌颗粒、小外泌体或大外泌体。在一个实施方案中，所述表面抗原对癌症类型具有特异性。在另一个实施方案中，所述表面抗原对不一定为癌性的细胞类型具有特异性。基于细胞表面抗原的外泌体分离方法的一个例子提供于美国专利号7,198,923中，该专利的全部内容在此参考并入。如例如授予toole的美国专利号5,840,867和授予toole的美国专利号5,582,981中所述，适体及其类似物特异性结合表面分子，并且可用作用于获取细胞类型特异性外泌体的分离工具，所述专利的全部内容在此参考并入。如例如美国专利号6,525,154、7,332,553和7,384,589中所述，分子印迹聚合物也可以特异性识别表面分子，并且是用于获取和分离特定于细胞类型特异性外泌体的工具，所述专利的全部内容在此参考并入。这些方法可适用于分离外泌颗粒、小外泌体或大外泌体。根据本发明的这个方面和其他方面，回收的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体随后与一种或多种适合于检测外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的一种或多种蛋白质的相对于未患癌症的受试者的标准或相对于来自患有癌症的受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在的一种或多种试剂接触。出于预后或管理癌症治疗的目的，选择已经或正在接受癌症治疗的受试者。在一个实施方案中，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：ppid、ganab、mat1a、cpyd、fat4、gmppb、erp44、calr、gpd1、bzw1、pfkl、olfml3、hgd、lgals3bp、gclc、pepd、mthfd1、pgd、actr3、xpnpep1、ugp2、snx2、aldoc、sept11、hspa13、aars、serpinh1、cndp2、pde5a、agl、ext1、idh1、serpinc1、rrm1、ckb、hmgcs1、hpd、psmc4、npepps、cat、ext2、corolc、b4gat1、rack1、mapre1、pgm1、pdia3、adk、shmt1、aco1、gsn、esd、ppp2r1a、aldh1l1、ola1、acly、eeflg、flnb、psmd11、angptl3、fermt3、pygl、mdh1和eifa2。在另一个实施方案中，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：ttyh3、flot1、flot2、tspanl4、lamc1、cd63、mvb12a、zdhhc20、vamp3、vps37b、arrdc1和tgfbr2。在另一个实施方案中，从样品中回收大外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患癌症的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：sqstm1、stip1、hint1、wasf2、rasa3、epb41l2、gipc1、s100a10、mpp6、kif23、racgap1、anxa5、cask、dlg1、tjp1、bag5、txn、abi1、anxa1、capg、dbi、s100a6、chmp2b、chmp3、anxa2、myo1c、anxa4、snx12、lin7c、stxbp3、cep55、alcam、vcl、chmp1a、farp1、acsl4、baiap2、sh3gl1、dstn、lgals1、cyfip1、ctnna1、rab31、arf6、slc1a5、eps8、fmnl2、pgam1、cnp、chmp4b、anxa3.vps4b、gng12、pacsin3、glg1、vta1、lyn、vps37c、chmp5、f3、dnaja1、rhoc、gna13、chmp2a、atp2b1、rdx、atp1b1、capzb、ehd1、dnaja2和ctnnd1。可以进行本文所述的方法以诊断、预后或管理特定类型的癌症的治疗。举例来说，在一些实施方案中，可以诊断或预后黑色素瘤、乳腺癌或胰腺癌。在其他实施方案中，可以调整黑素瘤、乳腺癌或胰腺癌的治疗。在一个实施方案中，可以进行所述方法以诊断、预后或管理黑素瘤的治疗。出于预后或管理黑色素瘤的治疗的目的，选择已经或正在接受黑色素瘤治疗的受试者。根据这个实施方案，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患黑色素瘤的受试者的标准或相对于来自所述受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：itih2、itih3、h2afx、pmel、mat1a、hpd、alb、b4gat1、arf1、gclc、hgd、ppp2cb、pah、agl、rnpep、ppid、bzw1、me1、dpyd、ca6、olfml3、npepps、prep、erp44、reln、gpd1、gfpt1、cndp2、pfkl、aldh8a1、atp6v1a、eno2、thbs3、coro1c、ext1、cat、xpnpep1、pygl、calr和lgals3bp。在另一个实施方案，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患黑色素瘤的受试者的标准或相对于来自所述受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：tyrp1、sdcbp、sdcbp、cd63、igsf8、hspa8、mlana、hba1/hba2、gpnmb、dct、hspa2、hspa1l、hspa5、fv4、pdcd6ip、rab7a、env1、cd81、gnb1、syt4、gnb2、hist1h2ah、gnai2、gapdh、apoe、bc035947、hist1h2al、actg1、actb、gnb4、gnai3、slc3a2、actc1、gnas、slc38a2、hist2h2bf、atp1a1、tfrc、tmem176b、vamp8、tspan10、adgrgl、histlh4a、pmel、ubl3、ppia、actbl2、cd9、bace2和tspan4。在又一个实施方案，从样品中回收大外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患黑色素瘤的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：hspa8、tyrp1、sdcbp、hspa2、rps27a、hspa1l、mlana、hspa5、cd63、igsf8、gpnmb、fv4、env1、pdcd6ip、hspala/hspa1b、dct、actg1、actb、ppia、slc3a2、actc1、cd81、itm2c、rab7a、gnb1、tspan4、dnaja1、gnb2、tfrc、hba1/hba2、gnai2、syt4、gapdh、apoe、pmel、mfge8、gnb4、gnai3、gnao1、dnaja2、atp1a1、itgb1、tmem59、slc38a2、gna12、itm2b、gnas、hist1h2ah、lamp1和eef1a1。在另一个实施方案中，进行所述方法以诊断、预后或管理乳腺癌的治疗。出于预后或管理乳腺癌的治疗的目的，选择已经或正在接受乳腺癌治疗的受试者。根据这个实施方案，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患乳腺癌的受试者的标准或相对于来自所述受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：fgb、hist2h2ab、comp、hist1h2bj、c7、gsta5、eno3、arf3、sult1c4、eif4a2、mat1a、gnb2、ugdh、akr1b10、mthfd1、ctsc、dpp3、rpsa、otub1、aldh8a1、f11、ctps2、mgat1、hyh1、lgalsl、gstm3、gstm5、psmc1、f8、prkar2b、rpl10a、hnrnpk、sema6d、snx5、iars、lcp2、arpc4、ppp6c、psmd6、ptprs、tie1、psmd8、pabpc4、rps18、chad、ipo5、fabp3、galnt2、qpct、stat5a、sema3a、nt5c2、ide、stat3、dpysl3、pdxk、arf5、psmd5、gne、nbeal2、fhl1、timp3、postn、mapre2、itih3、c3、eno2、ppid、oit3、cand1、sept2、ube2n、dpysl2、ckb、ptges3、dstn、pklr、thbs3、rap1b、hist2h2ab、actbl2、tubb2a、f10、cntn1、hpd、ace、eml2、hspa13、tnxb、hexb、calr、adh5、gpx1、cfl2、krt76、tcp1、cotl1、dynll1、hgd、aldoc、eprs、glo1、man2a1、flt4、nap1l4、rars、hmgcs1、ganab、sept7、fkbp4、col12a1、adsl、akr1c20、vasn、ddx39b、me1、comt、aldhla1、eif4a3、cdh11、prps1i3、pnpep、npepps、sept11、cmbl、psmd1、actr1b、psmd3、gclc、fat4、lpl、gpd1l、gclm、vars、phpt1、cacna2d1、sept9、glrx3、aars、gmppb、snx2、glod4、ptprf、csad、pxdn、agl、dpyd、prkacb、lars、ppid、lta4h、psmd7、capnsl、etf1、iars、vps35、tkfc、hyou1、pgm2、tkt、hmcn1、cyb5r3、gps1、umps、snd1、rtcb、rpl26、carm1、plcg2、p4ha2、coro6、gmps、igsf8、ppp1r7、timp3、uxsl、dnm2、memo1、rps3、arhgd1a、ptges3、nrp2、rab1a、hbg2和ywhaq。在另一个实施方案，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患乳腺癌的受试者的标准或相对于来自所述受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：sdcbp、hist1h2bn、hist1h2ah、hba1/hba2、itgb1、hist1h4a、pdcd6ip、hist3h2bb、h2afx、cd9、cd63、itga3、itih2、mfge8、h2afz、ptgfrn、hist1h3b、hspa8、actg1、actb、arrdc1、actc1、itih3、igsf8、gsn、tuba4a、hist1h1d、tubala、hist1h1c、thbsl、hspa2、eno1、mvb12a、htra1、gapdh、histlhle、vps28、tsg101、tubb、tubb4a、rap1b、pfn1、cd81、vps37b、tubb6、rap1a、epcam、hist1h1b、ppia、adam10、hba1、hist1h2bk、a2m、edil3、sdcbp、mfge8、gsn、hist2h2ac、hist1h2ac、h2afx、actb、thbs1、itih4、tubb、tubb2a、tubb4b、f10、h2afz、tubb4a、tubb6、tubb1、hspa8、cd9、cd81、gapdh、pfn1、hist1h4a、hsp90aa1、hsp90ab1、hspa2、hist2h3a、pgk1、thbs2、eef1a1、gpx3、itgb1、ppia、pdcd6ip、eef1a2、fbln1、atic、cpne8、tln1、hspa5、pkm、hist1h1c、wdr1、ran、pygl和itga3。在又一个实施方案，从样品中回收大外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患乳腺癌的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：pdcd6ip、sdcbp、ehd1、itgb1、s100a6、itga3、cd9、vps37c、hist1h4a、rap1b、ctnna1、msn、hist1h2ah、itga2、ptgfrn、actg1、hist1h2bn、calm1、epcam、itga6、ywhae、hspa1a/hspa1b、gnb1、slc3a2、gnb2、ehd2、h2afx、ppia、nt5e、vps4b、gnb4、cdc42、slc1a5、gnai2、cfl1、ywhah、eef1a1、ywhab、hist1h3b、tsg101、ywhag、anxa5、gnai3、f5、h3f3a/h3f3b、chmp4b、hspa5、ezr、gapdh、cd81、edil3、hba1/hba2、ubc、sdcbp、hspa8、itgb1、cd9、hspa2、actc1、actb、actg1、pdcd6ip、afp、hbg2、anxa2、itga3、hist1h2bk、gapdh、cd81、slc3a2、gnai2、gnai3、gnai1、atp1a1、hist2h2ac、cpne8、ist1、pfn1、tuba4a、h2afx、tuba1c、hspa5、ywhaz、eno1、anxa5、gnas、dnaja1、chmp5、eef1a1、rhoa、krt1、cep55、gnb1、actbl2、itga2、epha2、gna13、ppia、rap1a和cd59。在另一个实施方案中，进行所述方法以诊断、预后或管理胰腺癌的治疗。出于预后或管理胰腺癌的治疗的目的，选择已经或正在接受胰腺癌治疗的受试者。根据这个实施方案，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患胰腺癌的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：sult1e1、pklr、eno2、akr1b1、fh、mgat2、gpx1、dpp3、sema4b、gpd1、csad、ncam1、pcmt1、nars、thop1、umps、pde5a、cacna2d1、tie1、cdhll、aox1、f8、glb1、rpl10a、acap2、uxs1、adsl、bmp1、psmd3、lancl1、glo1、ppp2ca、esd、psmd5、farsb、pafah1b1、snx5、xpo1、mapre1、aprt、neo1、gba、thbs1、pygl、thbs2、fat4、cntn1、akr1c20、eif4a2、esd、bpgm、vasn、mat1a、mat2a、pfkl、clic5、hgd、glod4、agl、plekhb2、clstn1、st13、cmbl、akr1e2、prkar2a、gpd1、lgalsl、gla、il1rap、gmppb、pcsk6、sept9、psmc6、fyn、pafah1b1、vps37c、ctnnd1、nrbp1、erp44、shmt1、dars、adsl、gclm、aldoc、epha4、pepd、ckb、pcmt1、ugdh、prkar1a和gnas。在另一个实施方案，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患胰腺癌的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：sdcbp、pdcd6ip、hspa8、igsf8、cd9、ptgfrn、actc1、ly6e、actb、mfge8、hspa2、cd81、itga3、itgb1、itih2、vps28、cd63、htra1、env1、fv4、gsn、eno1、edil3、mvb12a、ifitm3、serpinc1、actbl2、tuba4a、ppia、hspa1a/hspa1b、hspa5、gapdh、tsg101、tubb、plekhb2、tuba1c、tubb4b、pfn1、gpci、gja1、ehd1、gnb2、tspan4、gnai2、slc3a2、vps37b、gnai3、rab7a、eef1a1、gnas、alb、hba1/hba2、cd9、ubc、sdcbp、f2、actg1、actb、cd59、actc1、acta2、a2m、hist1h2bk、hist1h2bj、hspa8、tspan3、hist2h2ac、cd55、h3f3a/h3f3b、hist2h3ps2、pdcd6ip、itgb1、potej、serinc5、h2afz、arrdc1、cldn3、nt5e、epcam、cdh17、atp1a1、alppl2、hist2h2ab、alpp、hspa2、tspan8、mvp、adam10、thbs1、vnn1、itgav、igsf8、myof、atp1a2、ahcy、gsn、tspan1、ppia、sdcbp2和hspa5。在又一个实施方案，从样品中回收大外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种蛋白质的相对于没有患胰腺癌的受试者的标准的更高或更低的水平，或者存在或不存在来进行：actc1、actgl、actb、mfge8、itgb1、hspa8、itga3、sdcbp、gapdh、lgals1、env1、fv4、ywhaz、ppia、gnb1、gnai2、gnb2、actbl2、gnai3、cfl1、marcks、gnas、eeflal、eno1、bsg、calml、s100a4、msn、ezr、rdx、ptgfrn、pkm、slc3a2、hba1/hba2、edil3、gna13、rhoa、rhoc、s100a6、ywhae、aldoa、pdcd6ip、pfn1、hsp90ab1、ywhaq、anxa1、anxa2、atp1a1、itga6、ubc、hba1/hba2、cd9、actg1、actb、cd59、mvp、sdcbp、actc1、acta2、hist1h2bk、hist2h2ac、alb、hspa8、hist1h2bj、cd55、h3f3a、tspan3、hist2h3ps2、potej、dpp4、nt5e、epcam、vnn1、h2afz、itgb1、alppl2、hist2h2ab、atp1a1、alpp、ist1、pdcd6ip、muc13、anxa11、hspa2、cdh17、gpa33、anxa2、s100a6、atp1a2、ppia、egfr、tspan8、myof、gnai1、gnai2、gnai3、s100a4、cldn3和a2m。将一种或多种蛋白质水平与同一种或多种蛋白质的“标准”水平进行比较，以鉴定受试者为患有癌症或处于转移性疾病风险中的受试者。在一个实施方案中，蛋白质的标准水平是取自健康个体队列的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中蛋白质的平均表达水平(即，非癌性外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的平均水平)。在另一个实施方案中，所述标准水平是取自患有原发性肿瘤(例如从未转移至肝或身体的其他器官的胃肠道肿瘤)的个体的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的标志物的平均水平。在另一个实施方案中，蛋白质的标准水平是在较早的时间点(例如癌前时间点)取自被测的受试者的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的蛋白质的水平。根据本发明的所有方面，“较高水平”是指高于标准水平的表达水平(即，蛋白质或基因表达水平)。举例来说，较高的表达水平至少比标准表达水平高50％。“较低水平”是指低于标准水平的表达水平(即，蛋白质或基因表达水平)。举例来说，较低的表达水平比标准表达水平低至少50％。根据这个方面以及与检测样品中一种或多种蛋白质的较高或较低水平或存在或不存在有关的本发明的其他方面，用于检测蛋白质的适当方法包括，但不限于，测量rna表达水平和蛋白质表达水平。这些方法是本领域常用的。对于测量蛋白质表达水平，该方法通常包括使样品与一种或多种适用于测量蛋白质表达的可检测试剂(例如，标记的抗体或与第二抗体结合使用的一抗)接触，并基于样品中相对于样品中的总蛋白基准化后的可检测试剂水平测量蛋白质表达水平。本领域常用的用于检测外泌体样品中蛋白质表达水平的适当方法包括，例如但不限于，蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)或荧光激活细胞分选(facs)。将测得的样品中的蛋白质表达水平与在参照外泌体样品中测得的蛋白质表达水平进行比较，并基于该比较确定转移性疾病的类型。通过定量mrna的表达来测量基因表达可以通过使用本领域已知的任何常用方法来实现，包括rna印迹法和原位杂交(parkeretal.，“mrna：detectionbyinsituandnorthernhybridization,”methodsinmolecularbiology106：247-283(1999)，其全部内容在此参考并入)；rna酶保护分析(hodetal.，“asimplifiedribonucleaseprotectionassay,”biotechniques13：852-854(1992)，其全部内容在此参考并入)；逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)(weisetal.，“detectionofraremrnasviaquantitativert-pcr，”trendsingenetics8：263-264(1992)，其全部内容在此参考并入)；基因表达的序列分析(sage)(velculescuetal.，“serialanalysisofgeneexpression，”science270：484-487(1995)；和velculescuetal.，“characterizationoftheyeasttranscriptome，”cell88：243-51(1997)，其全部内容在此参考并入)。在其他实施方案中，随后使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体与一种或多种适于检测所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的一种或多种n-聚糖的相对于没有患癌症的受试者的标准或相对于来自患有癌症的受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在的试剂接触。处于预后或管理癌症的治疗的目的，选择已经或正在接受癌症治疗的受试者。根据这个实施方案，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组的n-聚糖进行：n-聚糖(岩藻糖)+glcnacβ1-6(glcnacβ1-2)manα1-6(glcnaβ1-4(glcnacβ1-2)manα1-3)manβ1-4glcnacβ1-4(fucα1-6)glcnacβ1-asn和n-聚糖(岩藻糖)+neu5acα2-8neu5acα2-3galβ1-3/4glcnacβ1-2manα1-3(manα1-3(manα1-6))manα1-6)manβ1-4glcnacβ1-4glcnacβ1-asn。在另一个实施方案中，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测n-聚糖来进行。在另一个实施方案中，从样品中回收大外泌体，并且该方法通过检测n-聚糖来进行。分析糖蛋白的方法是本领域众所周知的。举例来说，第一步，将纳米颗粒裂解并收集总蛋白，其中包含目标糖蛋白。如果需要，可以通过常规的碳水化合物分析技术很容易地分析糖蛋白的复合碳水化合物部分。举例来说，本领域中众所周知的技术诸如凝集素印迹等揭示了末端甘露糖或其他糖例如半乳糖的比例。唾液酸对单-、双-、三-或四-触角寡糖的封端可通过使用无水肼或酶法从蛋白质中释放糖随后通过离子交换或尺寸排阻色谱法或本领域中众所周知的其他方法分馏寡糖来确定。在用神经氨酸酶处理以去除唾液酸的之前和之后，还可以测量糖蛋白的等电点(pi)。神经氨酸酶处理后pi的增加表明糖蛋白上存在唾液酸。碳水化合物可以通过本领域已知的任何方法进行分析，包括本文所述的那些方法。用于糖基化分析的几种方法是本领域已知的，并且可用于本发明的情形。此类方法提供了有关寡糖身份和组成的信息。可用于本发明的碳水化合物分析的方法包括但不限于凝集素色谱法；hpaec-pad，其使用高ph阴离子交换色谱法根据电荷分离寡糖；nmr；质谱；hplc；gpc；单糖成分分析；顺序酶消化。在一些实施方案中，如本文实施例中所述，使用标准蛋白质组学方案对糖蛋白提取物进行还原、烷基化和用测序级的修饰胰蛋白酶(promega)消化(ferreiraetal.，“synthesisandoptimizationoflectinfunctionalizednanoprobesfortheselectiverecoveryofglycoproteinsfromhumanbodyfluids，”analyticalchemistry83：7035-7043(2011)，其全部内容在此参考并入)。然后可以基于对jensen等人(kolarichetal.，“isomer-specificanalysisofreleasedn-glycansbylc-esims/mswithporousgraphitizedcarbon，”methodsinmolecularbiology1321：427-435(2015)，其全部内容在此参考并入)的修改来分析n-聚糖。简言之，n-连接的聚糖通过pngasef(elizabethkingiameningoseptica；sigma)释放，脱氨基化并如前所述(jensenetal.，“structuralanalysisofn-ando-glycansreleasedfromglycoproteins,”natureprotocols7：1299-1310(2012)，其全部内容在此参考并入)用多孔石墨化碳固相萃取柱(pgc-spe，hypersep-96-hypercarb，25mg，thermoscientific)部分纯化。可以通过malditof/tof质谱仪(4800plus，sciex)使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca；在50％acn中为10mg/ml)在反光镜负离子(reflectornegative)模式(质量范围m/z1000至5000)并进行外部校准(tof/tof校准混合物，sciex)下进行糖基分析和表征。可以使用nanohplc-高分辨率质谱(hrms)法，用在线偶联到配备有纳米电喷雾离子源(thermoscientific，easy-spray源)的ltq-orbitrapxl质谱仪(thermoscientific)的nanohplc系统(dionex，3000ultimaterslcnano)来验证maldi-ms谱中大多数判别性(discriminative)离子的存在。可以根据对先前描述的程序(jensenetal.，“structuralanalysisofn-ando-glycansreleasedfromglycoproteins，”natureprotocols7：1299-1310(2012)，其全部内容在此参考并入)的调整来进行使用多孔石墨化碳(pgc)进行的n-聚糖色谱分离。纳流pgc色谱柱(hypercarb，150mm×75μmid，粒径3μm，thermoscientific)以及后跟的反相c18色谱柱(easy-sprayc18pepmap，150mmx75μmid，粒径3μm，thermoscientific)可以组合成系列。这样可以更好地分离碳水化合物和剩余的胰蛋白酶肽，同时最大程度地减少了在pgc色谱柱后直接使用纳米喷雾发射器时遇到的盐沉淀事件。质谱仪以负离子模式运行。然后考虑到低于10ppm的质量准确度，可以使用glycomod工具预测maldi-ms谱上的聚糖前体的单糖组成。对于唾液聚糖，考虑了与na+和k+进行中性交换的可能性。通过考虑：i)分子单同位素质量；(ii)cid-ms/ms从头测序；和(iii)pgc-lc相对保留时间，基于nanohplc-pgc-hrms分析对聚糖的结构进行分配。特别地，基于保留时间(α2，6＜α2，3)区分α2，3-连接的和α2，6-连接的唾液酸化n-聚糖(kolarichetal.，“isomer-specificanalysisofreleasedn-glycansbylc-esims/mswithporousgraphitizedcarbon，”methodsinmolecularbiology1321：427-435(2015)，其全部内容在此参考并入)。为了进一步验证，将ms/ms片段谱与在glycoworkbench上通过计算机计算得到的糖苷片段相匹配(ceronietal.，“glycoworkbench：atoolforthecomputer-assistedannotationofmassspectraofglycans,”journalofproteomeresearch7：1650-1659(2008)，其全部内容在此参考并入)。可以用对哺乳动物n-糖基化的一般理解来确定某些结构方面。将单同位素峰强度考虑在内，可以使用半定量方法来比较基于maldi-ms分配的聚糖成分。在其他实施方案中，随后使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体与一种或多种适于检测所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的一种或多种脂质的相对于没有患癌症的受试者的标准或相对于来自患有癌症的受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在的试剂接触。术语“脂质组学”是指用于评估生物样品中脂质代谢物的代谢组学的应用。脂质谱分析通常涉及一种或多种脂质类别(例如，脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、胆固醇酯，以及磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和心磷脂)中的脂质代谢物的评估。如本文所用，术语“脂质”是广义的，并且涵盖范围广泛的生物学来源的相对不溶于水或非极性化合物的分子，包括蜡、甘油三酯、游离脂肪酸、二酰基甘油、脂肪酸衍生的磷脂、鞘脂、糖脂和类萜，例如类维生素a、胆固醇、胆固醇酯和类固醇。一些脂质是线性脂族分子，而另一些具有环结构。有些是芳香的，而有些则不是。脂质谱可以是定量的、半定量的和/或定性的。举例来说，脂质谱可以评估脂质的存在或不存在，可以评估特定阈值以上或以下的脂质的存在，和/或可以评估脂质的相对或绝对量。在一些实施方案中，确定两种、三种、四种或更多种脂质之间的比例。脂质比率的变化或扰动可有利于指示哪里有与疾病、对治疗的应答、副作用的发生等有关的代谢障碍(或此类障碍的消除)或代谢通路中的其他变化。评估脂质前体和产物的比例以评估酶活性和通过代谢通路的流动的方法是本领域已知的(参见，例如，attieetal.，(2002)j.lipidres.43：1899-1907andpanetal.，(1995)j.clin.invest.96：2802-2808，其全部内容在此参考并入)。脂质代谢物的比率可用于反映或评估脂质代谢的变化。通常，如果是从不存在于同一脂质类别中的代谢物计算比率，则使用定量数据来计算比率。如果分子和分母中所反映的脂质代谢物属于同一脂质类别，则可以使用关系(relational)数据。在一些实施方案中，将脂质代谢物的水平对另一种脂质代谢物进行基准化。举例来说，两种或多种脂质代谢物之间的比率可以针对与通路、酶活性、代谢物类别和/或某些代谢活性状态相关的指标进行基准化。可替代地，脂质代谢物的水平可以针对管家脂质代谢物(例如在受试者的各种条件下在量上相对稳定的脂质代谢物)进行基准化。定量代谢组学数据包括单个脂质代谢物或代谢物子集的摩尔定量数据、质量定量数据和按摩尔或质量的关系数据(分别为摩尔％或重量％)。在一些实施方案中，可以通过在分析过程中包括一种或多种定量内标，例如用于每种脂质类别的一种标准物，来提供和/或改善脂质分析的定量方面。在美国专利公开号2004/01434612中更详细地描述了内标，该专利的全部内容在此参考并入。可以将来自多个源(例如，数据不需要使用相同的测定、在相同的地点和/或在相同的时间生成)的真实定量数据集成到单个无缝数据库中，而无需考虑各离散的单个分析中测量的代谢物数量。如本文所用，术语“水平”是广义的，并且可以表示定量的量(例如重量或摩尔)、半定量的量、相对的量(例如，类别内的重量％或摩尔％或比率)、浓度等。出于预后或管理癌症的治疗的目的，选择已经或正在接受癌症治疗的受试者。根据该实施方案，从样品中回收外泌颗粒，并且所述方法通过检测选自下组中的一种或多种脂质来进行：磷脂、鞘脂和甘油脂。示例性的特定脂质包括，但不限于，tg、cer、lpg、lpe、pc、pi、pe、lpi、ps、sm、mg、lpc、pg、dg、cerg3和cerg1。在另一个实施方案中，从样品中回收小外泌体，并且所述方法通过检测选自下组中的脂质来进行：lpe、pc、pi、pe、lpi、ps、pc、sm和cerg3。在进一步的实施方案中，从样品中回收大外泌体，并且所述方法通过检测选自下组的脂质来进行：lpe、pc、pi、pe、lpi、ps、pc、sm和cerg3。外泌颗粒、小外泌体、或大外泌体样品的脂质谱可以使用任何合适的方法确定。不同种类的脂质及其检测和任选的定量的方法是本领域众所周知的(例如，薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、质谱和nmr光谱法及其任意组合(例如gc/ms)等)。一种检测生物样品中脂质和任选地定量生物样品中脂质的适当方法使用稳定的同位素示踪剂标记脂质。已经描述了从生物样品获得脂质谱的方法，参见例如授予watkins的美国专利公开号2004/0143461和watkinsetal.(2002)j.lipidres.43(11)：1809-17，该专利和文献的全部内容通过引用并入本文。在本发明的其他方面，随后使所述外泌颗粒、小外泌体或大外泌体与一种或多种适于检测外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中核酸分子中与癌症相关的一种或多种遗传突变相对于没有患癌症的受试者的标准或相对于来自患有癌症的受试者的先前样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在的试剂接触。出于预后或管理癌症的治疗的目的，选择已经或正在接受癌症治疗的受试者。根据这个方面，核酸分子可以是dna或rna。可以用dnase预处理来自受试者体液的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体馏分，以消除或基本上消除位于外泌体表面或外部的任何dna。如果不进行dna酶预处理，则外泌体外部的短dna片段可能会残留并与从外泌体内部提取的核酸共分离。因此，通过用dna酶预处理消除所有或基本上所有与外泌体的外部或表面相关的dna，具有富集外泌颗粒、小外泌体或大外泌体内部dsdna的能力。为了区分外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中的dna链度，shrimpdna酶特异性消化双链dna且s1核酸酶特异性消化单链dna。根据本发明的这个和所有其他方面，可以通过在分析之前或分析时从外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中提取dna来分离dna。提取的dna可以直接进行分析而无需扩增步骤。可以使用包括但不限于纳米串(nanostring)技术的不同方法来执行直接分析。纳米串技术通过将以颜色编码的荧光报告分子附着到各个靶分子上，从而能够鉴定和定量生物样品中的单个靶分子。这种方法类似于通过扫描条形码来测量库存的概念。可以使用成百甚至上千种不同的编码制作报告分子，以进行高度多重分析。该技术在geiss等人的出版物“directmultiplexedmeasurementofgeneexpressionwithcolor-codedprobepairs,”natbiotechnol26(3)：317-25(2008)中有描述，该文献的全部内容在此参考并入。在另一个实施方案中，在分析外泌颗粒、小外泌体或大外泌体的核酸之前扩增所述核酸可能是有益的或是期望的。核酸扩增的方法是本领域中普遍使用和普遍已知的。如果需要，可以进行扩增以使其定量。定量扩增将允许定量地确定各种外泌体核酸的相对量。核酸扩增方法包括，但不限于，聚合酶链式反应(pcr)(美国专利号5,219,727，其全部内容在此参考并入)及其变体如原位聚合酶链式反应(美国专利号5,538,871，其全部内容在此参考并入)，定量聚合酶链式反应(美国专利号5,219,727，其全部内容在此参考并入)，巢式聚合酶链式反应(美国专利号5,556,773，其全部内容在此参考并入)，自我持续序列复制及其变体(guatellietal.“isothermal，invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication,”procnatlacadsciusa87(5)：1874-8(1990)，其全部内容在此参考并入)，转录扩增系统及其变体(kwohetal.“transcription-basedamplificationsystemanddetectionofamplifiedhumanimmunodeficiencyvirustype1withabead-basedsandwichhybridizationformat，”procnatlacadsciusa86(4)：1173-7(1989)，其全部内容在此参考并入)，qb复制酶和其变体(mieleetal.“autocatalyticreplicationofarecombinantrna.”jmolbiol171(3)：281-95(1983)，其全部内容在此参考并入)，冷pcr(lietal.“replacingpcrwithcold-pcrenrichesvariantdnasequencesandredefinesthesensitivityofgenetictesting.”natmed14(5)：579-84(2008)，其全部内容在此参考并入)，或本领域技术人员已知的任何其他核酸扩增和检测方法。如果核酸分子的数量非常少，则设计用于检测此类分子的检测方案尤其有用。在一个实施方案中，使分离的dna与一种或多种适合于检测与癌症相关的一种或多种遗传突变的存在或不存在的试剂接触。与癌症相关的示例性遗传突变包括但不限于braf、egfr、apc、notch1、hras、kras、nras、met、p53、pten、her2、flt3、brca1、brca2、pik3ca、kit、ret、akt、abl、cdk4、myc、raf、pdgfr、bcr-abl、npm1、cebpalpha和src。可以使用杂交测定法检测一种或多种被鉴定的基因中的一种或多种突变。在杂交测定中，基于一种或多种等位基因特异性寡核苷酸探针与来自受试者的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dna样品中的一种或多种核酸分子的杂交来确定遗传突变的存在或不存在。寡核苷酸探针或探针包含与至少含有目标突变的基因区域互补的核苷酸序列。寡核苷酸探针被设计为与一个或多个基因的野生型、非突变核苷酸序列和/或突变体核苷酸序列互补，以实现在使来自受试者的样品与寡核苷酸探针接触时检测样品中突变的存在或不存在。本领域已知的多种杂交测定法适用于本发明的方法。这些方法包括，但不限于，直接杂交测定法，例如northern印迹或southern印迹(参见，例如，ausabeletal.，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，ny(1991)，其全部内容在此参考并入)。或者，可以使用基于阵列的方法进行直接杂交，在基于阵列的方法中将被设计为与特定非突变或突变基因区域互补的一系列寡核苷酸探针固定在固体支持物(玻璃、硅、尼龙膜)上。使来自受试者的标记的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体dna或cdna样品与包含寡核苷酸探针的阵列接触，并检测来自样品的核酸分子与其在阵列表面上的互补寡核苷酸探针的杂交。直接杂交阵列平台的例子包括，但不限于，affymetrixgenechip或snp阵列以及illumina的beadarray。或者，将样品结合至固相支持物(通常为dna或pcr扩增的dna)，并在溶液中用寡核苷酸标记(等位基因特异性的或较短的，以便通过杂交进行测序)。其他常见的基因分型方法包括，但不限于，限制性片段长度多态性测定；基于扩增的测定，例如分子信标测定，核酸阵列，高分辨率熔解曲线分析(reedandwittwer，“sensitivityandspecificityofsingle-nucleotidepolymorphismscanningbyhighresolutionmeltinganalysis,”clinicalchem50(10)：1748-54(2004)，其全部内容在此参考并入)；等位基因特异性pcr(gaudetetal.，“allele-specificpcrinsnpgenotyping,”methodsmolbiol578：415-24(2009)，其全部内容在此参考并入)；引物延伸测定，例如等位基因特异性引物延伸(例如，测定)，阵列引物延伸(参见krjutskovetal.，“developmentofasingletube640-plexgenotypingmethodfordetectionofnucleicacidvariationsonmicroarrays,”nucleicacidsres.36(12)e75(2008)，其全部内容在此参考并入)，均相引物延伸测定，通过质谱检测的引物延伸(例如，iplexsnp基因分型测定)(参见zhengetal.，“cumulativeassociationoffivegeneticvariantswithprostatecancer,”n.eng.j.med.358(9)：910-919(2008)，其全部内容在此参考并入)，在遗传阵列上分类的多重引物延伸；皮瓣(flap)核酸内切酶测定(例如测定)(参见olivierm.，“theinvaderassayforsnpgenotyping，”mutat.res.573(1-2)103-10(2005)，其全部内容在此参考并入)；5’核酸酶测定法，例如测定(参见授予gelfand等人的美国专利号5,210,015和授予livak等人的美国专利号5,538,848，这些专利的全部内容在此参考并入)；以及寡核苷酸连接测定，例如滚环扩增连接，均相连接，ola(参见授予landgren等人的美国专利号4,988,617，其全部内容在此参考并入)，多重连接反应后进行pcr，其中zipcode被整合到连接反应探针中，并且扩增的pcr产物通过电泳或通用zipcode阵列读数来确定(参见授予barany等人的美国专利号7,429,453和7,312,039，这些专利的全部内容在此参考并入)。这样的方法可以与检测机制结合使用，检测机制如，例如发光或化学发光检测、荧光检测、时间分辨荧光检测、荧光共振能量转移、荧光偏振、质谱和电学检测。通常，用于分析遗传畸变的方法在许多出版物中有报道，其不限于本文引用的出版物，并且对于本领域技术人员而言是可用的。适当的分析方法将取决于分析的特定目标，患者的病情/病史，以及要检测、监测或治疗的特定癌症、疾病或其他医学状况。或者，可以通过直接测序患者样品中的基因，或者优选地，包含一种或多种已鉴定的突变的特定基因区域，来检测上文所鉴定的一种或多种突变的存在或不存在。直接测序测定法通常包括使用本领域已知的任何合适的方法从受试者中分离dna样品，并将待测序的目标区域克隆进合适的载体中，以通过在宿主细胞(例如细菌)中生长进行扩增或通过pcr或其他扩增试验直接扩增。扩增后，可以使用任何合适的方法对dna进行测序。一种优选的测序方法涉及高通量下一代测序(ngs)以鉴定遗传变异。有多种ngs测序化学方法可供使用并适用于执行要求保护的发明，包括焦磷酸测序(454)，通过可逆染料终止子进行测序(hiseq，genomeanalyzer和miseq系统)，通过顺序连接寡核苷酸探针进行测序(solid)和氢离子半导体测序(lifeiontorrenttm)。或者，可以使用本领域技术人员众所周知的经典测序方法，例如sanger链终止方法或maxam-gilbert测序来开展本发明所述方法。在本发明的某些实施方案中，所选择的受试者患有黑素瘤、乳腺癌或胰腺癌。本文所述的方法可进一步包括选择合适的癌症治疗剂和将所选的癌症治疗剂施用给受试者。在实施本发明的方法时，进行施用步骤以治疗癌症，实现对转移或转移性疾病进展的抑制。这样的施用可以全身地或通过直接或局部施用到肿瘤部位来进行。举例来说，合适的全身性给药方式包括，但不限于，口服给药、局部给药、透皮给药、肠胃外给药、皮内给药、肌内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下或鼻内滴注给药、通过腔内或膀胱内滴注给药、眼内给药、口腔内给药、病变内给药、或通过粘膜给药。合适的局部施用方式包括，但不限于，导管插入、植入、直接注射、皮肤/透皮施用或对相关组织的门静脉施用，或通过本领域通常已知的任何其他局部施用技术、方法或程序。影响药剂递送的方式将根据治疗剂(例如抗体或抑制性核酸分子)的类型和要治疗的疾病而变化。用于治疗转移性疾病的有效剂量取决于许多不同的因素，包括癌症的类型和阶段，施用方式，靶标部位，患者的生理状态，施用的其他药物或疗法，以及患者相对于其他医学并发症的身体状态。需要以滴定法调整(titrate)治疗剂量以优化安全性和功效。本发明的另一方面涉及一种适用于诊断癌症的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种适合检测以下内容的试剂：(1)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(2)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(3)外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种脂质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在，(4)与癌症相关的且外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的核酸分子中的一种或多种遗传突变的存在或不存在，或(5)其组合，其中所述外泌颗粒的直径小于50nm，小外泌体的直径为60至80nm，且所述大外泌体的直径为90至120nm。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种适于分离外泌颗粒、小外泌体或大外泌体的试剂。举例来说，适用于分离外泌颗粒的标志物包括，但不限于，hsp90ab1、mthfd1、actr3、pepd、idh1、hmgcs1、lgals3bp、calr、hspa13、ugp2、mat1a、gpd1、pfkl、hgd、gclc、gsn、cndp2、fat4、erp44、bzw1、agl、b4gat1、ext1、cat、xpnpep1、coro1c、rack1、hpd、ext2、acly、adk、psmc4、aco1、rrm1、serpinh1、pygl、aldh1l1、pgm1、eef1g和ppp2r1a。适用于分离小外泌体的标志物包括但不限于flot1、flot2、ttyh3、tspan14和vps37b。适用于分离大外泌体的标志物包括但不限于stip1、mpp6、dlg1、abi1、atp2b1、anxa4、myo1c、stxbp3、rdx、anxa1、anxa5、gna13、pacsin3、vps4b、chmp1a、chmp5、chmp2a、sh3gl1、chmp4b、gng12和dnaja1。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种试剂，所述一种或多种试剂适合于检测所述外泌颗粒中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在。上文描述了外泌颗粒中包含的示例性蛋白质。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种试剂，所述一种或多种试剂适合于检测所述小外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在。上文描述了小外泌体中包含的示例性蛋白质。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种试剂，所述一种或多种试剂适合于检测所述大外泌体中所含的一种或多种蛋白质相对于标准或者来自受试者的样品的更高或更低的水平，或者存在或不存在。上文描述了大外泌体中包含的示例性蛋白质。本发明所述的试剂盒还可包含适合于确定受试者是否患有特定类型的癌症的试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒包含适合于确定受试者是否患有黑素瘤、乳腺癌和/或胰腺癌的试剂。适合在黑色素瘤、乳腺癌或胰腺癌受试者的外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中检测的示例性蛋白质如上文所述。考虑许多试剂盒涵盖多种方法。这些试剂盒任选地包含用于处理该特定试剂盒所采用的技术的组织或细胞样品的试剂。例如，用于pcr或pcr增强原位杂交的试剂盒可包含用于处理样品和分离rna(用于pcr)的试剂。它还应包含适当的引物以扩增靶序列和其他探针(如若需要)以检测所需的核酸片段以及用于聚合酶链式反应的缓冲液和试剂和用于原位杂交方法所需的缓冲液和乳剂。或者，其他试剂盒可包含用于使用抗体或探针进行免疫荧光或elisa的试剂、引物和用于原位或pcr原位杂交方法修饰的试剂。就本发明所述试剂盒的目的而言，从外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中分离核酸可能是所需的。因此，试剂盒可能包含执行此类方法所需的试剂。从生物学样品中分离用于本发明方法的rna和dna的方法在本领域中是众所周知的。这些方法在laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology：hybridizationwithnucleicacidprobes，parti.theoryandnucleicacidpreparation(p.tijssen编辑，elsevier1993)中有详细描述，该文献的全部内容在此参考并入。总rna可以使用例如酸性胍-苯酚-氯仿提取、异硫氰酸胍-超速离心法或氯化锂-sds-脲法从给定样品中分离出来。可以使用寡(dt)柱色谱法或(dt)n磁珠分离出polya+mrna(参见例如sambrookandrussell，molecularcloning：alaboratorymanual(coldspringslaboratorypress，1989)或currentprotocolsinmolecularbiology(fredm.ausubeletal.eds.，1992)，这些文献的全部内容通过引用并入本文)。关于复杂性(complexity)处理和其他核酸样品制备技术，还请参见dong等人的wo/2000024939，其全部内容在此参考并入。可能需要在检测蛋白质水平之前扩增核酸样品。本领域技术人员应当理解，应使用能维持或控制扩增的核酸的相对概率(frequency)以实现定量扩增的方法。通常，用于扩增核酸的方法采用聚合酶链式反应(pcr)(参见，例如，pcrtechnology：principlesandapplicationsfordnaamplification(henryerliched.，freemanpress1992)；pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(michaelinnised.，academicpress1990)；mattilaetal.，“fidelityofdnasynthesisbythethermococcuslitoralisdnapolymerase-anextremelyheatstableenzymewithproofreadingactivity，”nucleicacidsres.19：4967-73(1991)；eckertetal.，“dnapolymerasefidelityandthepolymerasechainreaction,”pcrmethodsandapplications1：17-24(1991)；以及都是授予mullis等人的美国专利号4,683,202，4,683,195，4,800,159，4,965,188，and5,333,675，这些文献和专利出于所有目的在此参考并入)。样品也可以如授予boles的美国专利号6,300,070中所述在阵列上扩增，该专利的全部内容在此参考并入。其他合适的扩增方法包括连接酶链式反应(lcr)(例如，wuetal.，“theligationamplificationreaction(lar)-amplificationofspecificdnasequencesusingsequentialroundsoftemplate-dependentligation，”genomics4：560-9(1989)，landegrenetal..“aligase-mediatedgenedetectiontechnique,”science241：1077-80(1988)，andbarringeretal.，“blunt-endandsingle-strandligationsbyescherichiacoliligase：influenceonaninvitroamplificationscheme,”gene89：117-22(1990)，这些文献的全部内容在此参考并入)；转录扩增(kwohetal.，“transcription-basedamplificationsystemanddetectionofamplifiedhumanimmunodeficiencyvirustypeiwithabead-basedsandwichhybridizationformat，”proc.natl.acad.sci.usa86：1173-7(1989)，以及授予gingeras的wo88/10315，这些文献和专利的全部内容在此参考并入)；自我维持的序列复制(guatellietal.，“isothermal，invitroamplificationofnucleicacidsbyamultienzymereactionmodeledafterretroviralreplication，”proc.natl.acad.sci.usa87：1874-8(1990)和授予gingeras的wo90/06995，这些文献和专利的全部内容在此参考并入)；选择性扩增靶多核苷酸序列(授予burg等人的美国专利号6,410,276，其全部内容在此参考并入)；共有序列引发(primed)的聚合酶链式反应(cp-pcr)(授予mcclelland的美国专利号5,437,975，其全部内容在此参考并入)；任意引发的聚合酶链式反应(ap-pcr)(授予bassam的美国专利号5,413,909和授予mcclelland的美国专利号5,861,245，这些专利的全部内容在此参考并入)；和基于核酸的序列扩增(nabsa)(参见全部为授予davey的美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603，这些专利的全部内容在此参考并入)。其他可以使用的扩增方法在授予whiteley的美国专利号5,242,794；授予barany的美国专利号5,494,810；和授予landgren的美国专利号4,988,617中有所描述，这些专利的全部内容在此参考并入。试剂盒还可包含与外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中的互补性核酸分子杂交的探针或引物。探针包含与所需蛋白质的mrna或相应cdna的至少一个区域互补的核苷酸序列。如本文所用，术语“杂交”是指一个核酸与另一核酸的互补碱基配对相互作用，其导致双链体、三链体或其他更高阶结构的形成。通常，主要相互作用是碱基特异性的，例如通过watson/crick和hoogsteen型氢键结合的a/t和g/c。碱基堆积和疏水性相互作用也有助于双链体的稳定性。使检测探针与互补的和基本互补的靶序列杂交的条件是本领域众所周知的(参见，例如，nucleicacidhybridization，apracticalapproach，b.hamesands.higgins，eds.，irlpress，washington，d.c.(1985)，其全部内容在此参考并入)。通常，杂交受以下及其他因素影响：多核苷酸及其互补物的长度，ph，温度，一价和二价阳离子的存在，杂交区域中g和c核苷酸的比例，媒介(medium)的粘度和变性剂的存在。这样的变量影响杂交所需的时间。因此，优选的杂交条件将取决于特定的应用。然而，这种条件可以由本领域普通技术人员常规地确定，而无需过多的实验。应当理解，互补性并不一定是完美的；可能存在少量碱基对错配，这些错配对靶序列与单链核酸探针之间的杂交的干扰是微乎其微的。因此，本文的互补性是指探针与靶序列充分互补以在选择的反应条件下杂交以实现选择性检测和测量。检测探针与来自外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品的相应靶分子之间的杂交可以通过本领域已知的允许检测一种或多种蛋白质的表达水平的几种测定来进行。如本文所述，蛋白质的“表达水平”可以通过测量代表基因表达水平的任何合适的值来实现。基因表达水平的测量可以是直接的或间接的。直接测量涉及测量rna或蛋白质的水平或数量。间接测量可以涉及测量cdna、扩增的rna、dna或蛋白质的水平或数量；rna或蛋白质的活性水平；或其他指示上述含义的分子(例如代谢物)的水平或活性。表达的测量可以是基因产物的绝对量的测量。测量也可以是代表绝对量的值，基准化值(例如，相对于参考基因产物的量进行基准化的基因产物的量)，平均值(例如，在不同时间点获得的或来自受试者的不同样本的平均量，或使用不同探针等获得的平均量)，或其组合。在一个优选的实施方案中，通过测量rna表达水平来检测杂交。通过定量rna表达来测量基因表达可以通过使用本领域已知的任何常用方法来实现，包括northern印迹和原位杂交(parkeretal.，“mrna：detectionbyinsituandnorthernhybridization,”methodsinmolecularbiology106：247-283(1999)，其全部内容在此参考并入)；rna酶保护测定法(hodetal.，“asimplifiedribonucleaseprotectionassay，”biotechniques13：852-854(1992)，其全部内容在此参考并入)；逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)(weisetal.，“detectionofraremrnasviaquantitativert-pcr，”trendsingenetics8：263-264(1992)，其全部内容在此参考并入)；和基因表达系列分析(sage)(velculescuetal.，“serialanalysisofgeneexpression，”science270：484-487(1995)；andvelculescuetal.，“characterizationoftheyeasttranscriptome，”cell88：243-51(1997)，其全部内容在此参考并入)。在核酸杂交测定中，可以使用基于阵列的技术来检测对应于蛋白质的核酸的表达水平。这些阵列，通常也称为“微阵列”或“芯片”，已在本领域中进行了一般性描述，参见例如授予pirrung等人的美国专利号5,143,854；授予fodor等人的美国专利号5,445,934；授予fodor等人的美国专利号5,744,305；授予winkler等人的美国专利号5,677,195；授予winkler等人的美国专利号6,040,193；授予fodor等人的美国专利号5,424,186，这些专利的全部内容通过引用整体并入本文。微阵列包含固定在基底上确定位置处的不同多核苷酸或寡核苷酸探针的组装。阵列在由诸如纸、玻璃、塑料(例如，聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝化纤维素、硅、光纤或任何其他合适的固体或半固体承载物制成的基底上形成，并被配置成平面(例如，玻璃板、硅片)或三维(例如，针、纤维、珠、颗粒、微量滴定孔、毛细管)构型。形成阵列的探针可以通过多种方式附着到基底上，包括(i)使用光刻技术的原位合成(例如，高密度寡核苷酸阵列)(参见fodoretal.，“light-directed，spatiallyaddressableparallelchemicalsynthesis，”science251：767-773(1991)；peaseetal.，“light-generatedoligonucleotidearraysforrapiddnasequenceanalysis，”proc.natl.acad.sci.u.s.a.91：5022-5026(1994)；lockhartetal.，“expressionmonitoringbyhybridizationtohigh-densityoligonucleotidearrays,”naturebiotechnology14：1675(1996)；和授予trulson的美国专利号5,578,832；授予lockhart的美国专利号5,556,752；和授予fodor的美国专利号5,510,270，这些文献和专利的全部内容通过引用整体并入本文)；(ii)在玻璃、尼龙或硝化纤维素上以中低密度点样/打印(例如cdna探针)(schenaetal.，“quantitativemonitoringofgeneexpressionpatternswithacomplementarydnamicroarray，”science270：467-470(1995)，derisietal，“useofacdnamicroarraytoanalysegeneexpressionpatternsinhumancancer,”naturegenetics14：457-460(1996)；shalonetal.，“adnamicroarraysystemforanalyzingcomplexdnasamplesusingtwo-colorfluorescentprobehybridization，”genomeres.6：639-645(1996)；和schenaetal.，“proc.natl.acad.sci.u.s.a.93：10539-11286)(1995)，这些文献的全部内容通过引用整体并入本文)；(iii)masking(maskosetal.，“oligonucleotidehybridizationsonglasssupports：anovellinkerforoligonucleotidesynthesisandhybridizationpropertiesofoligonucleotidessynthesisedinsitu,”nuc.acids.res.20：1679-1684(1992)，其全部内容在此参考并入)；(iv)在尼龙或硝酸纤维素杂交膜上进行点印迹(参见例如，sambrookandrussell，molecularcloning：alaboratorymanual(coldspringslaboratorypress，1989)，其全部内容在此参考并入)。探针也可通过与锚定物杂交，通过磁珠的方式非共价地固定在基底上，或在液相中例如在微量滴定孔或毛细管中。探针分子通常是核酸，例如dna、rna、pna和cdna。可以通过从外泌颗粒、小外泌体或大外泌体样品中提取的rna进行反转录以掺入荧光核苷酸来产生用于与阵列杂交的荧光标记的cdna。应用于阵列的标记cdna与点样在阵列上的各种核酸探针特异性杂交。严格洗涤以除去非特异性结合的cdna后，通过共聚焦激光显微镜或通过其他检测方法如ccd相机来扫描阵列。定量分析各阵列元件的杂交可以评估相应的mrna丰度。在使用双色荧光的条件下，将从两种rna来源产生的分别标记的cdna样品成对杂交至阵列。因此，同时确定来自两种来源的对应于各个指定基因的转录本的相对丰度。杂交的微型化规模为大量基因的表达模式提供了方便和快速的评估。此类方法已显示具有检测稀有转录本(每个细胞表达几个拷贝)和可重现地检测至少约两倍的表达水平差异所需的灵敏度(schenaetal.，“parallelhumangenomeanalysis：microarray-basedexpressionmonitoringof1000genes，”“proc.natl.acad.sci.usa93(20)：10614-9(1996)，其全部内容在此参考并入)。还可以进行作为半定量或定量实时聚合酶链式反应(rt-pcr)测定的核酸扩增测定。由于rna不能用作pcr的模板，因此通过rt-pcr进行基因表达谱分析的第一步是将rna模板逆转录成cdna，然后在pcr反应中进行指数扩增。两种最常用的逆转录酶为禽成纤维细胞病病毒逆转录酶(amv-rt)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(mlv-rt)，当然也有其他已知的也适用于此目的的逆转录酶。根据具体情况和表达谱分析的目标，通常使用特异性引物、随机六聚体或寡-dt引物引发逆转录步骤。举例来说，提取的rna可以按照生产商的说明使用geneamprnapcr试剂盒(perkinelmer，calif.，usa)进行逆转录。然后可以将衍生的cdna用作后续pcr反应的模板。虽然pcr步骤可以使用多种热稳定的dna依赖性dna聚合酶，但是其通常采用具有5′-3′核酸酶活性但缺乏3′-5′校对核酸内切酶活性的taqdna聚合酶。使用taq聚合酶的一个示例性pcr扩增系统是pcr(appliedbiosystems，fostercity，ca)。pcr通常利用taq或tth聚合酶的5′核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可以使用具有等效的5′核酸酶活性的任何酶。使用两个寡核苷酸引物产生典型的pcr反应的扩增子。设计第三寡核苷酸或探针以检测位于两个pcr引物之间的核苷酸序列。该探针不可通过taqdna聚合酶延伸，并被报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当两种染料在探针上的位置靠近时，任何激光诱导的报告染料的发射均被淬灭染料淬灭。在扩增反应过程中，taqdna聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得的探针片段在溶液中解离，并且来自被释放的报告染料的信号不受第二荧光团的猝灭作用。各个新合成的分子会释放出一个报告分子染料，检测未淬灭的报告染料为数据的定量解释提供了基础。可以使用可商购的设备，例如，abiprism序列检测系统(perkin-elmer-appliedbiosystems，fostercity，calif.，usa)，或lightcycler(rochemolecularbiochemicals，mannheim，germany)来执行rt-pcr。除了引物/探针系统之外，本领域已知的用于实时pcr检测的其他定量方法和试剂(例如sybrgreen，molecularbeacons，scorpionprobes等)也适用于本发明所述的方法。为了最小化误差和样品间差异的影响，通常使用内标或加标(spike)对照进行rt-pcr。理想的内标在不同组织之间以恒定水平表达。最常用于基准化基因表达式样的rna为管家基因甘油-3-磷酸脱氢酶(gapdh)和β-肌动蛋白的mrna。实时pcr与定量竞争pcr和定量比较pcr兼容，在定量竞争pcr中，对各靶序列的内部竞争者用于基准化，而定量比较pcr则使用样品中包含的基准化基因或管家基因用于rt-pcr。有关更多细节，请参见例如heidetal.，“realtimequantitativepcr，”genomeresearch6：986-994(1996)，其全部内容在此参考并入。当期望通过测量蛋白质表达水平来测量蛋白质的表达水平时，试剂盒可包含适合于进行本领域已知的任何基于蛋白质杂交或基于免疫检测的测定的试剂。在基于蛋白质杂交的测定中，选择性结合蛋白质的抗体或其他试剂可用于检测样品中该蛋白质的表达的量。举例来说，蛋白质的表达水平可以通过包括，但不限于以下的方法测量：蛋白质印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(elisa)，放射免疫测定(ria)，荧光激活细胞分选(facs)，免疫组织化学，免疫细胞化学或其任意组合。同样，可以将特异性结合蛋白质的抗体、适体或其他配体固定在所谓的“蛋白质芯片”(蛋白质微阵列)上，并用于测量样品中蛋白质的表达水平。或者，评估蛋白质表达水平可涉及通过以下来分析一种或多种蛋白质：二维凝胶电泳，质谱(ms)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间ms(maldi-tof)、表面增强的激光解吸电离飞行时间(seldi-tof)、高效液相色谱(hplc)、快速蛋白液相色谱(fplc)、多维液相色谱(lc)然后进行串联质谱(ms/ms)、蛋白芯片表达分析、基因芯片表达分析和激光光密度法或这些技术的任意组合。在某些实施方案中，试剂盒可包含特异性结合目标蛋白质的抗体。任选地，在使抗体与样品接触之前，可以将抗体固定在固体支持物上，以利于洗涤和随后的复合物分离。固体支持物的实例包括呈微量滴定板、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。本文涵盖的固体支持物的实例包括部分或全部由玻璃(例如，受控孔玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮和塑料如聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇形成的固体支持物。在使样品与抗体接触之前，可以用合适的稀释剂或洗脱液稀释样品。将样品与抗体一起孵育后，可以洗涤混合物并且可以检测形成的抗体-抗原复合物。这可以通过将洗涤后的混合物与检测试剂一起孵育来实现。该检测试剂可以是例如用可检测的标签标记的第二抗体。示例性的可检测标签包括磁珠(例如dynabeadstm)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和elisa中常用的其他酶)以及比色标记如胶体金或有色玻璃珠或塑料珠。或者，可以使用间接测定法和/或在竞争或抑制测定法中检测样品中的抗原，在间接测定法中，例如，使用第二标记抗体检测结合的特异性一抗，在竞争或抑制测定法中，例如，将与抗原(即与外泌颗粒、小外泌体或大外泌体独特相关的蛋白质)的独特表位结合的单克隆抗体同时与混合物孵育。免疫测定法可用于确定外泌颗粒、小外泌体和/或大外泌体样品中蛋白质的存在或不存在以及样品中蛋白质的量。如果样品中存在蛋白质，则它将与抗体形成抗体-蛋白质复合物，该抗体在上述适当的孵育条件下特异性结合该蛋白质。抗体-蛋白质复合物的量可以通过与标准比较来确定。例如，标准可以是已知化合物或样品中已知存在的其他蛋白质。如上所述，抗原(即与外泌颗粒、小外泌体或大外泌体独特相关的蛋白质)的测试量无需以绝对单位进行测量，只要测量单位可以与对照进行比较即可。在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种适于检测外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中的一种或多种脂质的更高或更低的水平，或者存在或不存在的试剂。待检测的示例性脂质描述于上文中。出于检测脂质的存在或不存在的目的，试剂盒包含适合于检测脂质的试剂和参照化合物。参考化合物可以是以下，但不限于以下的一种或多种：脂质标准物，在临床环境中常规测量的一种或多种对照标志物，以及阳性和/或阴性对照，内部和/或外部标准物。在一个实施方案中，通过使用质谱法测定来自受试者的样品中的脂质浓度，脂质比率或其脂质组合。在质谱分析之前，可以对样品进行纯化和/或其他样品预制备步骤。纯化步骤可以是，但不限于，色谱法，例如，高效液相色谱法(hplc)，超高效液相色谱法(uplc)和/或超高效液相色谱法(uhplc)。样品预制备步骤可以是，但不限于，固相萃取(spe)，衍生化，液-液萃取和/或脂蛋白分馏。所述质谱测定可以通过串联质谱进行。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种适于检测外泌颗粒、小外泌体或大外泌体中所含的一种或多种n-聚糖的更高或更低的水平，或者存在或不存在的试剂。待检测的示例性n-聚糖描述于上文中。在一些实施方案中，所述试剂盒除检测试剂和缓冲液外，还包含一种或多种针对特定聚糖结构的凝集素。在一些实施方案中，所述试剂盒除用于鉴定聚糖结构的试剂外，还包含用于鉴定糖基化蛋白质的试剂(例如，糖基化检测试剂)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含执行至少一种检测测定所必需的和/或足以执行至少一种检测测定的所有组分，包括所有对照，用于执行测定的指导以及用于分析和呈现结果的任何必要或需要的软件。在一些实施方案中，试剂(例如，凝集素)被荧光标记。实施例以下实施例旨在举例说明本发明的实施，但绝不旨在限制本发明的范围。实施例1-7的材料和方法细胞系和细胞培养。b16-f10、b16-f1、4t1、mda-mb-231系列(亲代，-1833，-4175和-831，受赠于j.massagué博士)、llc、sw620、hct116(horizondiscovery)、panc-1、aspc-1、pan02(购自美国国家癌症研究所肿瘤储存库)和nih3t3细胞在dmem中培养。人黑素瘤细胞(sk-mel103、a375m和a375p从mskcc获得)、人前列腺癌细胞系pc3和du145、以及bxpc-3、hpaf-ii、pc-9、et2b(受赠于p.gao和j.bromberg博士)、k-562(dsmz)和nb-4(dsmz)细胞在补充有青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)和10％fbs的rpmi中培养。如果没有另外说明，则细胞系从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)获得，并由商业提供者使用str谱进行确认。所有细胞保持在37℃含5％co2的潮湿培养箱中，并进行常规测试并确认不含支原体污染。在收集条件培养基进行外泌体分离时，首先通过以100,000xg超速离心fbs(gibco，thermofisherscientific)90分钟来去除外泌体。在收集上清液之前，将细胞培养3天。人体标本和处理。新鲜的人肿瘤组织获自纪念斯隆-凯特琳癌症中心(mskcc)患有1-3期黑色素瘤的受试者，并在组织学上证实为黑色素瘤。根据mskcc机构审查委员会批准的协议(irb#11-033a，mskcc；irb#0604008488，wcm)，所有个体均已提供了有关组织捐赠的知情同意书，并且该研究符合有关人参与者研究的所有相关道德规范。将组织切成小块，并在补充有青霉素/链霉素的无血清rpmi中培养24小时。如下所述对条件培养基进行外泌体分离和af4分馏。外泌颗粒和外泌体的分离和纳米视线跟踪分析(nta)。使用差异超速离心方法制备sev(peinadoetal.，“melanoma外泌体seducatebonemarrowprogenitorcellstowardapro-metastaticphenotypethroughmet,”naturemedicine18：883-891(2012)，其全部内容在此参考并入)，并将其重悬于磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)中，以进行后续分析和af4分馏。使用bca测定法(pierce，thermofisherscientific)对分离的样品进行定量。按照制造商的说明，使用配备有蓝色激光(405nm)的lm10或ds500nanosight系统(malverninstruments)对外泌体的大小和颗粒数进行nta分析。[af4分馏。在protocolexchange上提供了详细的分步af4分馏方案，包括样品制备、af4设置参数和运行方法、数据收集和分析、以及馏分的收集和表征(zhangetal.，“aprotocolforasymmetric-flowfield-flowfractionation(af4)ofsmallextracellularvesicles，”protocolexchange(2018)，其全部内容在此参考并入)。透射电子显微镜(tem)和原子力显微镜(afm)。对于负染tem分析，将5μl样品溶液置于formvar/碳涂层的栅格上，静置1分钟。将样品吸干，并用1.5％(水溶液)乙酸铀酰的连续4滴进行负染，在各滴之间吸干。在最后一滴染料之后，将栅格吸干并风干。用在100kv下操作的jeoljsm1400(jeol，usa，ltd，peabody，ma)透射电子显微镜对栅格成像。在veleta2kx2kccd相机(olympus-sis，munich，germany)上捕获图像。对于afm，对各样品进行稀释，然后将其在新鲜剥离(cleaved)的云母基底(spi)上铺板～2分钟，然后用10ml分子生物学级h2o(fisherbp2819-1)洗涤并用氮气吹干。使用mfp-3d-bioafm(asylumresearch)和olympusac240ts-r3afm探针(asylumresearch)在室温下以轻叩(tapping)模式进行成像。以1μmx1μm捕获图像。使用自定义的imagej/fiji(nih)代码执行图像分析。ζ电势测量。将分馏后的样品在pbs(磷酸盐缓冲液；0.01m磷酸盐缓冲液，0.0027mkcl，0.137mnacl；ph7.4片剂，sigma)中稀释，以使用zetasizernanozs90(malverninstruments)进行电势分析。样品是新鲜制备的，然后以90°角(相对于光源)装载到仪器上。所有实验均在25℃的恒定温度下进行。刚度测量。首先将新鲜剥离的云母盖玻片用聚-l-赖氨酸(0.1％.w/v的h2o溶液)包被30分钟，然后在云母表面与样品一起孵育45分钟。然后将样品用1mlmillipure水冲洗，用pbs缓冲液洗涤3次，然后以在一滴pbs中的形式呈现在云母表面。使用独立的mfp-3d原子力显微镜(asylumresearch，santabarbara，ca)进行分析。通过热噪声法确定悬臂的弹簧常数为559.73pn/nm(langloisetal.，“springconstantcalibrationofatomicforcemicroscopycantileverswithapiezosensortransferstandard，”thereviewofscientificinstruments78：093705(2007)，其全部内容在此参考并入)。悬臂的曲率半径为～15nm，并且使用325khz的共振频率进行刚度分析(即，悬臂的压痕)和成像。用约为300nm的力距离和500nm/s的速度进行力的测量。蛋白质印迹分析。将全细胞提取物(wce)和外泌体馏分直接用sds样品缓冲液裂解，并通过以14,000xg离心10分钟来清除裂解液。在novex4-12％bis-trisplus凝胶(lifetechnologies)上分离100μgwce和10μg输入物以及各纳米颗粒子集，然后转移到pvdf膜(millipore)上。将膜在室温下封闭1小时，然后将一抗在4℃下孵育过夜。以下抗体用于蛋白质印迹分析：抗-tsg101(santacruzsc-7964)；抗-alixl(cellsignaling2171)；抗-hsp90(stressgenadi-spa-830-f)，抗-mat1a1(abcamab174687)；抗-idh1(proteintech23309-1-ap)；抗-flotl(bdbiosciences610820)；抗-tollip(abcamab187198)；抗-vps4b(santacruzsc-32922)；抗-dnaja1(abcamab126774)；抗-hspa8/hsc70(lifespanbiosciencesls-c312344-100)。所有一抗均以1∶1,000x稀释度使用。irdye800cw山羊抗小鼠igg(li-corbiosciencesp/n926-32210，1∶15,000x稀释度)，hrp连接的绵羊抗小鼠igg(gehealthcarelifesciencesna931，1∶2,500x稀释度)，和hrp连接的驴抗兔igg(gehealthcarelifesciencesna934，1∶2,500x稀释度)用作二抗。使用odyssey成像系统(li-corbiosciences)或增强的化学发光底物(thermofisherscientific)分析印迹。蛋白质组概况分析数据的分析。如先前所述，在洛克菲勒大学蛋白质组学资源中心进行了对分馏的外泌体的蛋白质质谱分析(costa-silvaetal.，“pancreaticcancer外泌体sinitiatepre-metastaticnicheformationintheliver,”naturecellbiology17：816-826(2015)；hoshinoetal.，“tumourexosomeintegrinsdetermineorganotropicmetastasis,”nature527：329-335(2015)，这些文献的全部内容在此参考并入)，并在来自5个不同细胞系(b16-f10、4t1、pan02、aspc-1和mda-mb-4175)的各个样品(外泌颗粒、exo-s和exo-l)的两个独立的生物学重复上进行。对于蛋白质组数据处理和主成分分析(pca)，使用r程序的′limma′程序包处理蛋白质组表达数据。导入了蛋白质组学表达数据，并使用‘normalizebetweenarrays’函数(方法＝百分位)进行了基准化(bolstadetal.，“acomparisonofnormalizationmethodsforhighdensityoligonucleotidearraydatabasedonvarianceandbias，”bioinformatics19：185-193(2003)，其全部内容在此参考并入)。执行了pca以用于数据精简，使用带有默认选项的“princomp()”函数将数据集简化为三个维度以进行绘图，并使用‘rgl’包和‘plot3d()’函数进行了图示。对于聚类(clustering)和标志物选择，使用gene-e软件进行了一致性(consensus)聚类分析、各馏分的标志物选择和热图生成。进行了一致性聚类以评估蛋白质组学的表达在各馏分之间是否有所不同(montietal.，“consensusclustering：aresampling-basedmethodforclassdiscoveryandvisualizationofgeneexpressionmicroarraydata，”machlearn52：91-118(2003)，其全部内容在此参考并入)。为了鉴定馏分特异性标记物，使用最大探针将探针(基于uniprotid)的值折叠到蛋白质水平。只有在样品的两个重复物中都检测到的蛋白质才被包括进来，以供进一步分析。蛋白质通过信噪比统计(μa-μb)/(αa+αb)进行分选，其中μ和α分别代表各类蛋白质组表达的均值和标准差(golubetal.，“molecularclassificationofcancer：classdiscoveryandclasspredictionbygeneexpressionmonitoringm”science286：531-537(1999)，其全部内容在此参考并入)。接下来，使用gene-e的信噪比标志物选择工具来识别具有1,000个排列的馏分特异性标志物。选择馏分特异性标志物的截断值为倍数变化≥5，假发现率(fdr)＜0.05，以及平均蛋白表达≥108且≥80％相应馏分中为阳性(即对于各纳米颗粒子集，来自5个细胞系的5个样品中至少有4个)。使用具有相对颜色方案的gene-e(通过减去各平均蛋白表达量，除以各行的各标准偏差)生成了65个标志物(39个外泌颗粒特异性标志物；5个exo-s标志物；21个exo-l标志物)的热图用于显示差异性蛋白表达式样。对于基因集富集分析(gsea)，使用了整个蛋白质组学表达数据集(subramanianetal.，“genesetenrichmentanalysis：aknowledge-basedapproachforinterpretinggenome-wideexpressionprofiles，”procnatlacadsciusa102：15545-15550(2005)，其全部内容在此参考并入)。将来自分子特征(signatures)数据库v5.1的基因集用于gsea(h：50个标志性基因集；c2：kegg：京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes[kegg])[kegg]通路数据库中的186个经典途径；c5：基于基因本体论(geneontology)[go]术语的825个基因集)(liberzonetal.，“molecularsignaturesdatabase(msigdb)3.0，”bioinformatics27：1739-1740(2011)，其全部内容在此参考并入)。默认参数用于识别显著富集的基因集(fdrq＜0.25)。糖蛋白的提取和凝集素印迹。将纳米颗粒用含有1mm原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(roche)的rapigestsf(waters)在冰上裂解30分钟，然后以16,000xg离心20分钟。对于凝集素印迹，将0.5μg的总蛋白提取物用4-15％梯度凝胶(biorad)分离并转移到硝酸纤维素膜上。将样品与以下生物素化的凝集素在室温(rt)孵育1小时：橙黄网孢盘菌(aleuriaaurantia)凝集素(aal；fucα6glcnac和fucα3glcnac)，西洋接骨木(sambucusnigra)凝集素((sna；neu5aca6(galorgalnac))，菜豆(phaseolusvulgaris)白细胞凝集素(l-pha；galβ4glcnacβ6(glcnacβ2manα3)manα3)，和菜豆(phaseolusvulgaris)红细胞凝集素(e-pha；galβ4glcnacβ2manα6(glcnacβ4)(glcnacβ4manα3)manβ4)(vectorlaboratories，1∶2000稀释度，但用于l-pha的为1∶1000稀释度)。vectastaineliteabchrp试剂盒(vectorlaboratories)用于通过ecl增强的化学发光技术(gehealthcarelifesciences)进行信号检测。在银染的凝胶上平行评估样品的总蛋白质谱(图9a)。(缩写：fuc，岩藻糖；glcnac，n-乙酰氨基葡萄糖；man，甘露糖；neu5ac，神经氨酸；gal，半乳糖；galnac，n-乙酰半乳糖胺。)糖组学分析。使用标准蛋白质组学方案(ferreiraetal.，“synthesisandoptimizationoflectinfunctionalizednanoprobesfortheselectiverecoveryofglycoproteinsfromhumanbodyfluids，”analyticalchemistry83：7035-7043(2011)，其全部内容在此参考并入)，将不同馏分的糖蛋白提取物还原、烷基化并用测序级的修饰的胰蛋白酶(promega)消化。基于jensen等人(kolarichetal.，“isomer-specificanalysisofreleasedn-glycansbylc-esims/mswithporousgraphitizedcarbon，”methodsinmolecularbiology1321：427-435(2015)，其全部内容在此参考并入)的修改版分析n-聚糖。简而言之，n-连接的聚糖用pngasef(elizabethkingiameningoseptica；sigma)释放，然后如前所述(jensenetal.，“structuralanalysisofn-ando-glycansreleasedfromglycoproteins，”natureprotocols7：1299-1310(2012)，其全部内容在此参考并入)用多孔石墨化碳固相萃取柱(pgc-spe，hypersep-96-hypercarb，25mg，thermoscientific)脱氨基并部分纯化。通过malditof/tof质谱分析法(4800plus，sciex)使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca；10mg/ml的50％can溶液)，并以反射器负离子模式(质量范围为m/z1000至5000)且进行外部校准(tof/tof校准混合物，sciex)的情况下执行聚糖的分析和表征。执行了三个独立的分析测量。用在线偶联到配备有纳米电喷雾离子源(thermoscientific，easy-spray源)的ltq-orbitrapxl质谱仪(thermoscientific)的nanohplc系统(dionex，3000ultimaterslcnano)，使用nanohplc-高分辨率质谱分析(hrms)来验证maldi-ms谱中大多数判别性离子的存在。使用多孔石墨碳(pgc)进行n-聚糖色谱分离是根据先前描述的步骤(jensenetal.，“structuralanalysisofn-ando-glycansreleasedfromglycoproteins,”natureprotocols7：1299-1310(2012)，其全部内容在此参考并入)改编的。将纳流pgc色谱柱(hypercarb，150mm×75μmid，粒径3μm，thermoscientific)随后是反相c18色谱柱(easy-sprayc18pepmap，100a，150mmx75μmid，粒径3μm，thermoscientific)组合成系列。这样可以更好地分离碳水化合物和其余的胰蛋白酶肽，同时最大程度地减少在pgc色谱柱后直接使用纳喷雾发射器时遇到的盐沉淀事件。质谱仪以负离子模式运行。当考虑质量准确度低于10ppm时，使用glycomod工具预测了maldi-ms谱上的聚糖前体的单糖组成。考虑了唾液聚糖与na+和k+进行中性交换的可能性。通过考虑以下因素，基于nanohplc-pgc-hrms分析对聚糖结构进行了分配：i)分子单同位素质量；(ii)cid-ms/ms从头测序；和(iii)pgc-lc的相对保留时间。特别地，基于保留时间区分α2,3-连接的和α2，6-连接的唾液酸化n-聚糖(α2，6＜α2，3)(kolarichetal.，“isomer-specificanalysisofreleasedn-glycansbylc-esims/mswithporousgraphitizedcarbon，”methodsinmolecularbiology1321：427-435(2015)，其全部内容在此参考并入)。为了进一步验证，将ms/ms片段谱与在glycoworkbench上通过计算机计算的糖苷片段相匹配(ceronietal.，“glycoworkbench：atoolforthecomputer-assistedannotationofmassspectraofglycans,”journalofproteomeresearch7：1650-1659(2008)，其全部内容在此参考并入)。虽然使用对哺乳动物n-糖基化的一般理解来确定某些结构方面，但是在一些报告的n-聚糖子集中仍存在一些结构歧义，如方括号所示。将单同位素峰强度考虑在内，基于maldi-ms的分配使用半定量方法比较聚糖成分。平行地分析了聚糖标准品和阴性对照。这些结果已基于nanohplc-hrms离子色谱图(eic)上各物质的强度进行了验证(m/z±0.01)。脂质组学：样品制备、质谱和数据分析。等量的各样品(基于bca定量)进行脂质组分析。首先使用配备oasis180冷却器(4℃；振幅，95；处理，5分钟；脉冲开启30秒；脉冲关闭55秒)的modelq700qsonica超声仪对样品进行超声处理，在4℃下以14,800rpm离心10分钟，将50μl提取物上清液中掺入2μl50μg/ml内标混合物(cer18:1/12:0；pc12:0/12:0；pe14:0/14:0；pg14:0/14:0；ps14:0/14:0)。随后，在伊利诺伊大学厄本那-香槟分校的royj.carver生物技术中心的代谢组学实验室使用thermoq-exactivems系统(bremen，germany)对样品进行了分析。使用xcalibur3.0.63软件进行数据采集和分析。使用了dionexultimate3000系列hplc系统(thermo，germering，germany)，并在具有流动相a(60％乙腈：含10mm甲酸铵和0.1％甲酸的40％h2o)和流动相b(90％异丙醇：含10mm甲酸铵和0.1％甲酸的10％乙腈)以及0.4ml/min流速的thermoaccucorec18色谱柱(2.1x150mm，2.6μm)上执行了lc分离。线性梯度如下：0分钟，70％a；4分钟，55％a；12分钟，35％a；18分钟，15％a；20-25分钟，0％a；26-33分钟，70％a。将自动进样器设置为15℃，并将色谱柱保持在45℃。进样量为10μl。在正电喷雾电离(鞘气流速，50；辅助气流速，13；扫气流速，3；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，263℃；辅助气体加热器温度，425℃)和负电喷雾电离(鞘气流速，50；辅助气流速，13；扫气流速，3；喷雾电压，-2.5kv；毛细管温度，263℃；辅助气体加热器温度，425℃)的条件下获得质谱。全扫描质谱分辨率设置为70,000，扫描范围为m/z230～m/z1,600，agc目标为1e6且最大注入时间为200毫秒。对于ms/ms扫描，将质谱分辨率设置为17,500，agc目标为5e4且最大进样时间为50毫秒。循环计数为10。分离窗口为1.0m/z且nce为25和30ev。为了进行数据分析，使用lipidsearch(v.4.1.30，thermo)进行脂质鉴定。将脂质信号应答对相应的内标信号应答进行基准化。对于没有相应内标的脂质类别，将正脂质离子信号对内标cer18:1/12:0的信号基准化，并将负离子信号对内标pg14:0/14:0的信号基准化。样品中脂质类别的百分比通过将特定脂质类别中定量的各分子种类的百分比相加得出，且相对丰度由各组样品的3次重复的平均百分比表示。使用anova测试分析源自同一细胞系的不同颗粒亚群之间的差异(q＜0.05)。核酸分析。按照制造商的方案，使用ampurexp珠(agencourt)从纳米颗粒中提取dna。将等体积的纳米颗粒pbs溶液和裂解缓冲液al(qiagen)混合，并与蛋白酶k(20μg/ml，qiagen)在56℃孵育10分钟。将该混合物与ampure珠、异丙醇和peg溶液(beckman)的各一份体积混合，并在rt下孵育5分钟。然后在rt下在磁铁上从溶液/上清液中分离出与珠子结合的dna，分离5分钟。通过移液除去上清液，并将珠子结合的dna用新鲜制备的80％乙醇洗涤两次，然后风干5分钟。最后，用无核酸酶的水从珠子上洗脱dna，并使用qubit测定法(lifetechnology)进行定量。对各个样品的两个独立的生物学重复物进行dna提取。按照制造商的方案，使用ambionmirvarna试剂盒(lifetechonology)提取rna，但进行了一处修改：首先用7份体积的裂解缓冲液裂解一份体积的纳米颗粒pbs溶液。使用安捷伦totalrnapico试剂盒分析样品。对各个样品的两个独立的生物学重复物进行dna提取。生物分布评估。首先按照制造商的操作方案用近红外染料cellvuenir815(ebioscience)标记分馏的纳米颗粒，然后用20mlpbs洗涤，并在10℃以100,000xg超速离心70分钟以沉淀。将重悬于100μlpbs中的10μg标记的纳米囊泡，或将等体积的模拟反应混合物经眶后注入初始小鼠(6周龄雌性c57bl/6小鼠，购自jacksonlabs)。注射后24小时，使用odyssey成像系统(li-corbiosciences)收集组织并进行分析。执行两个独立实验，每组3只动物。没有使用统计方法来预先确定样本量。实验既不是随机的，也不是盲(blind)的。所有动物实验均遵守道德规范，并符合威尔康奈尔医学研究所的iacuc和aaalas准则(已批准用于动物方案0709-666a)。统计和再现性。图形数据中的误差条表示平均值±sem。使用单向anova确定统计显著性。p＜0.05被认为具有统计学显著性。使用graphpadprism软件进行统计分析。对于脂质类别分析，使用qlucoreomicsexplorer(sweden)进行anova测试(q＜0.05)。对于蛋白质组学分析，通过(μa-μb)/(αa+αb)的信噪比统计分选蛋白质，其中μ和α分别代表蛋白质组表达的均值和标准差。选择馏分特异性标志物的截断值为倍数变化≥5，假发现率(fdr)＜0.05，以及平均蛋白表达≥108且≥80％相应馏分中为阳性(即对于各纳米颗粒子集，来自5个细胞系的5个样品中至少有4个)。对于gsea，计算了kolmogorov-smirnov统计数据以评估来自预定通路的蛋白质是否朝基因排名表的最高或最低的方向显著地过表达(fdrq＜0.25)。对本工作中研究的各细胞系进行了多次af4分析：b16-f10，>50x(重复次数)；aspc-1，9x；pan02，16x；mda-mb-4175(4175)，17x；和4t1，10x。对b16-f10，7x；aspc-1，3x；pan02，2x；4175，1x；和4t1，4x进行了分馏的颗粒的tem成像分析。使用af4分析了四个独立的人黑色素瘤标本，并通过tem分析了其中两个。对源自五个不同细胞系(b16-f10；aspc-1；pan02；4175；和4t1)的各颗粒的两个生物学独立样品执行了外泌颗粒、exo-s和exo-l的蛋白质组分析。对各颗粒亚型的特异性特征蛋白的蛋白质印迹验证进行了一次(注于图1d的图注)。对于n-聚糖研究，独立地重复两次凝集素印迹，b16-f10和4175的aal和e-pha印迹除外，它们进行了一次(图8a)。在b16-f10的两个生物学独立的样品以及aspc-1和4175的一个样品上执行了糖化组ms(图9b-9d)。基于一个实验的3次独立分析测量值，对前6个最丰富的聚糖进行定量(图8c，图9c和9d)。银染-page分析对于b16-f10和4175独立地重复两次，而对于aspc-1则重复一次(图9a)。nanohplc-pgc-hrms进行一次(图9e-9i)。对3个生物学独立的样品进行了脂质组学分析。对各颗粒亚型的dna和rna分析重复两次。各颗粒亚型的器官生物分布分析独立重复了4次。nta分析使用3个生物学独立的样品进行。tem分析对af4峰p1和p5重复3次，对hdl、ldl和vldl重复一次(图7d)。af4分析对从技术和生物学重复中收集的b16-f10sev、以及保存在4℃或-80℃的样品独立重复3次，对不同传达次数的细胞重复两次，并对缺氧与常氧条件下的比较用3个不同的细胞系独立地进行了重复。af4和tem分析对从空白培养基对照和b16-f10和4175的cm分离出的颗粒进行一次(图2j和2k)。将以批处理模式的对来源于不同细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l的流体动力学直径的独立测量进行重复(按外泌颗粒、exo-s和exo-l顺序)：b16-f10(分别为n＝10、9和8个独立测量值)；pan02(n＝11，6，11)；aspc-1(n＝5，5，5)；4175(n＝3，5，3)；4t1(n＝5，5，5))。对于ζ电势，重复独立测量：b16-f10(n＝8，10，12)；pan02(n＝13，11，13)；aspc-1(n＝12，12，12)；4175(n＝17，9，6)；4t1(n＝13，3，9)。对于刚度，b16-f10(n＝6，6，6)；pan02(n＝6，6，6)；aspc-1(n＝21，19，16)；4175(n＝11，10，5)；4t1(n＝9，8，9)。对于afm成像分析外泌颗粒的高度：b16f10(分析了n＝754个颗粒)，aspc1(n＝475)和4175(n＝160)。对来自3种不同细胞系的样品重复进行外泌颗粒的afm成像。对于上述所有实验，所有重复的尝试均成功，结果相似。数据可用性。已经存放了对来自各种癌细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l亚群的蛋白质组学分析的数据集。与来自不同癌细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l独特相关的或是它们中的前50种最丰富的蛋白质显示在下面的表1中。脂蛋白颗粒的蛋白质组学分析示于表2中。表2与衍生自各种癌细胞系的外泌颗粒、exo-s和exo-l相关的蛋白质的基因集富集分析(gsea)示于表3-5中。表3.外泌颗粒的gsea。表4.exo-s的gsea表5.exo-l的gsea在来源于不同细胞系的外泌颗粒和外泌体子集中鉴定的脂质类别(原始数据和基准化数据)示于表6-8中。实施例1-识别不同的纳米颗粒群和外泌体子集首先通过af4对源自b16-f10黑素瘤的sev进行分馏(参见方法部分)。基于沿时程(x轴)实现了sev混合物基于流体动力学半径(黑点，y轴)的线性分离(图1a)。用于实时动态光散射(dls)测量(红色迹线)的在线qels监视器确定了颗粒的流体动力学半径。uv吸收(蓝色迹线)测量了特定时间点的相应颗粒尺寸的蛋白质浓度和颗粒丰度。直径为35-150nm的颗粒已通过af4成功分离(图1a)。识别出五个峰(p1-p5)，分别对应于检测到最大丰度颗粒的时间和粒径。p1代表空(void)峰，是所有类型纳米颗粒的混合物。p5由具有更大尺寸的单个或聚集的颗粒和蛋白质聚集体组成，其在当前af4方案的分离范围之外，并且当错流下降至零时被洗脱出来(图2a)。峰p2、p3和p4的流体动力学直径分别为47nm、62nm和101nm。为了推断流体动力学半径，将相关函数拟合到单指数(singleexponentials)(图1b，代表性p3馏分图)。使用nanosighttrackinganalysis(nta)测量各个馏分，验证了各馏分在60nm至140nm之间的一致粒径(图2b)。对于具有较小(～70nm)或较大(～160nm)粒径的那些颗粒，dls与af4组合显示出比nta更宽的动态范围(图2c)。此外，在60-160nm范围内的各单独馏分的nta显示出具有～77nm的峰的单峰分布(图2d)。对af4输入物和整个动态范围内的代表性馏分进行负染色的透射电子显微镜(tem)显示了三个具有不同形态和尺寸(图1c)的颗粒群(p2，p3，p4；图1a)。p2代表先前未描述过的独特的纳米颗粒群，其小于50nm(～35nm)并且明显缺乏外部膜结构(图1c)；这些结构因此被命名为“外泌颗粒”。其他两个纳米颗粒亚群被称为小外泌体(exo-s；60-80nm[p3])和大外泌体(exo-l；90-120nm[p4])(图1c)。所有三种颗粒类型都能在输入物的tem图像中很容易地检测到(图1c)。蛋白印迹分析证实了exo-s和exo-l的外泌体标志物tsg101和alix，以及外泌颗粒的热休克蛋白90(hsp90)(图1d)。以批处理模式测得的各颗粒类型的尺寸显示出一致的结果(图1e)。总之，单次运行af4可以以强健且高度可再现的方式有效地辨别外泌颗粒和两个不同的外泌体亚群(图2e，2f)。样品的冷冻-解冻导致无关紧要的差异(图2g)。然而，培养条件的变化导致各颗粒类型的相对丰度不同(图2h-2i)。重要的是，当并行处理时，与b16-f10和mda-mb-4175的cm相比，在类似于外泌颗粒的时间范围内，空白基质对照中仅洗脱出了较小的峰(图2j，2k)，因此证实了外泌颗粒确实是由培养细胞主动分泌的，而不仅仅是培养基中的聚集体。通过使用af4，在分析的超过20种细胞系中检测到了具有对应于外泌颗粒和exo-s/l的直径的不同颗粒(表9，图3a)，这些发现通过对来自所选细胞系的合并馏分的tem分析得到证实(图3b)。表9基于uv吸光度和tem分析发现，除b16-f10和b16-f1中exo-s相对更为丰富外，所有细胞相对于exo-s/l分泌更多量的外泌颗粒(图3a和图1a，1b)。使用zetasizer测量这些各个颗粒的流体动力学直径显示出与b16-f10制剂相似的尺寸(图1e)。还通过tem在来自人黑素瘤肿瘤外植体的cm的af4分馏的sev中检测到了外泌颗粒和exo-s/l(图1f，箭头；图4a)。使用zetasizer以批处理模式测得的外泌颗粒和exo-s大小与来自肿瘤细胞系的结果相当(图1g)。af4分析和tem成像分析表明，正常的小鼠组织外植体(乳腺脂肪垫和肺)也分泌外泌颗粒和exo-s/l纳米颗粒(图4b)。实施例2-对外泌颗粒和外泌体亚群的生物物理表征鉴于外泌颗粒和exo-s/l之间的结构差异，检测了它们的生物物理性能，例如ζ电位和刚度。使用zetasizer测量ζ电位(平均表面电荷)后发现所有颗粒均带负电，而外泌颗粒带的负电荷最弱(-2.7mv至-9.7mv)；exo-l，最强(-12.3mv至-16.0mv)；和exo-s，中等(-9.0mv至-12.3mv)(图5a)。对于颗粒刚度，在溶液中执行了原子力显微镜检查(afm)(参见方法部分)。外泌颗粒的刚度最高(145～816mpa)且exo-l最低(26～73mpa)，而exo-s刚度中等(70～420mpa)。对源自b16-f10、mda-mb-4175和aspc-1细胞系的外泌颗粒的afm分析证实了外泌颗粒的结构异质性，并且平均外泌颗粒高度分别为5.9nm、7.0nm和5.8nm(图5c，5d)。总的来说，这些发现证明了外泌颗粒相对于不同的外泌体亚群表现出的多样的生物物理性能。还需要进一步的研究大小、电荷和机械性能如何影响体内纳米颗粒的差异稳定性、运输和摄取(beningoetal.，“fc-receptor-mediatedphagocytosisisregulatedbymechanicalpropertiesofthetarget，”journalofcellscience115：849-856(2002)；keyetal.，“softdiscoidalpolymericnanoconstructsresistmacrophageuptakeandenhancevasculartargetingintumors，”acsnano9：11628-11641(2015)，这些文献的全部内容在此参考并入)。实施例3-外泌颗粒和外泌体亚群中不同的蛋白质组内容和细胞功能为了表征外泌颗粒和不同的外泌体亚群的分子组成，使用无标记质谱对源自b16-f10、pan02、4t1、aspc-1、mda-mb-4175细胞的纳米颗粒进行蛋白质组学分析。在外泌颗粒中鉴定出了165-483范围的蛋白质，在exo-s中鉴定出了433-1004范围的蛋白质，在exo-l中鉴定出了247-1127范围的蛋白质。此外，在各纳米颗粒亚型中检测到了独特的蛋白质(图6a)，这表明外泌颗粒是由细胞释放的独特实体，而不是外泌体的碎片或片段。通过检测蛋白质的亚细胞定位注释发现exo-s/l特异性富集膜相关蛋白，而膜相关蛋白在外泌颗粒中相对耗竭(表10)，这与鉴定出exo-s为膜囊封的颗粒且外泌颗粒为未囊封的颗粒的结构研究一致。表10.在exo-s/l内鉴定出了escrt-和snare-相关蛋白，它们参与囊泡出芽、膜融合和外泌体生物发生(colomboetal.，“biogenesis，secretion，andintercellularinteractionsofexosomesandotherextracellularvesicles,”annurevcelldevbiol30：255-289(2014)；hessviketal.，“currentknowledgeonexosomebiogenesisandrelease，”cellmollifesci(2017)，这些文献的全部内容在此参考并入)。特别地，与内体、多囊泡体、液泡和吞噬囊泡相关的蛋白质富集于exo-s中。质膜、细胞-细胞接触/连接、后期内体和反式高尔基体网络蛋白质富集于exo-l中。值得注意的是，与细胞外基质和空间、蛋白酶体辅助复合物、内质网、线粒体和微管/细胞骨架相关的蛋白质被包装在外泌颗粒中。这些发现暗示在外泌颗粒、exo-s和exo-l的生物发生方面可能存在根本差异。主成分分析(pca)表明，与来自同一细胞类型的外泌颗粒相比，exo-s和exo-l的蛋白质表达具有更紧密的相关性(图7a)。根据pca和一致性聚类分析，来自不同细胞类型的外泌颗粒之间表现出的相似程度高于与来自同一细胞类型的exo-s和exo-l的相似程度(图6b，6c)。为了鉴定各个颗粒子集中的特征蛋白质，对在这些数据集中鉴定出的蛋白质的表达水平进行统计分析。明确了外泌颗粒有64种蛋白质，而exo-s/l有99种蛋白质(表11-14)，假发现率(fdr)＜0.05，各目标颗粒子集中具有阳性富集度，以及检测频率>80％(即，在来源于5种不同细胞系的各纳米颗粒亚型中，特定蛋白质在至少4/5的样品中呈阳性富集)。表11.表12.表13.表14.值得注意的是，外泌颗粒显著富集了与代谢有关的蛋白质(请参见下面的基因集富集分析[gsea]分析)，包括mat1a、idh1、gmppb、ugp2、ext1和pfkl。唾液酸糖蛋白半乳糖凝集素3结合蛋白(lgals3bp)和控制聚糖介导的蛋白折叠控制(calr)的关键蛋白质(molinarietal.，“chaperoneselectionduringglycoproteintranslocationintotheendoplasmicreticulum,”science288：331-333(2000)，其全部内容在此参考并入)和聚糖加工的关键蛋白(man2a1，hexb，ganab)(fukudaetal.，“incompletesynthesisofn-glycansincongenitaldyserythropoieticanemiatypeiicausedbyadefectinthegeneencodingalpha-mannosidaseii，”procnatlacadsciusa87：7443-7447(1990)；yangetal.，“anintrinsicmechanismofsecretedproteinagingandturnover，”procnatlacadsciusa112：13657-13662(2015)；martiniuketal.，“identityofneutralalpha-glucosidaseabandtheglycoproteinprocessingenzymeglucosidaseii.biochemicalandgeneticstudies，”thejournalofbiologicalchemistry260：1238-1242(1985)，这些文献的全部内容在此参考并入)也富集于外泌颗粒中，这表明外泌颗粒的负载物可能通过特定的聚糖识别介导受体细胞的靶向并调节受体细胞中的糖基化。独特地表达于exo-s/l中的蛋白质包括膜联蛋白，escrt组分(带电的多囊泡体蛋白/chmp，液泡蛋白分类蛋白，hgs，alix1/pdcd6ip和tsg101)，hsp40(dnaj)家族蛋白，信号转导g蛋白亚基，整合素，rab蛋白和溶质载体家族成员。关键信号通路的成员，例如jak1，tgfbr2和met，也富集于exo-s/l中。为了评估exo-s和exo-l亚群的独特标志物，使用t检验分别比较了这两个样品组和外泌颗粒之间的蛋白表达。将第二组过滤器(蛋白质强度/面积>108，倍数变化≥5.0)应用于已鉴定的外泌颗粒和exo-l标记，但未应用于exo-s(图6d)。与外泌颗粒和exo-l相比，exo-s的特征蛋白更少，这很可能归因于exo-s与其他颗粒的相似性。通过蛋白质组学在各子集中鉴定出的代表性特征蛋白通过蛋白质印迹分析得到证实(图6e)。进一步针对常规外泌体标志物对这些蛋白质组学数据集进行挖掘，这些标志物包括flotillin、cd9、cd63、cd81、alix1、tsg101、hsc70(hspa8)和hsp90(图6f)。在这五种细胞系中，flotillin(flot1和flot2)代表exo-s的真实标志物，而hsp90ab1则优先与外泌颗粒相关。虽然cd9、cd63和cd81均显示出与exo-s/l子集的特异性结合，但它们均显示了细胞类型和颗粒依赖性的优先表达。与kowaletal.，“proteomiccomparisondefinesnovelmarkerstocharacterizeheterogeneouspopulationsofextracellularvesiclesubtypes,”procnatlacadsciusa113：e968-977(2016)一致的是，组合cd63、cd9或cd81对于分离/标记外泌体是必要的，该文献的全部内容在此参考并入。在exo-s/l子集中发现了许多rab蛋白，但它们中很少发现于外泌颗粒(图7b)，这表明rab蛋白对于exo-s/l的形成和运输起着关键作用，但是对于外泌颗粒的生物发生不起关键作用。接下来，检查了纳米颗粒的各子集中最丰富的蛋白质。血红蛋白、组蛋白、细胞骨架蛋白(肌动蛋白和微管蛋白)、肽基脯氨酰异构酶a(ppia)和hsp在所有三个纳米颗粒亚群中的丰富度均排在前50位(表1)。在exo-l的前50种蛋白质中也有hsp40/dnaj家族(hsp70伴侣蛋白)成员。有趣的是，hsp90ab1优先包装在外泌颗粒中，而hsp70成员(hspa8、hspa2和hspa5)在exo-s/l中含量更高。外泌颗粒中相对富集的其他蛋白质包括间α-胰蛋白酶抑制剂重链家族成员(itih)、凝溶胶蛋白(gsn)、踝蛋白(talin)(tln1)、wd重复结构域1(wdr1)，以及参与代谢的蛋白质，例如如磷酸甘油酸激酶1(pgk1)、丙酮酸激酶肌(pkm)和烯醇酶1(eno1)。与上述分析一致的是，sdcbp、pdcd6ip/alix、四跨膜蛋白(tetraspanin)(cd9、cd63、cd81等)、g蛋白家族蛋白和整联蛋白在exo-s和exo-l中均占很高的比例。四跨膜蛋白优先富集于exo-s中，而g蛋白和整联蛋白在exo-l中更突出。真核翻译延伸因子1α1(eef1a1)最常见于外泌颗粒和exo-l中。优先与exo-s相关的其他蛋白质包括免疫球蛋白超家族成员8(igsf8)及其旁系前列腺素f2受体抑制剂(ptgfrn)、乳脂球-egf因子8蛋白(mfge8)和escrt-1复合物组分。值得注意的是，膜联蛋白和s100蛋白仅出现在exo-l的前50个蛋白质中。此外，为了排除外泌颗粒中脂蛋白污染的可能性，对通常与纯化的脂蛋白颗粒(高密度、低密度和极低密度脂蛋白，即hdl、ldl和vldl)相关的蛋白进行了蛋白质组ms分析，然后评估了它们在外泌颗粒和exo-s/l中的存在。在脂蛋白中发现少得多的蛋白(表2)，并且这些蛋白质中仅有一些在外泌颗粒和exo-s/l中被检测到，表明大多数纳米颗粒蛋白与脂蛋白不同。粗略估计，脂蛋白相关的蛋白质占总的纳米颗粒蛋白的0-8％(图7c)。此外，em分析显示脂蛋白的形态/结构明显不同于外泌颗粒和exo-s/l(图7d)。综上所述，这些分析排除了外泌颗粒仅是脂蛋白污染物的可能性。当对已知复合物的亚基检查外泌颗粒蛋白时，也排除了外泌颗粒被其他类型的高分子量蛋白复合物污染的可能性。除了以下未检测到与外泌颗粒大小相似的蛋白质复合物的多个亚基的共存(表2)，parvulin相关的预rrnp复合物的59个亚基中有10个共存于4t1外泌颗粒中，核糖体的17个亚基共存于aspc-1外泌颗粒中，以及激酶成熟复合体1的16个亚基中的7个于共存mda-mb-4175外泌颗粒中。然而，在每个情况下，这些蛋白质分别仅占总外泌颗粒蛋白的1.8％、2.1％和1.8％，表明它们使得外泌颗粒的纯度降低了约2％。为了深入了解这些颗粒子集的功能，利用基因本体论(go)，京都基因与基因组百科全书(kegg)和标志(hallmark)数据库进行了gsea(表3-5)。令人惊讶的是，gsea证明外泌颗粒特异性蛋白质选择性地富集于代谢过程中，包括碳水化合物代谢、蛋白质合成和小分子。不同于没有代谢过程与exo-s/l相关，前50个“go-生物过程”通路中至少36个鉴定出与外泌颗粒相关的代谢过程(表3-5)。在外泌颗粒中鉴定了编码参与缺氧、微管和凝血的蛋白质的基因(图7e)。exo-s富集膜囊泡的生物发生和转运、蛋白质分泌和受体信号转导基因集。对于exo-l，富集的基因集包括有丝分裂纺锤体、il-2/stat5信号传导、多器官细胞器组织和g蛋白信号传导。富集于外泌颗粒(糖酵解和mtorc1信号传导)、exo-s(内体和蛋白质分泌)和exo-l(有丝分裂纺锤体和il-2/stat5信号传导)的排名最靠前的基因集分析示于图6g中。实施例4-外泌颗粒和外泌体亚群的不同的n-聚糖谱异常糖基化参与包括癌症在内的病理过程(pinhoetal.，“glycosylationincancer：mechanismsandclinicalimplications,”naturereviewscancer15：540-555(2015)，其全部内容在此参考并入)。此处的目的是通过进行凝集素印迹分析(图8a)和糖蛋白质谱分析来确定三个细胞系中各颗粒子集的n-聚糖谱。识别对分n-聚糖的e-pha在b16-f10和aspc-1的exo-s和exo-l中均检测到了约75kda的主条带，在三个细胞系的外泌颗粒和mda-mb-4175的exo-s中检测到了微弱信号。e-pha在mda-mb-4175外泌颗粒中检测到了高分子量糖蛋白(240kda)，在aspc-1和mda-mb-4175外泌颗粒中检测到了高分子量糖蛋白(150kda)。识别支链n-聚糖的l-pha在b16f-10和aspc-1的exo-s和exo-l中均检测到了75kda的显著条带。在所有外泌颗粒(尤其是mda-mb-4175)中也检测到了50至70kda范围的多个条带。使用aal分析与岩藻糖基化(岩藻糖连接的α-1，6)至glcnac相关的结构或与岩藻糖(α-1，3)连接至glcnac的相关结构，发现b16-f10和aspc-1的exo-s和exo中都有两个70至100kda的丰富的糖蛋白。所有三种细胞系中的外泌颗粒和mda-mb-4175的exo-s在高分子量糖蛋白(200-280kda)上均表现出较强的岩藻糖基化。识别α-2,6-连接的唾液酸的sna在所有外泌颗粒中检测到了高分子量的α-2，6-唾液酸化糖蛋白(200-250kda)的存在。此外，在来自b16-f10的exo-l(而非exo-s)中独特地检测到了展示α-2，6-连接的唾液酸修饰的低分子量蛋白质(～60kda)。对于aspc-1，外泌颗粒是唾液酸化糖蛋白的主要运载体，而在exo-l中几乎不存在这些唾液酸化的结构。凝集素结合曲线与sds-page凝胶中最丰富的蛋白质不重叠，表明凝集素识别的特异性与蛋白质丰度无关(图9a)。因此，exo-s和exo-l相对于外泌颗粒显示出了独特的n-糖基化模式。值得注意的是，与外泌颗粒和exo-s/l相关的n-聚糖谱随细胞类型而异。未来的研究将通过糖蛋白组学方法来解答这些糖蛋白的身份问题。接下来的目的是通过maldi-tof质谱法(ms)鉴定在各颗粒子集中富集的聚糖结构谱。在源自b16-f10的外泌颗粒和exo-s/l上进行了两个独立的半定量ms分析(图8b)。图8c描绘了在其中一个代表性实验中检测到的前六个最丰富的n-聚糖结构的定量。在所有子集中均观察到了某些复合n-聚糖的普遍表达，对应于m/z2209.8、2223.7、2237.7和2365.5处的峰。具体来说，在m/z2015.7处的复合n-聚糖和在m/z2404.8处的混合(hybrid)n-聚糖富集于外泌颗粒中。此外，这六个n-聚糖中有四个含有唾液酸，六个中的三个被岩藻糖基化。类似地，离子m/z2015.7和2404.8在来自mda-mb-4175的外泌颗粒中富集(图9b，9d)。离子m/z2404.8略微富集于aspc1外泌颗粒中，但在aspc-1样品中未检测到m/z2015.7处的离子(图9b，9c)。相反，m/z2012.7处的离子在aspc1外泌颗粒和exo-s中被强烈检测到。展现出exo-s富集的m/z2117.7和2389.9处的另外两个离子仅在aspc-1中检测到(图9b，9d)。高分辨率ms分析允许对某些n-聚糖的进一步结构表征(图9e-9j)。提取的离子色谱图m/z1111.39(2-)和1007.38(2-)便是这种情况(分别对应于图4c中的m/z2223.7和2015.7)。此外，cid-ms/ms从头测序和提取的离子色谱图m/z1111.39(2-)的pgc-lc相对保留时间的组合显示，这种来自外泌颗粒的n-聚糖同时含有α2,3连接的和α2，6-连接的唾液酸，而来自exo-s的聚糖仅含有α2，3-连接的唾液酸。还进一步证实了m/z1007.38(2-)在外部颗粒中的独特存在。总的来说，糖组学研究证明了所有颗粒子集中都存在复合n-聚糖且唾液酸化水平相对较高，这与先前在肿瘤微囊泡/外泌体中发现的复合n-聚糖和唾液酸糖蛋白的发现一致(escreventeetal.，“sialoglycoproteinsandn-glycansfromsecretedexosomesofovariancarcinomacells，”plosone8：e78631(2013)；batistaetal.，“identificationofaconservedglycansignatureformicrovesicles，”journalofproteomeresearch10：4624-4633(2011)；saraswatetal.，“n-linked(n-)glycoproteomicsofurinaryexosomes,”molecular&cellularproteomics14：263-276(2015)，这些文献的全部内容在此参考并入)。此外，研究发现外泌颗粒、exo-s和exo-l之间的n-聚糖组成和结构存在差异。实施例5-外泌颗粒和外泌体亚群之间不同的脂质组成为了研究各颗粒子集的脂质组成，对衍生自b16-f10、mda-mb-4175和aspc-1的这些纳米颗粒进行了定量脂质组学。通过脂质ms，发现对于所有细胞系，exo-s和exo-l比外泌颗粒含有更多的脂质(图10a，除mda-mb-4175的exo-s(>3x倍)外，在所有亚群中都>5x倍)。在所有样品中共同鉴定出了18种脂质类别(表6-8，图10b)，并且比较了它们在各样品中的相对频率。磷脂酰胆碱(pc)是所有亚群中的主要脂质成分(46％～89％)，但aspc-1外泌颗粒除外(13％)(图10b)，相反，该aspc-1外泌颗粒中的甘油二酯(dg，38％)和甘油三酯(tg，26％)含量更高。其他磷脂，包括磷脂酰乙醇胺(pe)和磷脂酰丝氨酸(ps)，在所有细胞系中占exo-s/l中总脂质的2-6％(图10b)。然而，pe和ps的水平在来自mda-mb-4175和aspc-1的外泌颗粒中较低，但与b16-f10中的exo-s/l相似(图10b，10c)。磷脂酰肌醇(pi)水平低于其他磷脂，但在各纳米颗粒子集间的分布式样与pe和ps的分布式样相似(图10b，10c)。鞘磷脂(sm)占所有样品中总脂质的2-10％，但aspc-1exo-s/l除外，后者含有更高水平的sm(28％，图10b，10c)。这项研究未收集胆固醇数据。在各细胞系中，神经酰胺(cer)、tg和溶血磷脂酰甘油(lpg)的相对水平在外泌颗粒和exo-s/l之间显著变化(anova测试，q＜0.05)。此外，与外泌体子集相比，b16-f10和mda-mb-4175的外泌颗粒中简单糖鞘脂cerg2和线粒体特异性心磷脂(cl)含量更高。相比之下，与从aspc-1细胞分离的外泌颗粒相比，cerg2和cl在exo-s/l中含量更高。与来自mda-mb-4175和aspc-1的exo-s/l中相比，外泌颗粒中的甘油单酯(mg)、磷脂酰甘油(pgc)和溶血磷脂酰胆碱(lpc)含量更高，但这三种脂质以相等的水平存在于所有三个b16-f10纳米颗粒子集中。最后，在b16-f10和mda-mb-4175的exo-s/l中检出了较高水平的溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)，而从aspc-1中却未检出。因此，该研究揭示了不同纳米颗粒子集之间在总脂质含量和组成中的细胞类型依赖性差异。总之，对各颗粒子集的蛋白质组内容的这些生物信息学分析揭示了外泌颗粒相关蛋白与代谢之间以及exo-s/l相关蛋白与多种信号转导通路(包括生物发生相关的escrt复合体)之间的主要联系。实施例6-外泌颗粒和外泌体亚群中不同的核酸内容由于先前在肿瘤来源的外泌体中检测到了dsdna(thakuretal.，“double-strandeddnainexosomes：anovelbiomarkerincancerdetection,”cellresearch24：766-769(2014)，其全部内容在此参考并入)，因此测定了外泌颗粒和exo-s/l中dna的相对丰度。在所有三种类型的纳米颗粒中都检测到了dna；然而，相对丰度因细胞类型而异(图11a)。dna的相对含量在来自mda-mb-4175的外泌颗粒和来自b16-f10细胞和aspc-1的exo-s中最高。生物分析仪(agilent)分析揭示了与各纳米颗粒子集相关的dna的不同的大小分布(图11b和图12)。外泌颗粒dna在100bp和10kb之间的大小范围内相对均匀地分布，在某些情况下略微富集于2kb左右。相比之下，对于exo-s/ldna，检测到了2kb至4kb的强富集，并且exo-ldna的峰的大小略大于exo-sdna的峰的大小。这种现象可能归因于各颗粒子集的结构能力和不同的生物发生机制。在b16-f10和aspc-1中，rna均优先与exo-s/l相关(图11c)。与外泌颗粒和exo-s相关的rna显示出单峰分布(分别为400nt和500nt处的峰)，而exo-lrna显示出双峰分布(图11d)(另一峰>4000nt)。具体来说，与细胞rna相比，18s和28srrna在exo-l中检测到的含量非常低，在exo-s中几乎未被检测到，而在外泌颗粒中则不存在。在exo-s和exo-l中检测到了一个强的小rna峰(对应于trna、微小rna(microrna)和其他小rna)，但在外泌颗粒中未检测到。值得注意的是，仅在exo-l中检测到了未知身份的独特rna峰，大小约为315nt。实施例7-外泌颗粒和外泌体亚群的不同的器官生物分布接下来，研究了初始小鼠中b16-f10衍生的纳米颗粒子集的器官生物分布。在向小鼠静脉内注射近红外染料(nir)标记的外泌颗粒、exo-s和exo-l后24小时，收集器官并使用odyssey成像系统进行分析(li-corbiosciences；图13)。有趣的是，所有纳米颗粒均被造血器官摄取，例如肝脏(约占总信号的84％)、脾脏(约占14％)和骨髓(约占1.6％)。肺(～0.23％)、淋巴结(～0.07％)和肾脏(～0.08％)显示对所有纳米颗粒亚型的摄取较少。在大脑中未检测到颗粒摄取。随后，调节各个器官中信号强度的动态范围，以比较同一器官中各纳米颗粒子集的摄取(图13a)。在肺和淋巴结中特定检测到了纳米颗粒的点状(punctuated)分布模式。这与在肝脏、脾脏和骨髓中发现的所有纳米颗粒子集的均匀分布模式形成对比。重要的是，虽然肝脏中主要摄取外泌颗粒和exo-s/l，但exo-l显示出淋巴结向性。另外，虽然在统计学上不显著，但观察到肝脏中外泌颗粒的摄取更高的趋势。定量示于图13b中。不同的器官分布表明纳米颗粒子集可能参与了肿瘤进展和转移的不同方面。实施例1-7的讨论通过差异超速离心、免疫亲和捕获、超滤和尺寸排阻色谱法、基于聚合物的沉淀和微流控技术来剖析ev群的异质性(theryetal.，“isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids，”currentprotocolsincellbiologychapter3，unit322(2006)；merchantetal.，“microfiltrationisolationofhumanurinaryexosomesforcharacterizationbyms，”proteomicsclinicalapplications4：84-96(2010)；lasseretal.，“isolationandcharacterizationofrna-containingexosomes，”journalofvisualizedexperiments59：e3037(2012)；chenetal.，“microfluidicisolationandtranscriptomeanalysisofserummicrovesicles，”labonachip10：505-511(2010)；jorgensenetal.，“extracellularvesicle(ev)array：microarraycapturingofexosomesandotherextracellularvesiclesformultiplexedphenotyping，”journalofextracellularvesicles2(2013)；tauroetal.，“comparisonofultracentrifugation，densitygradientseparation，andimmunoaffinitycapturemethodsforisolatinghumancoloncancercelllinelim1863-derivedexosomes，”methods56：293-304(2012)，这些文献的全部内容在此参考并入)，从而试图分离纳米颗粒群体已被证明是非常困难的。通过采用最新的af4技术，分离了两个可分辨的外泌体亚群exo-s和exo-l，并鉴定出了一种不同的纳米颗粒，称为外泌颗粒，其大小和内容与其他报道的颗粒不同。与费力且费时的梯度方法不同，af4具有高度可重现、快速、简单、无需标签且柔和的特点。此外，可以在一次af4运行中能有效地解析外泌体亚群和外泌颗粒，同时能对单个颗粒的各种物理参数进行实时测量。分析表明，外泌颗粒选择性地富集与代谢，尤其是“糖酵解”和“mtorc1”代谢通路有关的蛋白质，表明它们在影响靶器官细胞以及与凝血相关的蛋白(例如因子viii和x)和缺氧中的代谢过程中具有潜在作用。蛋白质组学分析还显示，外泌颗粒富集控制聚糖介导的蛋白质折叠控制(calr)的关键蛋白质(molinarietal.，“chaperoneselectionduringglycoproteintranslocationintotheendoplasmicreticulum,”science288：331-333(2000)，其全部内容在此参考并入)和聚糖加工的关键蛋白质(man2a1，hexb，ganab)(fukudaetal.，“incompletesynthesisofn-glycansincongenitaldyserythropoieticanemiatypeiicausedbyadefectinthegeneencodingalpha-mannosidaseii，”procnatlacadsciusa87：7443-7447(1990)；yangetal.，“anintrinsicmechanismofsecretedproteinagingandturnover,”procnatlacadsciusa112：13657-13662(2015)；martiniuketal.，“identityofneutralalpha-glucosidaseabandtheglycoproteinprocessingenzymeglucosidaseii.biochemicalandgeneticstudies,”thejournalobiologicalchemistry260：1238-1242(1985)，这些文献的全部内容在此参考并入)，表明外泌颗粒负载物可调节远距离受体细胞中的糖基化。对外泌颗粒中富集的蛋白质的亚细胞定位分析揭示了它们与内质网、线粒体和微管的特异性相关，证明了这些蛋白质在外泌颗粒的生物发生和分泌中的潜在作用。还鉴定了外泌体(exo-l和exo-s)相对于外泌颗粒的独特蛋白质。escrt复合物的多种成分特异性地与exo-s和exo-l相关，但未在外泌颗粒中观察到，这表明escrt复合物在exo-s/l的产生中起主要作用，但在外泌颗粒的产生中不起作用。其他富集于外泌体的蛋白质包括rab蛋白、膜联蛋白、hsp40成员和参与多种信号转导通路的蛋白，例如整联蛋白、g蛋白、jak1和tgfbr。在exo-s和exo-l蛋白负载物之间发现了进一步的差异。flotillin1、flotillin2、tweety家族成员3，四跨膜蛋白14和escrt-i亚基vps37b特别富集于exo-s中。相比之下，诸如膜联蛋白a1/a4/a5，带电荷的多囊泡体蛋白1a/2a/4b/5，液泡蛋白分类4同源物b，dnaj热休克蛋白家族(hsp40)成员a1和肌球蛋白ic等蛋白的水平在exo-l中相对更高。有趣的是，组织因子富集于exo-l中，组织因子是一种研究的比较多的外泌体蛋白(gardineretal.，“extracellularvesicles，tissuefactor，cancerandthrombosis-discussionthemesoftheisev2014educationalday，”journalofextracellularvesicles4：26901(2015)，其全部内容在此参考并入)。因此，有可能外泌颗粒和exo-l共同合作来优化体内的凝血级联反应。exo-s主要富集与内体、多囊体、液泡和吞噬囊泡相关的蛋白质，而exo-l特异性富集质膜、细胞-细胞接触/连接、后期内体和反式高尔基网络蛋白质。这些数据表明，exo-s最有可能是真实的/经典的外泌体(即来源于内体腔室的腔内囊泡)，而exo-l可能代表非经典的外泌体或具有不同亚细胞起源(即质膜出芽)的sev。。鉴定特定的外泌体和外泌颗粒标志物以更好地分离和表征这些纳米颗粒对于深化ev生物学知识至关重要。由于flotillin1和2与exo-s特异性相关，因此这些蛋白质可能代表了常规定义的外泌体的可靠标志物。其他先前报道的外泌体标志物，包括cd9、cd63、cd81、tsg101和alix1，以细胞类型依赖性的方式存在于exo-s和/或exo-l中，因此必须与尺寸排阻结合来区分外泌体亚群。值得注意的是，在外泌颗粒中高度表达的hsp90-β可能是潜在的外泌颗粒标志物，而hsp70家族的一些成员(例如hsc70/hspa8)则可以充当exo-s/l亚群的可能标志物。糖组学、脂质组学和基因组学研究还揭示了外泌颗粒和外泌体中的其他独特分子标记。与转移性肿瘤细胞中的表达相似，外泌体子集富集唾液酸化的糖蛋白，这支持了这些结构在外泌体介导的细胞识别中的作用。先前在外泌体中鉴定的一种主要的唾液酸糖蛋白(escreventeetal.，“sialoglycoproteinsandn-glycansfromsecretedexosomesofovariancarcinomacells,”plosone8：e78631(2013)；liangetal.，“complexn-linkedglycansserveasadeterminantforexosome/microvesiclecargorecruitment，”thejournalofbiologicalchemistry289：32526-32537(2014)，whichareherebyincorporatedbyreferenceintheirentirety)，thegalectin-3-bindingprotein(lgals3bp)，amodulatorofcellcommunicationandimmuneresponses(whiteetal.，“galectin-3bindingproteinsecretedbybreastcancercellsinhibitsmonocyte-derivedfibrocytedifferentiation”journalofimmunology195：1858-1867(2015)；laublietal.，“lectingalactoside-bindingsoluble3bindingprotein(lgals3bp)isatumor-associatedimmunomodulatoryligandforcd33-relatedsiglecs，”thejournalofbiologicalchemistry289：33481-33491(2014)，这些文献的全部内容在此参考并入)在外泌颗粒中高度富集。该配体能够通过蛋白质，例如胶原蛋白，纤连蛋白，巢蛋白，半乳糖凝集素-3和整联蛋白β-1，介导外泌颗粒与靶细胞的特异性相互作用(hellsternetal.，“functionalstudiesonrecombinantdomainsofmac-2-bindingprotein,”thejournalofbiologicalchemistry277：15690-15696(2002)；sasakietal.，“mac-2bindingproteinisacell-adhesiveproteinoftheextracellularmatrixwhichself-assemblesintoring-likestructuresandbindsbetalintegrins，collagensandfibronectin，”theembojournal17：1606-1613(1998)，这些文献的全部内容在此参考并入)。有趣的是，脂质组学分析显示，与exo-s和exo-l相比，外泌颗粒含有更少的脂质。磷脂和sm是细胞质脂质双层膜的主要结构成分(vanmeeretal.，“membranelipids：wheretheyareandhowtheybehave，”natrevmolcellbiol9：112-124(2008)，其全部内容在此参考并入)，它们在所有检查的纳米颗粒中都排在前列。由于exo-s/l子集具有囊泡膜结构，因此该观察对于其是可预期的，但是，外泌颗粒似乎缺乏外部膜结构。然而，可以通过几种脂质类别上的差异来将外泌颗粒与exo-s和exo-l区别开来。例如，发现与外泌体亚群相比，外泌颗粒含有更高水平的甘油三酯和神经酰胺，因此可能有助于将这些代谢物转运至受体细胞。该研究进一步揭示外泌颗粒和外泌体中的dna包装随肿瘤类型而变化，而包装在exo-s和exo-l中的rna与肿瘤类别无关。总的来说，这些发现表明蛋白质、聚糖、脂质和核酸被选择性地包装在外泌颗粒、exo-s和exo-l中，进一步支持了这些是不同的纳米颗粒子集的观点。关于纳米颗粒亚型具有不同器官生物分布式样的观察表明，它们介导癌症的多效性(pleiotropic)作用。exo-l摄取的点状模式及其对淋巴结的明显向性提示该纳米颗粒促进了已扩散肿瘤细胞的转移。外泌颗粒连同外泌体一起被包括肝脏、脾脏和骨髓在内的造血器官摄取。有趣的是，肝脏对外泌颗粒的主导性吸收以及参与代谢的蛋白质负载物在外泌颗粒中的富集，使我们推测外泌颗粒可能在肿瘤发展过程中特异性地靶向肝脏进行代谢重编程(reprogramming)。数据表明，纳米颗粒除了其特定的负载物外，它的大小也可能影响癌症的转移模式和全身作用。外泌颗粒的鉴定凸显了细胞分泌的ev和颗粒的多样性。阐明它们的生物发生对于揭示它们在细胞和器官功能中的作用至关重要。需要进一步描绘器官中各纳米颗粒子集的靶细胞和所产生的功能性后果，以深化对纳米颗粒在转移过程中的集合性、系统性作用的了解。无疑，这些发现将为ev和颗粒在诊断、预后和治疗应用中的转化研究开辟道路。实施例8-12的材料和方法从细胞培养物中制备小细胞外囊泡(sev)。为了分离不同的细胞纳米颗粒，例如外泌颗粒和外泌体子集，研究了使用duc作为af4的输入样品来分离sev。替代方法，例如dgf、uf和sec，也可以用于sev输入采样。如果抗体可以从ev移除的话，那么也可以应用通过iac捕获ev。已经使用来源于细胞培养模型系统的sev对这个方法进行了开发和优化。依次旋转条件培养基以去除细胞、细胞碎片和大ev，最后沉淀出sev。本文已经报道，新鲜的与冷冻的sev样品在af4曲线上没有显著差异，表明在冻融过程中很好地保留了ev的结构完整性。值得注意的是，培养条件(例如在低氧条件下生长细胞)以及细胞的传代会影响ev的产生和组成(即样品中各颗粒类型的百分比)。因此，enp组成的这些变化可能需要对af4方法进行修改，以便进一步优化以获得所需的分离质量。如下文所述，该方法还可应用于由其他来源(例如体液，包括血浆)制备的sev。可以进一步调整af4参数，例如错流梯度，以满足特定样品的特定要求(例如，存在其他类型的enp)。但是，对于某些样品类型，ev的组成要比来源于细胞培养物的条件培养基的ev组成更复杂。举例来说，血浆中脂蛋白颗粒的存在可能会干扰外泌体的分离，因为它们的大小部分重叠。在这种情况下，需要其他能够先将脂蛋白从血浆样品中去除的方法，然后再将它们上样到af4通道上。sev的af4分馏和在线数据收集和分析。从细胞培养物来源的sev中分离出外泌颗粒和外泌体子集(即，exo-s和exo-l)的af4操作方法如图21所示。根据ev样品的复杂性和各个具体研究的目标，可以进一步调整这种运行方法，如下所述。为了实时监测和分析颗粒的分馏，通常在紧邻af4通道的下游安装几个在线检测器。实验室具有在检测器12(100°)的位置安装有qels(dls检测器)的dawnheleos-ii(mals检测器)(wyatttechnology)，以及就位的agilent1260infinity多波长检测器(设置为280nm，用于uv吸收检测)。dls测量主要用于实时确定分馏颗粒的流体动力学大小。来自dls测量的原始数据是自相关函数，该函数绘制了分子的散射光强度随时间变化的平均总体变化(请参见图22中的示例)。自相关函数的指数衰减率基于以下等式确定溶液中分子的平移扩散系数(dt)：自相关函数g(τ)＝1+βexp(-2dtq2τ)τ-延迟时间q＝(4πη0)/sin(θ/2)β-相关函数的截距η0为溶液的折射指数q-散射因子λ0为激光波长θ为散射角度根据斯托克斯-爱因斯坦关系，可以从dt进一步推导出有效流体动力半径(rh)。该计算的假设是溶质(在当前情况下为ev)是一个进行布朗运动的球体。rh是具有与分析的溶质相同的平移扩散系数的球体的半径。rh仅取决于溶质的物理尺寸及其与尺寸相关的行为，例如扩散和粘度，但不受其密度或分子量的影响。0.5nm至1000nm半径的测量范围使dls成为测量sev大小的有效工具。将af4与在线dls测量相结合对于准确确定大小至关重要。在多分散(polydisperse)样品中，dls测量得出了平均rh值，并且缺少给定样品中有关各组成物种的特定信息。然而，分馏导致分离出具有不同大小的溶质，并且各馏分仅包含非常少量的不同rh颗粒的混合物。因此，分馏允许更精确地测量各个物种的大小。对于这种单分散样品，所得的自相关函数是单指数的，其易于阐释。在astra软件中使用cumulants模型将数据拟合为单指数函数(wyatttechnologycorporation.dynamicsuser’sguide.版本7.0(m1400rev.i)附录a-2(2010)，其全部内容在此参考并入)。通过检查对单个指数的理想拟合，可以进一步评估分离质量。dls准确测量rh的一个要求是样品浓度必须足够，以使样品散射的光量至少是多于溶剂的三倍，以获得可接受的信噪比。特别地，小分子，例如外泌颗粒，散射的光更少，并且需要更高浓度的分析物才能优化结果。除了dls之外，由mals检测到的静态光散射(sls)还可测量回转半径(rg)。rg定义为分子中各个点距其重心的质量平均距离，通常不同于rh。将rg与rh进行比较可以进一步揭示溶质的致密性(即，空颗粒和填充颗粒的比较)。通常，mals检测器比dls监测更灵敏，因此，当仅有少量材料可用于分析时，它将具有特殊用途。uv检测器可用作用于在线浓度测量的仪器的一部分。虽然没有为ev样品混合物中的不同物种定义消光系数，但是uv吸收强度可以为我们提供样品中不同物种的相对丰度的近似值。紫外线吸收峰可用于指导选择组合相似颗粒的组分。但是，二辛可宁酸测定(bca测定)和nta通常以定量为目的在收集馏分后进行。一旦获得了纯的ev并且可以进行进一步的表征，就可以确定各物种的消光系数，以更好地阐释相对于浓度的uv吸收数据。在线检测器的一个关键考虑因素是，由于在各单时间点通过检测器的材料的量是有限的，因此它必须具有出色的灵敏度。除上述检测器外，其他探测器(例如示差折射率(dri)和荧光检测器(fld))通常作为各种大分子表征技术的仪器标准部件。dri被认为是一种通用的浓度检测器，在所有类型的溶剂中都是准确而通用的，并且与生色团或荧光团无关。如果在ev的特定子集中存在自荧光分子或人工荧光标记，则fld是非常有用的。应当注意的是，在在线组装其他检测器的情况下，分馏后的颗粒需要更长的路径和更多的时间来到达馏分收集器。结果，分子的扩散将导致峰变宽、分馏样品的稀释和分离分辨率的降低。因此，仅应安装对实时监测至关重要的检测器。馏分的收集、浓缩和表征。af4馏分可以自动或手动收集，用于下游的离线表征。已经安装了安捷伦馏分收集器(1260系列)以自动将馏分收集到96孔板中，但是也可以使用类似的馏分收集器进行准确且可重现的馏分收集。可以根据体积或随时间收集馏分，并且可以将基于在线和离线表征具有相同身份的颗粒馏分进一步合并在一起，用于下游分析。举例来说，如前所述，为了鉴定外泌颗粒和外泌体的不同子集，首先通过在线dls和离线透射电子显微镜分析检查在整个分馏时程中的代表性馏分，然后将具有相似尺寸和形态的颗粒馏分合并在一起以进一步表征。此步骤还受uv吸收峰(指示各类颗粒中含量最高的馏分)的引导。为了验证合并的馏分是相对较纯的，并且没有被其他类型的相邻颗粒显著污染，仅将以峰为中心围绕的馏分合并在一起。根据分馏的分辨率，可以凭经验确定该馏分组合步骤。鉴于给定样品中ev亚群的组成不同，有时无法识别uv峰，因此馏分组合将更多地依赖于其他性能，例如大小和形态。单独的或组合的馏分可以直接用于下游分析或在进一步表征之前进行浓缩步骤。通常使用带有ultracel-30(截断值为30kda)膜(millipore)的amiconultra系列离心过滤器对浓缩的馏分进行浓缩。根据下游分析的需要，可以采用其他替代的浓缩方法，例如切向过滤离心法、直接uf、uc或iac。可对分馏的ev执行多种分析，包括但不限于：bca测定、nta、原子力显微镜、电子显微镜、分子含量(例如蛋白质，脂质，聚糖和代谢物)的质谱分析、蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定、遗传物质(dna和rna)测序、批处理模式的dls测量和ζ电位测量。分馏的ev亚群的功能作用可以在体外或体内进一步研究。试剂。·b16-f10细胞系(atcc)。应定期检查细胞系，以确保它们是正确的且无支原体污染。·dmem(vwr，目录号45000-304)·优质胎牛血清(fbs)(vwr，目录号97068-085)·l-谷氨酰胺，100x(corning，目录号25-005-ci)·青霉素-链霉素溶液，50x(corning，目录号30-001-ci)·无菌pbs(vwr，目录号45000-446)·tryple(thermofisherscientific，目录号12604-039p)·piercebca蛋白测定试剂盒(thermofisherscientific，目录号23225)·atcc通用支原体检测试剂盒(atcc，目录号30-1012k)·牛血清白蛋白(bsa)(sigma，目录号a1900)·用milliq系统过滤后的水·乙醇(sigma，目录号459828)·contrad70(deconlabs公司目录编号1003)·十二烷基硫酸钠(sds)(omnipur，目录号7910)·硝酸(fisherscientific，目录号7697-37-2)耗材。·150x25mm带栅格组织培养皿(vwr，目录号25383-103)·5/10/25ml血清移液器(vwr，目录号82050-478/82050-482/82051-182)·一次性枪头(denville，目录号p1096-fr/p1121/p1122/p1126)·500mlsupormachvpes过滤器(vwr，目录号73520-984)·15ml/50ml锥形管(vwr，目录号82050-276/82050-346)·1.7ml微量离心管(vwr，目录号53550-698)·96孔板(vwr，目录号62406-081)·蓝色螺帽(agilent，目录号5182-0717)·螺帽小瓶(agilent，目录号5182-0714)·样品瓶插入件，250ul拉点玻璃(agilent，目录号5183-2085)·96孔板，1.0ml，聚丙烯(agilent，目录号8010-0534)·密封胶带，透明聚烯烃(thermofisherscientific，目录号232701)·超速离心管(beckmancoulter，目录号355628)·带ultracel-30膜的amiconultra-15离心过滤器(millipore，目录号ufc903024)·带ultracel-30膜的amiconultra-4离心过滤器(millipore，目录号ufc803024)·milliporereg.纤维素膜10kdsc(wyatttechnology，目录号4057)·nadir聚醚砜膜10kdsc(wyatttechnology，目录号1903)·在线滤膜0.1μm(wyatttechnology，目录号1871)·干擦拭纸(kimtech，目录号7552)·2l玻璃瓶(vwr，目录号10754-822)·血细胞计数器(weberscientific，目录号3048-12)设备。·labconco净化器ii类生物安全柜·组织培养温育箱·evosfl显微镜(thermofisherscientific)·optimaxpn-100超速离心机(beckmancoulter，目录号a94469)·45型钛转子，固定角，钛(beckmancoulter，目录号41103909)·台式heraeusmultifugex3r离心机系列(thermofisherscientific，目录号75004501)·微量离心机(eppendorf，5424r)·accuscangouv/vis微孔板分光光度计(fisherscientific，目录号14-377-579)·milliq系统(millipore)·4℃冰箱(thermofisherscientific)·-20℃c冰箱(thermofisherscientific)·-80℃冰箱(thermofisherscientific)·37℃温育器(thermofisherscientific)·高压釜(tuttnauer)·洗碗机(steelco)af4仪器部件。·agilent1260infinity分析型和制备级馏分收集器(g1364c)·agilent1290温控器(g1330b)·agilent1260infinity标准自动进样器(g1329b)·agilent1260infinity多波长检测器(g1365d)·agilent1260infinity等度泵(g1310b)·gastorrtg-14hplc真空脱气机·在检测器12(100°)处安装了qels的wyatttechnologydawnheleos-ii·wyatttechnologyeclipseaf4·wyatttechnology短通道·装有chemstation和astra6软件的计算机软件。·与eclipse模块(wyatttechnology)集成的chemstation(agilenttechnologies)用于操作af4流程·用于mals、dls和uv数据采集和分析的astra6(wyatttechnology)试剂设置。·b16-f10细胞培养基向500ml的dmem中补充10％(体积/体积)的fbs(外泌体耗尽的)、50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素和2mml-谷氨酰胺，并在4℃下储存长达一个月。·外泌体耗尽的fbsfbs通过以100,000g超速离心90分钟来耗尽外泌体，并用0.22μm的过滤器进行灭菌。外泌体耗尽的fbs的等分试样可以在-20℃下长期保存。为避免污染，首先需要用70％乙醇擦拭转子，然后对所有超速离心管进行高压灭菌。整个fbs处理过程应在用于组织培养的生物安全柜中进行。·20％(体积/体积)乙醇。使用milliq过滤水稀释乙醇。最终溶液新鲜配制，并用0.22μm的过滤器过滤。·0.5mg/mlbsa溶液。将bsa粉末以0.5mg/ml的浓度溶于pbs中，并将等分试样长期储存在-20℃下。·1％(体积/体积)contrad70。用milliq水将contrad70稀释至终浓度为1％(体积/体积)，并在室温(rt，～22℃)下长期保存。·10％(重量/体积)sds。将sds粉末以10％(重量/体积)的浓度溶于milliq水中(即10g/100ml)，并在室温下长期保存。该化学物质具有腐蚀性和毒性，可引起严重的皮肤和眼睛刺激。戴好防护手套、口罩、眼罩、面罩和防护服进行操作。·10％(体积/体积)硝酸。用milliq水将硝酸稀释至终浓度为10％(体积/体积)，并在室温下长期保存。该化学物质具有高度腐蚀性，可引起严重的眼睛和皮肤灼伤，严重的呼吸道和消化道灼伤。穿戴适当的防护设备(手套、眼罩、面罩、防护服、呼吸器)，并戴化学防护罩进行操作。应按照州和当地的危险废物法规将废物视为危险废物。仪器设置。在使用前，af4仪器的所有部件应由制造商(agilent和wyatttechnology)安装、配置、校准和认证。从细胞培养物的条件培养基制备sev。b16-f10鼠黑色素瘤在该方案中用作模型系统。图21示出了概括整个过程的关键步骤和af4的流动路线的示意性流程图。1.将每个p150组织培养板上接种含2.25x106个b16-f10细胞的25ml补充有外泌体耗尽的fbs的dmem完全培养基中，总共接种12个板。应定期检查细胞系，以确保它们是正确的且无支原体污染。b16-f10细胞的传代次数会影响sev的组成，这反映在sev的不同子集的相对丰度的变化上(7)。因此，避免使用传代数相差很大的b16-f10细胞比较实验数据。2.在标准条件下(5％co2，37℃)下，将细胞在潮湿的组织培养箱中放置72小时。细胞培养物应刚好达到汇合(confluence)而无细胞死亡和任何异常表型变化。应允许细胞达到汇合以获得最高的sev产量，但收获时间时不应有明显细胞死亡和应激表型，以确保sev的纯度。3.将条件培养基收集到50ml锥形管中，并在台式离心机中于10℃以500xg离心10分钟。上清液可以在台式离心机中在10℃下以3000xg旋转20分钟，然后转移到新试管中，并置于-80℃进行长期保存。4.将上清液转移至超速离心管(6x50ml/管)中，并在45-ti型超速离心转子(预冷至4℃)中于10℃以12,000xg离心20分钟。对于超速离心，需要使穿过旋转中心的一对相对的管互相平衡。每个试管的装样量不要超过50ml，以免样品溢出。不使用时，转子应保持在4℃。5.将上清液转移至新的超速离心管中，并在同一转子中于10℃以100,000xg离心70分钟。在各超速离心步骤结束时，请确保立即转移上清液，以避免沉淀物松散，以及污染上清液或损失沉淀样品。6.弃去上清液，将沉淀物轻轻重悬于一毫升冰冷的pbs中。避免引入气泡。将所有样品合并到一个超速离心管中，并用pbs将最终体积调至50ml。7.在10℃以100,000xg的速度再离心70分钟。将最终沉淀物重悬于约0.5mlpbs中，并转移至冰上的1.7ml微量离心管中(af4馏分的sev样品在下一节中)。沉淀有时可能难以破碎并重新悬浮成均匀的悬浮液。如果是这样，可以将样品在冰上再放置15到30分钟，或者可以将额外体积的pbs添加到样品中。然后轻轻用移液管上下吹打以重悬样品，并转移到eppendorf管中进行定量。避免引入气泡。8.通过使用piercebca蛋白质检测试剂盒测量蛋白质浓度来定量sev的产量。按照制造商的说明将样品或试剂盒提供的bsa标准品与试剂混合在96孔板上，并在37℃下孵育30分钟。使用accuscangouv/vis微孔板分光光度计读取562nm处的吸光度，并根据所含的bsa标准品计算样品浓度。9.样品可立即用于af4分馏，或放在冰上过夜，第二天再进行处理。样品可在-80℃下冷冻以长期保存。sev的af4分馏。组装af4通道10.在组装af4通道之前，应先选择膜类型和截断值大小(例如，截断值大小为10kda的rc膜)以及具有所需厚度(即通道高度，优选490μm)的垫片。11.用milliq水冲洗所有零件，并按顶板、垫片、隔膜和底板的顺序安装，并装好玻璃板(frit)/o形圈。使用扭矩扳手依次施加5nm和7.5nm扭矩来将零件用螺栓固定在一起。由于样品标本放置在非常靠近膜的通道层中，因此很重要的一点是，膜应光滑且无褶皱。在组装过程中，请戴好手套并不要使膜弯曲。由于乙醇会引起“膜膨胀”现象并降低分馏的有效通道高度，因此请避免将膜暴露于乙醇中。至关重要的是，通道必须紧密密封，并且其在整个通道上的高度必须精确和均匀的。要组装af4通道，应使用计量扳手(例如扭矩扳手)精确地施加力。一个好的做法是先拧紧中间的两个螺栓，然后再拧紧对角上的两个螺栓。12.将管道连接到入口、错流和进样口，但不连接出口。开始以1ml/min的通道流速使水(编写流速设置并使用chemstation操作)通过系统至少30分钟，并且首先使通道中的空气从出口排出。然后将管道从出口连接到检测器。在通道中不应观察到气泡。该仪器可在夜间冲洗模式下以0.2ml/min的恒定通道流量通宵运行，多至几天。对于短期存储，请保持系统在“夜间冲洗”模式下运行。请勿将系统长时间放置在水性溶剂中。为了长期保存，请从通道上拆下膜并将系统保持在20％的乙醇中。保持从通道到检测器和馏分收集器的管道尽可能短，以减少峰展宽和样品稀释效应以及避免降低分离分辨率。平衡并用bsa涂盖膜将水性溶剂更改为pbs，并以1ml/min的通道流量运行至少30分钟至1小时。该仪器可在夜间冲洗模式下以0.2ml/min的恒定通道流量过夜运行。如果系统已经在乙醇或异丙醇中保持，则应先用水彻底冲洗，然后再转换为pbs。将pbs与酒精混合会导致盐沉淀。13.将30至40μg的bsa(0.5mg/ml)加载到af4上，并使用除洗脱步骤外与sev分离相同的af4方法运行样品，取代以对于bsa以3ml/min的恒定错流持续15分钟。通过再运行bsa1-2次来重复此操作。膜涂盖之后，仪器可以在夜间冲洗模式下过夜操作，多至几天。该步骤的目的是阻止样品与膜的非特异性结合。如果有多余的样品，则也可以将要分析的样品用于该封闭步骤。仅在安装新膜时才需要执行此步骤。一天结束后，在处理完所有样品后，将dawnheleosii检测器的comet打开约30分钟，以清洁流通池。sev的af4分馏。14.仪器初始化：(a)打开chenstation并按表15所述加载af4运行方法(运行方法已经被编程、编辑并保存在chenstation的“方法”模块中)。表15(b)将自动进样器和馏分收集器的恒温器均设置在4℃；在样品分析之前的至少30分钟打开mwd检测器的紫外灯(280nm)；打开dawnheleosii的激光器(664nm)。(c)打开馏分收集器并选择收集模式(基于体积或时间间隔)；安装用于收集馏分的96孔板(确保板是根据馏分收集器的配置安装的)。基于0.5分钟的时间间隔收集馏分，因此从一个样品中收集馏分需要两块板)。除了使用仪器的前端控制面板打开dawnheleosii的激光器外，所有操作都应使用chemstation软件完成。15.打开astra6并启动一个新的实验文件夹以进行数据收集：(a)对于配置，选择“pbs，水性”作为系统溶剂；指定uv波长为280nm”并启用“波段扩展(bandboardening)”选项；对于heleos，启用“波段扩展”和“温度控制”选项；对于qels，选择“使用qels抖动”。(b)对于程序：指定mals数据收集的时间间隔为1秒，以及qels间隔为2秒；将数据收集的持续时间设置为60分钟；选择“自动注入时触发”；(c)单击“运行”按钮，一旦被自动进样器的信号触发，将自动开始数据收集。16.通过用pbs将步骤9中分离的sev的浓度调整为1μg/μl，来制备af4输入样品。在加载到af4之前，在4℃下以12,000xg旋转5分钟以除去不溶的聚集物。17.将上清液转移到预冷的旋盖玻璃小瓶中(如果样品的总体积较小，则可使用250ul拉点玻璃小瓶插入件)，并将其放在自动进样器平台的指定位置上，自动进样器被设置为从所述指定的位置自动拾取样品。在将样品加载到af4之前对其进行预旋转对于避免分析高速超速离心过程中形成的聚集物是至关重要的。18.在chemstation的自动进样器模块中，指定要分析的样品体积(40到100μl；即1μg/μl时为40至100μg)，然后单击“单一样品”以开始分馏、实时数据收集(mals、dls和uv吸收)和馏分收集(按0.5ml的时间片(slice))。初步研究确定范围为40至100μg的b16-f10sev适用于已经开发的当前af4运行方法。由于特定样品的成分复杂性，可以对其进行进一步调整。避免气泡进入系统至关重要。确保没有气泡滞留在样品瓶中，并且样品瓶中的样品体积大于要分析的体积。19.在样品运行期间，请在“wyatteclipse状态”面板中检查实际流速，并确保它们与设定的流速足够接近。如果实际流量与设定流量有很大差异，则流量控制出现了问题并且需要制造商进行维修/保养以确保分馏质量。在分馏过程中，保持通道流速(检测器流速)的恒定至关重要。流速的变化可能会导致监视器检测到伪影信号。20.分馏完成后，将96孔板从馏分收集器中取出，并用胶带密封。将板放在冰上或在4℃下用于下一步操作。21.单击“重置馏分收集器”，以便将馏分收集的起始位置重置为其原始位置。否则，仪器将从上一个样品的最后一个馏分位置继续下一个样品的馏分收集。)22.继续进行下文所述的“在线数据分析”以评估分馏质量。23.继续执行下文所述的“馏分离线表征”或开始分馏下一个样品(首先安装新的96孔馏分收集板，然后通过重复步骤16-23开始分馏下一个样品)。如果需要分析多个样品，但不需要收集分离的馏分，则可以运行“序列”(被编程为按顺序运行的一系列方法和样品)而非单个样品的方法。用户可以参考制造商的手册以了解详细信息。24.好的操作包括在同一天使用对样品进行的af4运行方法相同的af4运行方法运行pbs空白对照(或用于分析样品的其他类型的运行缓冲液)。这种空白对照可以帮助评估仪器的性能，例如背景噪音水平，并识别可能会影响样品分析的系统性问题。25.在一天分析完所有样品后，打开dawnheleosii的comet约30分钟，然后关闭激光、紫外灯、恒温器和馏分收集器。将水性溶剂更改为水，并在“夜间漂洗”模式下运行过夜或至几天。有关长期存储，请参阅步骤12。在线数据分析。使用astra6执行在线数据分析。首先，选择要分析的实验，然后(a)调整基线：首先为从ls11(90°)检测器收集到的mals信号设置基线，然后将其应用于所有其他检测器。确保检查单个检测器以确保基线设置正确。(b)选择要分析的峰区域：可以选择一个或多个区域同时进行分析。(c)通过检查代表性馏分的自相关函数与单指数模型的拟合来检查分馏质量。r2越接近1，分离的纯度越好。26.打开一个新的easigraph窗口，并绘制流体动力学半径(rh)，qels(dls)和uv信号与时间的关系图。使用上述方程式仅从dls信号推导出颗粒的流体动力学半径(rh)。流体动力半径(rh)图显示了在各个时间点洗脱的颗粒的大小。uv信号强度可以揭示不同尺寸颗粒的相对丰度。根据这些图(以及潜在的离线表征)，可以判断af4分离质量和样品组成(即不同尺寸颗粒的相对丰度)。根据需要，也可以通过选择不同的轴显示于easigraph中来绘制其他类型的分析图。除在线uv检测外，其他定量方法(例如bca测定和nta分析)也可用于测量馏分的浓度。样品浓度应高到足以散射足够的光以进行准确的rh测定，对于小尺寸的颗粒更是如此，因为它们散射的光要少得多。用于离线表征的馏分的收集和浓缩。27.根据要进行的表征，可以直接检查各个馏分或在检查之前进一步浓缩。可以将具有相似性能(尤其是来自相同峰区域)的相邻馏分合并并浓缩以进行下游分析。如果下游表征需要大量的材料，则可以按照相同的步骤进行相同sev样品的多次运行，并且可以合并各次运行中的相似馏分。28.在以下步骤中，使用带有ultracel-30膜(截断值为30kda)的millipore离心过滤器柱对单个馏分或合并的馏分进行浓缩。(a)过滤器柱首先通过添加5ml(用于ultra-4过滤器柱)或15ml(用于ultra-15过滤器柱)的冰冷pbs进行预漂洗，然后在4℃下以3700xg旋转5分钟。丢弃流经液和残留在顶部过滤器柱中的液体。(b)然后将合并的分馏样品转移至顶部过滤器柱中，并在4℃下以3700xg旋转7-8分钟。浓缩的样品保留在顶部过滤器柱中，缓冲液收集在收集管的底部(流通液)。丢弃流经液。(c)重复步骤31(b)，直至各样品浓缩至所需的体积。对于各样品，可以重复对同一过滤器柱加载和旋转以浓缩样品。(d)将浓缩的样品转移到冰上的1.7ml微量离心管中。记录体积并取一等分式样用于bca测定以确定蛋白质浓度。(e)浓缩后的样品可以在冰上短期保存(至2到3天)，或在-80℃冷冻以长期保存。可以对这些浓缩的分馏样品进行下游分子表征和功能研究。对于首次使用af4分析的未知样品，在将馏分汇集在一起以进行进一步分析之前，首先要通过tem检查代表性单个馏分的形态。af4可能会同时洗脱出具有相同流体动力学尺寸但形态不同的颗粒。应探索与af4结合的其他能根据这些颗粒的不同生物物理/生化性能(例如密度，表面分子表达和电荷)分离这些颗粒的方法，以进行进一步分馏。根据代表性馏分的流体动力学尺寸、形态和纯度将馏分合并在一起。如果没有实现两个相邻的不同颗粒群体的基线分离，请避免收集两个群体的峰之间的“低谷”中的这些馏分进行进一步表征。故障排除。表16.故障排除表。表16时间i.步骤1-9，细胞培养和sev分离：～3天。ii.步骤10-12，af4通道组装：～1小时。步骤13-14，平衡并用bsa涂覆膜：2～3小时。(仅当安装了新的膜时才需要执行步骤10-14。)步骤15-26，sev的af4分馏：每个样品1-2小时。iii.步骤27-28，在线数据分析：每个样本约20分钟。iv.步骤29-30，馏分收集和浓缩用于进行离线表征：1-2小时。实施例8-错流根据af4理论，错流是抵消颗粒的布朗运动的驱动力，以在稳态下在不同的通道流层板上分辨具有不同流体动力学尺寸的颗粒。因此，错流是af4分馏质量的决定性因素。为了确定外泌体分馏的最佳错流，评估了各种错流设置。如图16所示，从代表性的错流设置中设计出外泌体的分馏曲线(uv吸收和dls的分馏图)。具体来说，检查了具有不同起始流速(0.3、0.5和1.0ml/min)和斜率(即，错流有多快下降到0ml/min；测试条件：流速在15、30和45分钟内从0.5降低到0ml/min)的错流的线性梯度。当错流在45分钟内从0.5ml/min降至0ml/min时，观察到三个主峰(p2、p3和p4)。如前所述，这些峰分别代表外泌颗粒和两个外泌体子集(即小外泌体[exo-s]和大外泌体[exo-l])(图16a)。在其他峰中，p0是空峰，它是由于从聚焦/注入模式切换到洗脱模式时的流动扰动而产生的。p1是一个很小的峰，由空峰和小于外泌颗粒的物质的洗脱产生。根据enp的制备方法，p1有时几乎未被检测到。当p5降低至～0.08ml/min以下时，由于失去了对流速的控制而生成了p5，并且所有保留的样品组分(较大的微粒和/或小颗粒的聚集体)被洗脱了出来。如图16b所示，当初始错流速率升高到1.0ml/min时，没有观察到其他肩峰与峰p2-p4进一步分离，表明这三个颗粒群的均匀性。观察到所有三个峰的洗脱都有延迟。此外，观察到了更高的p5峰，这是由于在给定时间内并基于通道大小，没有足够的时间洗脱出包括exo-l在内的大颗粒。相比之下，当初始错流流速设置为0.3ml/min时，样品洗脱的更早，表明该流速没有快到足以将样品成分保留在通道内并有效地分辨它们。因此，在整个过程中使用初始错流流速0.5ml/min。接下来，评估了错流梯度的不同斜率对分离质量的影响。比较了在15、30和45分钟内，错流速率从0.5到0ml/min的线性下降。显然，当使用较短的时间跨度时，峰变窄并且分离质量受到损害(图16c)。另外，当使用较短的时间跨度时，观察到了较大的p5峰，表明洗脱大颗粒的时间不足。相反，当使用更长的时间跨度时，峰变宽但分离质量提高。当需要回收离散馏分中的高纯度颗粒以进行进一步的离线表征时，需要使用此设置。但是，当使用更长的时间跨度时，必须考虑其他实际问题，例如样品的稀释和在线检测器的灵敏度极限(用于精确测量)。因此，其目的是分离外泌体的不同子集(＜150nm)，当应用45分钟的时间间隔(更长的时间间隔未进行测试)时，这些子集明显各自分开。本研究选择错流的线性梯度用45分钟从0.5降低至0ml/min。实施例9-通道高度基于af4的工作原理，通道的几何形状(包括宽度、高度和形状)对于分馏质量至关重要。本研究中使用的短通道是wyatttechnology(santabarbara，usa)的产品，该产品具有梯形几何形状(&antonietti，“field-flowfractionationtechniquesforpolymerandcolloidanalysis，”adv.polym.sci.150：67-187(2000)；litzen&wahlund，“zonebroadeninganddilutioninrectangularandtrapezoidalasymmetricalflowfield-flowfractionationchannels，”analyticalchemistry63：1001-1007(1991)，这些文献的全部内容在此参考并入)，同时尖端(tip)到尖端的长度为152mm，通道宽度从21.5mm(靠近进样口，距入口尖端约12mm)线性减小到3mm。在形状和宽度已经优化和固定的情况下，高度(即通道的厚度，由上壁和底部积累(accumulation)膜之间所使用的垫片确定)是唯一可用于进一步优化的参数。制造商提供了一系列具有不同厚度(190、250、350和490μm)的垫片。通道高度影响抛物线性层流流率曲线，从而影响分离分辨率。它还会影响通道容量，较厚的通道允许分析更大的样品量。由于需要回收足够的样品用于下游分析，因此上样量是分馏的重要因素，所以考虑仅使用厚度为350μm和490μm的垫片。如图17所示，与具有490μm垫片的通道相比，具有350μm垫片的通道洗脱样品的时间更早，但具有更窄的峰和降低的分离分辨率。因此，选择490μm垫片进行这项工作。实施例10-聚焦在仪器中使用100μl样品环进行样品加载。它是总通道容量的很大一部分，总通道容量通常为200μl至1000μl。一旦注入通道中，样品将在整个通道中扩散并导致分馏不足。为避免这种情况，从出口引入了与通道正向流动相反的流动，并与通道流动一起将样品聚焦到靠近进样口的窄带中(即聚焦模式)。首先，建立聚焦流，然后以聚焦模式注入样品，并在洗脱前给予足够的时间达到稳态平衡。聚焦流速和聚焦时间决定聚焦效率。此处，聚焦流速固定为0.5ml/min，与洗脱的初始错流速率相同，然后测试了不同时间段(2、5和10分钟)的聚焦效率。如图18所示，不同的聚焦时间不会显著影响峰形或分辨力。此外，在发生外泌颗粒洗脱之前，uv和dls的分馏图具有相似的基线。值得注意的是，观察到p5信号强度随聚焦时间的增加而增加，表明了由延长聚焦引起的潜在颗粒聚集。因此，为研究选择了2分钟的聚焦时间。实施例11-膜的选择由于样品分馏是在靠近膜的地方进行的，因此除了膜的孔径之外，还需要考虑膜材料与样品的相容性。举例来说，样品可能与膜非特异性结合。测试了再生纤维素(rc)膜和聚醚砜(pes)膜的外泌体分馏，这是两种通常用于生物材料浓缩或过滤的不同类型的膜。在保持其他af4参数完全相同的同时，与rc相比，在具有pes的通道中观察到了样品洗脱的延迟和更宽峰，表明样品和膜之间可能存在非特异性相互作用(图19)。因此，选择rc膜进行研究。实施例12-输入样品的量一旦确定了关键的分馏参数，随后检查af4的上样能力。af4所需的最低材料量主要由在线检测器(例如dls和uv监测器)的灵敏度极限确定。信噪比必须足以进行准确的数据收集和阐释。最大材料量由所需的分馏分辨率决定，所需的分馏分辨率取决于实验的目的和待分析样品的复杂性。为了有效地将本申请报道的外泌颗粒和两个外泌体子集和使用uc制备的小型ev进行分离，测试了不同量(范围为从15μg至165μg)的从b16-f10衍生的sev输入样品。如图20所示，15μg是用于该分析的材料下限，因为开始检测到高水平的噪音，尤其是在流体动力学大小的低端检测到高水平的噪音。40μg和100μg的输入产生几乎相同的分馏曲线和流体动力学大小测定结果，表明了相当的分馏分辨率和稳健的信号检测。但是，当输入量增加到165μg时，所有峰的洗脱明显延迟，导致exo-l洗脱不完全。峰之间的低谷处信号强度的增加表明，各颗粒群向邻近群的渗漏(bleed-through)增加(因此发生了较差的分离)。因此，本研究使用40μg至100μg的输入量。实施例8-12的讨论如以上评估所示，af4技术具有以高分辨率分离大尺寸范围内的纳米颗粒的独特能力。通过高度稳健且直接的af4手段，可以有效地分离出不同的外泌体亚群和外泌颗粒。这些发现表明af4在鉴定其他不同的ev亚群方面的潜在用途。当结合在线监测(例如，多角度光散射[mals]，dls，uv吸收和荧光检测)和离线分析(例如，显微镜观察，蛋白质、脂质、聚糖和代谢物的质谱分析，以及dna和rna测序)时，af4可以产生有关enp分析物的宝贵数据，包括颗粒形态和大小，相对丰度，分子组成，以及其他生物物理和生化性能。af4是一种功能强大的工具，可以帮助研究人员破译enp的复杂性和异质性，而其他现有技术则无法很好地解决这些问题。af4方法描述了从分离自b16-f10细胞和一组超过20种不同癌细胞系和5种正常细胞系的的条件培养基的sev中的外泌颗粒和外泌体子集的分馏。这种af4方法可用于分馏和表征从一系列体液(包括血浆或血清、淋巴液、骨髓血浆、脑脊液、尿液、唾液、支气管肺泡灌洗液、乳汁和羊水)中分离出的sev，因为它们具有相似的颗粒组成复杂度。由于所有细胞都能脱落ev，因此该方法可用于研究任何生物体的ev生物学。该方法不仅用于生物学发现，还可以被调整以用于基于外泌体的药物生产中的质量控制领域。外泌体已经成为了用于治疗癌症和其他类型疾病的很有吸引力的治疗性递送载体(batrakova&kim，“usingexosomessnaturally-equippednanocarriers，fordrugdelivery，”jcontrolrelease219：396-405(2015)，其全部内容在此参考并入)。当结合灵敏的分子测定时af4可以作为一种改进的分析工具，用于通过检测碎屑或聚集物来评估外泌体产物的纯度、药物负载效率和完整性。最后也是同样重要的，该方法可充当进一步开发和优化用于分馏和表征其他类型enp的方法的参考。af4的一些独特优势是其高分辨率和大的分馏尺寸范围，并且只需将设置编程到软件中，就可以轻松测试不同条件，例如错流设置和聚焦时间，而对通道的处理很少。除了用于分析外泌体和其他sev之外，还可以进一步开发用于大型ev(例如较大的微粒和癌小体)的分馏方案。在分馏大颗粒时应特别小心，因为它们可能太大而无法在普通模式下洗脱(当颗粒小且与通道高度相比被视为点质量时)，反而在空间模型中可以洗脱(图15)。此外，还可以将其他场(例如电场)应用于af4，以基于尺寸以外的其他生物物理性能对颗粒进行分层，从而允许af4技术的更广泛应用。综上所述，通过af4对不同ev亚群的分离和表征对于增进对ev的生物学及其在生理和病理条件下的功能作用的认识至关重要。通过分析ev的分子负载物，可以识别特征蛋白、脂质、聚糖和基因以及与疾病进展相关的特定信号通路，从而有助于鉴定潜在的诊断/预后生物标志物，包括与癌症有关的诊断/预后生物标志物。这些知识还将为在临床试验中开发基于enp的疗法提供理论依据。与其他方法的比较除af4外，还开发了多种技术来分离纯的外泌体和其他ev亚群。最常用的技术是使用duc，并根据其流体动力学大小和密度来分离颗粒。在不同离心力下连续离心可消除死细胞和细胞碎片(500xg，10分钟)，大的癌小体和凋亡小体(2000～3000xg，20分钟)和较大的微粒，随后沉淀sevs(100,000xg，70分钟)(théryetal.，“isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids，”currprotoccellbiolchapter3，unit3.22(2006)；jeppesenetal.，“comparativeanalysisofdiscreteexosomefractionsobtainedbydifferentialcentrifugation，”jextracellvesicles3：25011(2014)；cvjetkovicetal.，“theinfluenceofrotortypeandcentrifugationtimeontheyieldandpurityofextracellularvesicles，”jextracellvesicles3(2014)，其全部内容在此参考并入).离心转子的类型、离心力和离心时间是影响该方法产品收率和纯度的关键因素。其性能也因所研究的细胞类型而异(willmsetal.，“cellsreleasesubpopulationsofexosomeswithdistinctmolecularandbiologicalproperties,”scirep6：22519(2016)，其全部内容在此参考并入)。duc可以处理大体积和较大量的样品，但是回收的材料的纯度差。它只能将部分颗粒粗略地分成几类，例如大的囊泡、微粒和sev(富集外泌颗粒和外泌体)，且预期各组具有异质性和其他组的污染性。高离心力也可能导致样品聚集。通过本方法，通过首先对sev群体进行分层和浓缩，然后以更高的分辨率分析颗粒以进一步分馏外泌颗粒和外泌体子集的方式，利用了duc的优势。密度梯度浮选法(dgf)通常用于进一步纯化先用duc分离的sev。在dgf中，将ev覆盖在粘性溶液(通常使用蔗糖或碘克沙醇)的稀释度逐渐增加的梯度上，并且在离心后，它们迁移至由ev的大小、形状和密度决定的平衡密度。dgf通常用于从ev中去除非膜性颗粒，并且已用于一些研究中，以解决外泌体异质性问题(aalbertsetal.，“identificationofdistinctpopulationsofprostasomesthatdifferentiallyexpressprostatestemcellantigen，annexina1，andglipr2inhumans，”biolreprod86：82(2012)；bobrieetal.，“diversesubpopulationsofvesiclessecretedbydifferentintracellularmechanismsarepresentinexosomepreparationsobtainedbydifferentialultracentrifugation,”jextracellvesicles1(2012)；willmsetal.，“cellsreleasesubpopulationsofexosomeswithdistinctmolecularandbiologicalproperties,”scirep6：22519(2016)，这些文献的全部内容在此参考并入)。与af4的性能相比，dgf的主要缺点包括其耗时的准备工作、缺乏自动化、依赖于操作员的再现性以及低产量。与高浓度蔗糖的长时间孵育还会破坏ev的完整性，因此需要额外的清洗步骤以将其去除。相比之下，af4快速、全自动、高度可重现、稳健，且与许多模拟生理条件的缓冲液兼容。用af4进行的ev分馏的分辨率和大小范围远远优于用dgf进行的ev分馏(tauroetal.，“comparisonofultracentrifugation，densitygradientseparation，andimmunoaffinitycapturemethodsforisolatinghumancoloncancercelllinelim1863-derivedexosomes，”methods56：293-304(2012)，其全部内容在此参考并入)。sec，一种纳米颗粒分馏的温和手段，已被广泛用于生物化学和生物物理研究中的蛋白质和蛋白质复合物分析。近来，它已被用于分馏ev(moletal.，“higherfunctionalityofextracellularvesiclesisolatedusingsize-exclusionchromatographycomparedtoultracentrifugation，”nanomedicine13：2061-2065(2017)；nordinetal.，“ultrafiltrationwithsize-exclusionliquidchromatographyforhighyieldisolationofextracellularvesiclespreservingintactbiophysicalandfunctionalproperties,”nanomedicine11：879-883(2015)；etal.，“single-stepisolationofextracellularvesiclesbysize-exclusionchromatography，”jextracellvesicles3(2014)；willisetal.，“towardexosome-basedtherapeutics：isolation，heterogeneity，andfit-for-purposepotency,”frontcardiovascmed4：63(2017)，这些文献的全部内容在此参考并入)。在sec中，在填充有多孔聚合物珠粒(固定相)的柱子中根据颗粒的大小和形状分离颗粒。球形的较小尺寸的颗粒可以更容易地穿透多孔珠，需要更长的路径和更多的时间来洗脱，而较大的颗粒则无法穿透孔并且随后更快地洗脱。具有异常形状的颗粒的洗脱更加复杂，因为其穿过孔对颗粒具有潜在的空间干扰。与其他技术相比，sec的分辨率与af4最为相似。af4仍然在更宽的尺寸范围内显示出卓越的分辨率(fraunhoferetal.，“theuseofasymmetricalflowfield-flowfractionationinpharmaceuticsandbiopharmaceutics，”eurjpharmbiopharm58：369-383(2004)，其全部内容在此参考并入)。当颗粒接近或大于孔径上限时，sec的分辨率会下降。此外，sec在改变分离参数方面不如af4灵活，其分离的大小范围对于给定的具有特定孤立(solitary)相的色谱柱是固定的。此外，af4包含一个中空通道，仅在累积壁处有一个膜，但与sec不同的是，它不需要固定相。sec中的这种固定相会产生剪切应力并且能比af4产生更大的与分析物的非特异性结合的表面积。与af4方法类似，必须限制sec的输入样品上样量，并且样品容量存在上限，以折中足够的收率和示例性分馏质量之间的平衡。分离前通过duc进行的样品分层和浓缩方法极大地提高了sec的分离力。uf通过将样品过滤通过具有确定孔径(即，如通过分子量截断值反映)的一系列半透膜从而允许基于ev群的大小直接对它们进行分离(xuetal.，“highly-purifiedexosomesandshedmicrovesiclesisolatedfromthehumancoloncancercelllinelim1863bysequentialcentrifugalultrafiltrationarebiochemicallyandfunctionallydistinct，”methods87：11-25(2015)；xuetal.，“aprotocolforisolationandproteomiccharacterizationofdistinctextracellularvesiclesubtypesbysequentialcentrifugalultrafiltration，”methodsmolbiol1545：91-116(2017)，这些文献的全部内容在此参考并入)。截断值尺寸以下的较小颗粒可以穿透孔，而较大的被保留。由于膜孔径大小可用性的限制，uf提供了ev的粗分离。大多数ev不是刚性球体，而是柔性颗粒，并且可以变形以通过孔，特别是在施加压力时。另一个问题是膜孔径大小的均匀性，这对于分离纯度至关重要。尽管uf的分离能力不如af4，但uf可以充当对输入样品进行预分层和浓缩以进行af4进一步分析的一种手段。iac与主要通过ev的大小分离ev的方法不同，iac依赖于对ev表面分子(主要是蛋白质)的抗原识别。iac具有高选择性、快速以及出于制备或分析目的的灵活的规模化。此分离原理已适用于不同形式的分析和制备包括使用免疫磁珠沉淀、流动分析、微阵列检测、显微镜检查、western或elisa测定法以及微流体分离(théryetal.，“isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids，”currprotoccellbiolchapter3，unit3.22(2006)；chenetal.，“microfluidicisolationandtranscriptomeanalysisofserummicrovesicles,”labchip10：505-511(2010)；etal.，“extracellularvesicle(ev)array：microarraycapturingofexosomesandotherextracellularvesiclesformultiplexedphenotyping，”jextracellvesicles2(2013)；koetal.，“mirnaprofilingofmagneticnanopore-isolatedextracellularvesiclesforthediagnosisofpancreaticcancer，”cancerres.78：3688-3697(2018)，这些文献的全部内容在此参考并入)。iac的固有局限性是必须具备有关表面抗原的知识。另一个问题是，iac抗原可能呈现于大小和/或来源不同的多个ev亚群中。因此，af4的应用可能进一步需要基于尺寸的ev分离。iac捕获的ev非常适合分子内容表征，但不适用于进一步的功能研究，这要归因于效率低下的捕获抗体去除，这可能会干扰功能分析或受体细胞进行的靶向和摄取。相反，af4是无标签的，并使这些功能分析可行。实施所述方案所需的专业知识水平af4仪器是可商购的(例如，wyatttechnology)，并且制造商可以进行初始设置。针对特定样品分析的方法开发、仪器的日常维护和故障排除需要对af4和已安装检测器的工作原理有充分的了解，需要对af4通道和检测器的使用进行培训，并熟悉用于af4操作和数据收集的软件。色谱法和/或微流控技术方面的先前经验有助于掌握af4的应用。但是，一旦完成了af4分馏方法的培训，只需一点点技能(例如熟悉软件界面和正确的说明)即可完成分馏过程，因为几乎所有步骤都是自动和程序化的。局限性af4的一个固有局限性是它根据样品的大小对样品进行分馏。结果，具有相同流体动力学大小但具有不同形态、表面分子和其他生物物理性能的颗粒无法仅通过af4各自分开。但是，也可以将其他场(例如电场)与af4结合使用，以根据其他特性(例如粒子表面电荷)提供进一步的分离。当针对尺寸太大以至于相较于通道高度不能被视为点质量的大颗粒开发方案时，还需要特殊的考虑。这些大颗粒将以空间模式而非普通模式洗脱，如图1所示。第二个固有缺点是af4只能容纳少量样品(例如，在目前情况下为40μg至100μg)，这在更详细地评估纳米颗粒特性的过程中通常不能有效地进行大规模制备。相反，可以将样品分为多个分馏分析，以改善对特定纳米颗粒子集的表征。af4的第三个局限性是由于上样能力的局限，输入样品需要进行uc制备或以其他方式来在分馏之前先对分析物(即本研究中的sev)进行分层和浓缩。此外，必须指出，没有单一的公式可以普遍应用于不同类型样品的分析。必须根据目标样品的复杂度(即各个组分的大小和丰度)来开发和优化在以上方案开发部分中讨论的分馏方法和关键参数。在某些情况下，可能必须要按顺序组合不同的运行方法和仪器设置，以有效地分离复杂样品中的不同成分。本文已经描述了用于经由af4进行的最佳sev制备和分馏的详细方法。成功分离af4的关键步骤为：(i)从细胞培养物的条件培养基中制备sev；(ii)开发和优化af4运行方法；(iii)在线数据分析和馏分收集以进行离线表征。使用诸如uc的方法对sev进行预分层对于降低要分析的样品在颗粒组成方面的复杂性至关重要。这样就允许样本中存在的各sev亚群有足够的材料以通过一次af4运行来进行分析。否则，必须采用一系列af4方法来对不同尺寸范围内的颗粒进行最佳分离。成功进行af4分析和分馏的另一个关键因素是加载到af4系统上的输入样品量。系统上样过多将导致分辨率变差和纳米颗粒的分离效率低下；而样品的上样量过少将导致信号检测不良和数据推导不准确，如图19所示，已经讨论了用于af4运行方法优化的五个主要参数，包括错流、通道高度、聚焦时间、上样量和膜类型(参见图16-19)。b16-f10衍生的sev的代表性af4分馏曲线显示在图22中。基于此处描述的方法，鉴定了sev的三个主要亚群(图22a，即，外泌颗粒、exo-s和exo-l，分别对应于峰p2、p3和p4)。自相关函数是确定各馏分纯度的关键因素(图22b)。分离出的颗粒可以进一步回收，通常需要进一步浓缩以进行各种离线分析，例如tem、nta、bca测定、生物物理/生化特性表征、分子组成测定和功能研究。图22c中示出了b16-f10外泌颗粒、exo-s和exo-l的合并馏分的tem成像分析，揭示了各sev子集的独特形态。实施例13-外泌颗粒、exo-s和exo-l的全身性(sysmetic)功能检查为了研究它们的全身性功能，特别是在肝脏中的功能，将b16-f10鼠黑色素瘤来源的外泌颗粒、exo-s和exo-l静脉内注射到初始同系c57bl/6小鼠中。注射等体积的pbs作为对照。24小时后，从各治疗组小鼠中收集肝脏，并进行总rna提取和rna测序分析。如图23a所示，与pbs对照组相比，在外泌颗粒、exo-s和exo-l处理的小鼠的肝脏中共有5700、5320和6291个基因的表达水平显著改变(p＜0.05)。具体地，与exos和exo-l相比，外泌颗粒中分别有140和810个基因发生了独特的改变。为了进一步比较各组之间基因表达的变化，执行了单向anova分析，显著变化的前2000个基因的结果示于图23b中。与pbs对照组相比，在外泌颗粒、exo-s和exo-l处理的所有三组小鼠中都发现了很大的相似性。具体地，图24示出了与pbs对照组相比分别在所有三个组中上调(图24a)或下调(图24b)的前50个基因列表。因此，这些基因可以作为潜在的生物标志物，用于检测疾病，监测肝功能障碍，以及治疗靶标以干预癌症患者的肿瘤进展。举例来说，血清淀粉样蛋白a家族基因(saa1、saa2和saa3)，s100钙结合蛋白a4(s100a4)和核糖体蛋白亚基子集(rpl41、rps24、rpl36、rpl35、rpl21、rps12、rps18、rps14、rpl12、rpl34、rps10和rpl17)在外泌颗粒、exo-s和exo-l治疗的小鼠的肝脏中相较于pbs对照特异性上调。另一方面，转录因子如叉头盒(forkheadbox)蛋白n3(foxn3)，tea结构域家族成员1(tead1)，激活的t细胞核因子5(nfat5)，叉头盒q1(foxq1)，叉头盒k1(foxk1)，kruppel样因子12(klf12)和含ets结构域的蛋白质(elk4)是在所有三组中均排在前50位的显著下调基因。为了进一步研究受外泌颗粒、exo-s和exo-l显著影响的功能通路，对各数据集进行了ingenuitypathwayanalysis。图25显示了在各数据集中确定的前五个经典通路：外泌颗粒与pbs比较(图25a)；exo-s与pbs比较(图25b)；exo-l与pbs比较(图25c)；外泌颗粒与exo-s比较(图25d)，外泌颗粒与exo-l比较(图25e)。重要的是，与pbs对照相比，在外泌颗粒、exo-s和exo-l的所有三组中，包括e2f信号传导，mtor信号传导以及eif4和p70s6k信号传导的调节在内的通路均被确定发生了显著变化，表明它们对肝脏的增殖和代谢具有重要影响。除了这些发现之外，在外泌颗粒与pbs组比较的前五个经典通路中，具体识别了癌症分子机制和糖皮质激素受体信号传导的通路；在exo-s与pbs组比较中具体识别了线粒体功能障碍和氧化磷酸化通路；在exo-l与pbs组比较中具体识别了神经生长因子信号传导和胰岛素受体信号传导通路。此外，将外泌颗粒治疗组与exo-s或exo-l治疗组进行比较时，可以具体地识别以下通路：外泌颗粒与exo-s比较中的急性期反应信号、fxr/rxr激活、toll样受体信号、lps/il-1介导的rxr功能抑制以及芳烃受体信号传到；外泌颗粒与exo-l比较中的胆固醇生物合成超级通路，胆固醇生物合成i，胆固醇生物合成ii(经由24,25-二氢羊毛甾醇)，胆固醇生物合成iii(经由链甾醇)和igf-1信号传导。总的来说，对这些信号传导通路的改变进行检测有助于检测和监测癌症患者中的肿瘤进展。它们还代表潜在的治疗靶标。外泌颗粒的蛋白质组学分析表明其在靶细胞代谢中的潜在作用。为了具体地跟进该假设，与pbs对照相比，将注射b16-f10衍生的外泌颗粒、exo-s和exo-l后24小时从小鼠收获的肝脏进行了代谢物提取和质谱分析。图26a列出了使用不成对t检验发现的在各对比组中丰度受到显著影响的代谢物的数量。单向anova分析用于进一步鉴定在所有三个实验组中均发生变化的以及仅在各组中受影响的代谢物。图26b示出了所有被鉴定具有显著变化的代谢物以及图26c显示了仅在各组中受影响的代谢物的聚类分析。具体地，代谢物包括胸腺嘧啶、牛磺酸和腺苷琥珀酸酯的丰度在外泌颗粒、exo-s和exo-l处理的所有三组小鼠肝脏中升高(图27a)；而与pbs对照相比，以下代谢物的丰度在所有三组中都降低：包括葡萄糖-6-磷酸，l-精氨酸-琥珀酸酯，甲基半胱氨酸，sn-甘油-3-磷酸和酪氨酸(图27b)。此外，在图28a-28c中示出了仅在各组中受影响的代表性代谢物(图26c)。除了改变的基因表达外，这些代谢物的异常调节还可以用作生物标志物，以检测和监测肿瘤的进展，并且还成为癌症患者的潜在治疗靶标。为了进一步剖析外泌颗粒在肝脏中的功能作用，进行了免疫荧光共定位分析，并将肝中的驻留巨噬细胞库普弗细胞鉴定为是摄取b16-f10黑色素瘤来源的外泌颗粒的主要细胞类型。当被静脉内施用于初始的同系c57bl/6小鼠中时，观察到有超过95％的先前被pkh67荧光染料标记的外泌颗粒与肝脏中的f4/80阳性库普弗细胞共定位(图29)。该发现暗示库普弗细胞的功能可以潜在地被肿瘤来源的外泌颗粒操纵，并引发一系列的全身效应，从而有利于体内肿瘤的生长，因此它代表了开发用于阻断癌症发展的治疗策略的潜在靶标。虽然本文中已经详细描绘和描述了优选的实施方案，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改、增加、替换等，因此，这些被认为在所附权利要求书所限定的本发明范围之内。当前第1页12当前第1页12