本发明属于保健食品实验技术分析检测领域，具体涉及一种增加骨密度营养高钙粉中维生素d2含量测定方法。
背景技术：
增加骨密度营养高钙粉，一种多营养补钙剂，冲服，用于人体补钙剂，其含有维生素d2，当前采用原有技术标准gb5009.82-2016进行检测标准，操作过于复杂，设备器材类型涉及多种，应用耗时长，不利于结果准确。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种增加骨密度营养高钙粉中维生素d2含量测定方法。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种增加骨密度营养高钙粉中维生素d2含量测定方法，包括下述步骤：
(1)配制样品溶液，包括增加骨密度营养高钙粉样品供试品溶液及维生素d2标准品溶液；
(2)标准曲线的制作:将维生素d2标准品溶液注入反相液相色谱仪中,用流动相甲醇进行等度洗脱，得到维生素d2色谱峰；以峰面积比为纵坐标,以维生素d2标准工作液浓度为横坐标绘制维生素d2标准曲线；
(3)样品测定:吸供试品溶液注入反相液相色谱仪中,得到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到待测液中维生素d2的浓度。
所述供试品溶液制备步骤如下：
a样品溶解液：取样品粉末适量，按照5:1的比例加入抗坏血酸，加入定量水进行充分溶解，得到溶解液；
b样品提取液：将a步骤得到的溶解液计入石油醚进行分次萃取，萃取分层得到的有机相合并干燥蒸发；蒸发后加入石油醚进行定容，即为提取液；
c供试品溶液：转移b提取液至离心管内，氮气吹扫，将溶剂挥发掉，使用定量甲醇溶解,低温过夜静置，过滤，即为供试品溶液。
优选的，步骤b中石油醚为沸程为60-90℃的石油醚。
高效液相色谱仪的使用条件为：0-25分钟，100％流动相体积；流动相为色谱级甲醇；所述流动相的流速：1.0ml/min；柱温为30-40℃，检测波长为263nm；注入体积为20微升；柱温为33℃。碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(一)标准方法前处理存在皂化过程复杂，不易制备除杂保真样品。改进方法省去该步骤，节省了时间。(二)原方法仪器测试需要正向色谱配合精密操作。改进方法省去该设备操作。节省了仪器分析步骤。(三)原方法采用抗坏血酸和bht两种还原保护剂，改进方法只采纳了一种，可节省成本。(四)选择60-90℃石油醚提取振摇不易产生气泡，操作要领简单、易复制，并减少损失。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1、化学试剂:无水乙醇(色谱级)、抗坏血酸、无水硫酸钠、石油醚(60-90度)、甲醇(色谱级)以上试剂均为天津化学试剂三厂生产，除另有说明，均为分析纯；水为gb/t6682规定一级水。
2、试剂配制
2.1标准品配制
2.2标准品：维生素d2标准品(c28h44o，cas：50-14-6)，纯度≥98％，经国家认证，并授予标准物质证书的标准物质。
2.3维生素d2标准储备液(100μg/ml)：精确称取10mg的维生素d2标准品，用乙醇溶解并定容于100ml棕色容量瓶中。
2.维生素d2标准测试液(10μg/ml)：稀释上述标准储备液10倍制得10μg/ml标准测试溶液10ml。
3、仪器设备
分析电子天平精确至0.1mg；分液漏斗500毫升(四弗龙口塞)；旋转蒸发仪(匹配抽真空设备)；氮吹仪；高效液相色谱仪(waters2695/2996-pad二极管阵列检测器)；超声振荡器(40-100hz)
4、测定方法
4.1待测样品：为天津天狮生命科学与技术研究院提供增加骨密度营养高钙粉配方样品，其维生素d2的检测方法包括以下步骤：
4.2供试品测试液制备:
4.2.1样品溶液
精密称定增加骨密度营养高钙粉10.00g(称量样品维生素d2含量在10-20μg)，抗坏血酸1.0g加入到250ml棕色三角锥形瓶中，加入50℃温水50毫升摇匀，50℃超声并摇匀15分钟(间隔5分钟要匀一次)。超声15分钟后，加入100毫升乙醇溶液，超声并摇匀30分钟后放置室温下放冷，即为溶解液。
4.2.2样品提取液
将上述已制备好的溶解液全部转入500ml分液漏斗中，加入100ml石油醚60-90℃，轻轻摇动，排气后盖好瓶塞，室温下振荡约5min后静置分层，将水相转入另一500ml分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500ml圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在50℃±2℃充氮条件下蒸至近干(绝不允许蒸干)。残渣用30-60℃石油醚转移至10ml容量瓶中，定容，即为提取液。
4.2.3待测供试品溶液
转移上述提取液至离心管内，氮气吹扫，将溶剂挥发掉，用5.0毫升甲醇溶解，定容,低温静置过夜，0.22μm有机滤膜过滤即为待测供试品溶液。
4.3上机测试，高效液相色谱条件
色谱柱：c18碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱长250mm、内径4.6mm、粒径5μm
流动相：100％色谱甲醇；
流速：0.9ml/min；
柱温：33℃±1；
检测波长：263nm；
进样体积：20μl；
将待测供试品溶液、标准测试溶液精密移取20微升注入高效液相色谱仪，记录色谱图。利用峰面积对标准品和供试品溶液进行计算即可得到供试品溶液中的维生素d2含量。
对比例1：采用原有技术标准gb5009.82-2016进行检测。
1、试剂：无水乙醇(c2h5oh):色谱纯,经检验不含醛类物质。抗坏血酸(c6h8o6)。2,6-二叔丁基对甲酚(c15h24o):简称bht。氢氧化钾(koh)。正己烷(c4h10o)。石油醚(c5h12o2):沸程为30℃-60℃。无水硫酸钠(na2so4)。ph试纸(ph范围1-14)。甲醇:色谱纯。淀粉酶:活力单位≥100u/mg。
2、仪器和设备:注:使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。
2.1分析天平:感量为0.1mg。2.2磁力搅拌器:带加热、控温功能。2.3旋转蒸发仪。2.4氮吹仪。2.5紫外分光光度计。2.6萃取净化振荡器。2.7半制备正相高效液相色谱仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配500μl定量环。2.8反相高效液相色谱分析仪:带紫外或二极管阵列检测器,进样器配100μl定
3、主要步骤：
3.1试样处理
3.1.1不含淀粉样品
称取5g-10g(准确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(准确至0.01g)液体样品于150ml平底烧瓶中,固体试样需加入20ml-30ml温水,加入1.00ml内标使用溶液(如测定维生素d2,用维生素d3作内标；如测定维生素d3,用维生素d2作内标。),再加入1.0g抗坏血酸和0.1gbht,混匀。加入30ml无水乙醇,加入10ml-20ml氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。
注:一般皂化时间为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾乙醇溶液,并适当延长皂化时间。
3.1.2提取
将皂化液用30ml水转入250ml的分液漏斗中,加入50ml石油醚,振荡萃取5min,将下层溶液转移至另一250ml的分液漏斗中,加入50ml的石油醚再次萃取,合并醚层。
3.1.3洗涤
用约150ml水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用ph试纸检测下层溶液ph值),去除下层水相。
3.1.4浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250ml旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15ml石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2ml时,取下蒸发瓶,氮吹至干,用正己烷定容至2ml,0.22μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相色谱系统半制备,净化待测液。
3.2半制备正相高效液相色谱系统适用性试验:
取约1.00ml维生素d2和d3标准中间使用液于10ml具塞试管中,在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。残渣用10ml正己烷振荡溶解。取该溶液100μl注入液相色谱仪中测定,确定维生素d保留时间。然后将500μl待测液注入液相色谱仪中,根据维生素d标准溶液保留时间收集维生素d馏分于试管中。将试管置于40℃水浴氮气吹干,取出准确加入1.0ml甲醇,残渣振荡溶解,即为维生素d测定液。
3.3标准曲线的制作:
分别将维生素d2标准系列工作液注入反相液相色谱仪中,得到维生素d2和维生素d3峰面积。以两者峰面积比为纵坐标,以维生素d2或维生素d3标准工作液浓度为横坐标分别绘制维生素d2标准曲线。
3.4样品测定
吸取维生素d测定液100μl注入反相液相色谱仪中,得到待测物与内标物的峰面积比值,根据标准曲线得到待测液中维生素d2(或维生素d3)的浓度。
经过不同的样品比对，证明使用本申请的色谱检测方法与原始的标准方法结果相近，但是使用本申请的技术方法不存在皂化过程，省去该步骤，节省了时间。节省了仪器分析步骤。同时，原方法采用抗坏血酸和bht两种还原保护剂，改进方法只采纳了一种，可节省成本。实验还发现选择60-90℃石油醚提取振摇不易产生气泡，操作要领简单、易复制，并减少损失。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有+改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。