一种高粱籽粒糯性快速检测方法及其应用与流程

本发明涉及作物籽粒的糯性鉴定，具体涉及一种高粱籽粒糯性快速检测方法及其应用。

背景技术：

高粱是酿造高档白酒不可或缺的原料。高粱籽粒有糯性和非糯性之分。我国传统名酒如茅台、五粮液等，均以糯高粱为主要原料。随着人们生活水平的提高，对酿酒糯高粱的需求越来越大。

通过目测胚乳断面可区分糯性和非糯性高粱，但这种方法往往会因遗传背景、籽粒成熟度、环境或者操作者经验的不同而导致判别上的差异(pedersenetal,2004)。一般谷物糯和非糯很容易通过碘染色的方法进行区分(nakamuraetal.,1995；neufferetal,1997)，因为直链淀粉的存在，非糯籽粒通常染色后呈深兰色，而糯性籽粒通常染成棕红色到紫色。但在高粱中，由于胚乳角质化导致碘束缚力减弱，利用碘染色的方法，区分糯性和非糯性的效果不是很好(cagampangandkirleis,1985)。然而，高粱淀粉可通过糊化，使之更易于碘染色，研究表明高粱糊化温度为74-82℃。

曾有报道用结晶碘、碘化钾定性法进行高粱籽粒的糯性鉴定：首先配制结晶碘与碘化钾溶液，分别取1克结晶碘，4.4克碘化钾，加少量水溶解后，加水稀释到10毫升，放棕色瓶内备用。然后将高粱分样后，磨成粉，取高粱粉4克，加入蒸馏水10毫升，一起倒入三角烧瓶内(用50毫升三角瓶)，在水浴锅内加热20分钟至沸腾，冷却后过滤，取该溶液20～30毫升置于另一个三角瓶中，并加入3-4滴结晶碘与碘化钾溶液，呈淡兰色即为粳性高粱，乳白色仍为糯性高粱。

上述方法明显存在着时间长(至少1小时以上)、步骤繁琐、过分依赖设备(粉碎仪、水浴锅)，导致鉴定成本高，不适宜高粱购销企业以及条件比较有限的科研单位对高粱糯性的快速鉴定。因此，有必要开发一种快速、简便的高粱糯性检测方法。

技术实现要素：

为了简化高粱糯性检测步骤、缩短糯性测试时间，本发明提供一种高粱籽粒糯性检测方法，无需对种子进行脱皮处理，无需借助粉碎仪、水浴锅或烘箱，即可快速、准确区分糯性和非糯性高粱籽粒。

本发明提供一种高粱籽粒糯性快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将细胞培养板放在坚固的水平台面上，每孔放一粒高粱种子样品，用微型杵在孔中将种子捣碎；

(2)向装有捣碎样品的孔中加入90-100℃的水，每孔0.3ml-0.5ml；

(3)待孔中的液体冷却至室温后，每孔加入一滴碘染色液；若染成兰黑色，则样品为非糯性高粱；若染成棕红色、橙色或者浅黄色，则样品为糯性高粱。

优选地，所述步骤(2)中，向装有捣碎样品的孔中加入90-100℃的蒸馏水。

优选地，所述碘染色液的配方为：10-12g碘化钾，1-1.2g碘，溶于500ml蒸馏水中。

优选地，所述碘染色液的配方为：10g碘化钾，1g碘，溶于500ml蒸馏水中。

优选地，所述步骤(3)中，每孔加入45-55μl碘染色液。

优选地，所述微型杵包括手柄以及固定在手柄上的研杵；所述研杵固定在手柄上的一端为连接端，另一端为研磨端；所述研磨端的端面平整，且研磨端的直径小于细胞培养板的孔径。

优选地，所述研杵的研磨端的直径为11-13mm；所述细胞培养板的孔底为平底，孔径为13-16mm。

优选地，所述手柄为木质手柄，长100-120mm，直径20-24mm；所述研杵为钢杵，长40-60mm，直径11-13mm。

优选地，所述细胞培养板为透明平底的24孔细胞培养板。

任一所述的方法在鉴别高粱籽粒糯性和非糯性中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明利用新研制的微型杵替代种子破碎仪，将高粱籽粒捣碎，再加入开水，使捣碎籽粒中的淀粉快速糊化，放置5-10分钟后即可冷却至室温，然后用碘染色液染色，将细胞培养板放在白纸上观察，染成兰黑色的样品为非糯性高粱，染成非蓝色(棕红色、橙色或者浅黄色)的样品为糯性高粱。该方法操作简便，无需对种子进行脱壳处理，不依赖设备，只需要微型杵、细胞培养板、开水和碘染色液，即可随时随地完成高粱糯性鉴定。此外，本发明用开水直接处理捣碎的高粱种子，替代传统的水浴锅糊化或烘箱糊化，使糊化处理时间缩短到5-10分钟，并且鉴定结果准确可靠，重复性好。该方法简称为“热水糊化染色法”。

为便于高粱种植大户、高粱爱好者、高粱购销企业、酒厂和有关科研单位等用户使用本发明的方法，减少购置的麻烦，发明人通过查询各种相关工具的技术参数，选择配备了快速检验所需试剂以及相应的工具，组配成了一套完整的试剂工具盒，包括：碘液滴瓶(自带滴管)、玻璃滴管(加开水用)、微型钢杵(自主研发的工具)、24孔平底细胞培养板(耐高温)。在优选实施例中，本发明提供的试剂工具盒还包括使用说明书，该说明书详细记载了本发明的高粱籽粒糯性快速检测方法。

本文所使用的术语“杵”、“微型杵”或“研杵”，是指棒状、杆状或类似形状的用于研磨或捣碎物品的工具，由坚硬的材料(例如，不锈钢)制成，可以具有均匀的直径(例如，圆柱结构)，也可以从一端到另一端具有变化的直径。本文所使用的“钢杵”是指使用钢(例如，不锈钢)制成的杵。

本文所使用的术语“滴管”或“玻璃滴管”由橡皮乳头和尖嘴玻璃管构成，用于吸取或加少量试剂。

本文所使用的术语“滴瓶”用于存放少量液体，瓶盖部分用滴管取代，需要避光保存时用棕色瓶。“碘液滴瓶”表示存放碘液的滴瓶。

本文所使用的术语“细胞培养板”，是具有多个小孔的培养板，主要用来做细胞培养，也可以用来做其他分析，例如测蛋白浓度。细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(u型和v型)；培养孔的孔数有6、12、24、48、96孔等；根据材质的不同有terasaki板和普通细胞培养板。本发明要求培养板应为平底型、材质应坚固。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

附图说明

图1.本发明的一个示范性实施例中的微型杵的示意图。

图2.本发明的另一个示范性实施例中的微型杵的示意图。

图3.本发明的示范性实施例中的高粱籽粒糯性快速检测试剂工具盒的示意图。

图4.采用本发明的方法进行高粱籽粒糯性快速检测的结果；其中，a为捣碎种子，未加入开水和碘染色液；b为开水糊化后的碘染色结果；a和b中，左边两列为糯高粱(品种为“红缨子”)，右边两列为粳高粱(品种为“rtx430”)。

附图标记：1-微型杵，2-细胞培养板，3-玻璃滴管，4-碘液滴瓶，5-手柄，6-研杵，7-外盒。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

实验材料

糯高粱种子：“红缨子”，该品种为已知高粱品种，记载在非专利文献“李祥栋、张明生、王洋等，江苏农业科学，2014，42(5)：39-42”中。

粳高粱种子：“rtx430”，该品种为已知高粱品种，记载在非专利文献“pedersen等，rapidiodinestainingtechniquesforidentifyingthewaxyphenotypeinsorghumgrainandwaxygenotypeinsorghumpollen.cropscience,2004,44:764-767.”中。

上述高粱材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

试剂与耗材

碘化钾：ki，cas：7681-11-0，分析纯，购自天津市津北精细化工有限公司。

碘：i2，cas：12190-71-5，分析纯，购自天津市津北精细化工有限公司。

碘染色液：10g碘化钾，1.0g碘，溶于500毫升蒸馏水中。

24孔细胞培养板：购自corning公司，型号3524，孔径15.6mm，耐高温。

棕色滴瓶和滴管、玻璃滴管均购自淘宝(上品玻璃制品)。

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。

实施例1.高粱籽粒糯性快速检测试剂工具盒的组配

1.微型杵的设计与制作

本发明用于捣碎高粱种子的微型杵为发明人自行研制。如图1-3所示，本发明的微型杵1包括手柄5以及固定在手柄5上的研杵6；所述研杵6固定在手柄5上的一端为连接端，另一端为研磨端；所述研磨端的端面平整，且尺寸小于细胞培养板2的孔尺寸并且大于高粱种子的尺寸。在优选实施例中，所述手柄5为木质手柄；所述研杵6由不锈钢制成。在优选实施例中，所述手柄5为棒状，长100-120mm，直径20-24mm；所述研杵6为杆状，长40-60mm，直径11-13mm。在一些实施例中，所述手柄5在中部或中部靠近手柄5与研杵6连接处的位置略微向内凹陷，方便手握以及在研磨高粱种子时用力。在一些实施例中，所述凹陷处的手柄5直径为20mm，所述手柄5其他部分的最大直径为24mm。

制作方法：分别制作手柄5和研杵6；在手柄5的连接端(与研杵6连接的那一端)的中心设置研杵插槽，将研杵6的连接端插入所述研杵插槽内并固定。

2.碘染色液的配制

将10-12g碘化钾，1-1.2g碘，溶于500ml蒸馏水中，混匀后分装入棕色滴瓶中，密封。

3.试剂/工具盒的组装

将制好的微型杵、装有碘染色液的棕色滴瓶、与棕色滴瓶配套使用的滴管、24孔细胞培养板以及用于加开水的玻璃滴管全部装入试剂工具盒中。在一些实施例中，将详细记载了本发明的高粱籽粒糯性快速检测方法的说明书装入该试剂工具盒中。在一些实施例中，本发明的试剂/工具盒包括一个碘液瓶(带滴管)，2支玻璃滴管，3块24孔细胞培养板，1个微型钢杵，1份使用说明书以及一个外盒。本发明的试剂/工具盒方便携带，可随时随地进行高粱糯性鉴定，为高粱种植大户、高粱爱好者、高粱购销企业、酒厂和有关科研单位等用户带来了极大的便利。

实施例2.高粱籽粒糯性快速检测

使用实施例1的高粱籽粒糯性快速检测试剂工具盒进行高粱糯性检测。其中，微型杵的手柄为棒状的木柄，长110mm，直径20-24mm；研杵为杆状的钢杵，钢杵露出部分长50mm，直径12mm。

采用本发明的热水糊化染色法检测高粱籽粒糯性，具体步骤如下：

s1.将24孔细胞培养板放在坚固的水平台面上；

s2.随机选取少量高粱种子样品，每孔放一粒种子；

s3.手握微型杵的手柄，用钢杵将高粱种子捣碎；

s4.用玻璃滴管向每一孔加入0.3ml-0.5ml开水(温度为90-100℃)；

s5.冷却大约5-10分钟，或手摸细胞培养板的板底接近室温；

s6.向每一小孔内加一滴(约50微升)碘染色液(配方：10g碘化钾，1.0g碘，溶于500毫升蒸馏水中)；

s7.染色后的颜色判读：将24孔细胞培养板放在白纸上观察，兰黑色为非糯性高粱，非蓝色(棕红色、橙色或者浅黄色)为糯性高粱。

实验结果如图4所示：a为捣碎种子(左图)；b为开水糊化后染色结果(右图)；a和b中，左边两列为糯高粱(红缨子)，右边两列为粳高粱(rtx430)。结果表明，“红缨子”种子样品被染成了棕红色、橙色或者浅黄色，“rtx430”种子样品被染成了兰黑色。