一种快速荧光蛋白酶活性检测方法与流程

[0001]
本发明涉及一种蛋白酶标记的技术领域，特别涉及一种快速荧光蛋白酶活性检测方法。


背景技术：

[0002]
蛋白酶是最重要的一种工业酶制剂，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。在干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。此外，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶都是人体消化道中的蛋白酶，在它们的作用下，人体摄入的蛋白质被水解成小分子肽和氨基酸。
[0003]
蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 ph 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 ca2+ 、 mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 ca2+ 、 mg2+ 的 bss ，如： d-hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
[0004]
目前在焙烤工业中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶和植物蛋白酶。面包生产中应用蛋白酶能改变面筋性能，其作用形式和面包调制时力的作用及还原剂的化学反应不同。蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵，因此说明蛋白酶很重要，而蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产，目前一般通过无影管检测蛋白酶，整个检测工艺复杂，而且后期查看也不太方便，故此需要改进，如何利用荧光标记的方式来检测蛋白酶位置显得尤为重要。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，以解决上述背景技术中提出的检测工艺复杂的问题。
[0006]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，包括以下步骤：s1、预先设定一份蛋白酶含量值参考表；s2、配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和200-500nm不同紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液；s3、根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表；
s4、测定样品中是否有蛋白酶；s5、然后将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为20-37℃条件下,培养1.5-2小时；s6、用户在35-37
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0007]
进一步，还包括在标记蛋白酶时还需要预先创建不同温度下，对应荧光材料的颜色变化，然后根据样品的实时温度，查询对应标记荧光的颜色值。
[0008]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法如下：取样品中的部分，加入浓度为2-3μm的氮杂环罗丹明双酰胺培养液培养1-3小时，然后通过检测培养液的荧光強度，判断蛋白酶的存在情况，荧光强度越高，蛋白酶越多。
[0009]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法还可以是：取样品中的部分加入金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度，所述反应产物无变化判断所述样品中无蛋白酶，若有变化，说明样品中有蛋白酶。
[0010]
进一步，在步骤s2中配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和450nm紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液。
[0011]
进一步，在步骤s6中用户在36
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0012]
进一步，所述金属纳米簇包括牛血清蛋白-金纳米簇或牛血清蛋白-银纳米簇或多肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇中的一种。
[0013]
本发明得到的一种快速荧光蛋白酶活性检测方法的技术效果是：通过上述的荧光标记方法使得整个操作工艺简单，能够增加快速的发现检测样品中是否有蛋白酶。
具体实施方式
[0014]
实施例1：本实施例提供了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，包括以下步骤：s1、预先设定一份蛋白酶含量值参考表；s2、配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和200-500nm不同紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液；s3、根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表；s4、测定样品中是否有蛋白酶；s5、然后将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为20-37℃条件下,培养1.5-2小时；s6、用户在35-37
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0015]
进一步，还包括在标记蛋白酶时还需要预先创建不同温度下，对应荧光材料的颜色变化，然后根据样品的实时温度，查询对应标记荧光的颜色值。
[0016]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法如下：取样品中的部分，加入浓度为2-3μm的氮杂环罗丹明双酰胺培养液培养1-3小时，然后通过检测培养液的荧光強度，判断蛋白酶的存在情况，荧光强度越高，蛋白酶越多。
[0017]
进一步，在步骤s2中配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和450nm紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液。
[0018]
进一步，在步骤s6中用户在36
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0019]
因此通过本发明在使用时，先预先设定一份蛋白酶含量值参考表；然后配置荧光用探针的荧光溶液：再根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表并创建方便用户查看的表格，然后进行实时检测样品数据，通过实时测定样品中是否有蛋白酶；将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为20-37℃条件下,培养1.5-2小时，用户在35-37
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值，因此通过上述的荧光标记方法使得整个操作工艺简单，能够增加快速的发现检测样品中是否有蛋白酶。
[0020]
实施例2：本实施例提供了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，包括以下步骤：s1、预先设定一份蛋白酶含量值参考表；s2、配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和200-500nm不同紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液；s3、根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表；s4、测定样品中是否有蛋白酶；s5、然后将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为20-37℃条件下,培养1.5-2小时；s6、用户在35-37
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0021]
进一步，还包括在标记蛋白酶时还需要预先创建不同温度下，对应荧光材料的颜色变化，然后根据样品的实时温度，查询对应标记荧光的颜色值。
[0022]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法还可以是：取样品中的部分加入金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度，所述反应产物无变化判断所述样品中无蛋白酶，若有变化，说明样品中有蛋白酶。
[0023]
进一步，所述金属纳米簇包括牛血清蛋白-金纳米簇或牛血清蛋白-银纳米簇或多
肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇中的一种。
[0024]
实施例3：本实施例提供了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，包括以下步骤：s1、预先设定一份蛋白酶含量值参考表；s2、配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和500nm不同紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液；s3、根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表；s4、测定样品中是否有蛋白酶；s5、然后将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为37℃条件下,培养2小时；s6、用户在37
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0025]
进一步，还包括在标记蛋白酶时还需要预先创建不同温度下，对应荧光材料的颜色变化，然后根据样品的实时温度，查询对应标记荧光的颜色值。
[0026]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法还可以是：取样品中的部分加入金属纳米簇反应，得到反应产物，检测所述反应产物的荧光强度，所述反应产物无变化判断所述样品中无蛋白酶，若有变化，说明样品中有蛋白酶。
[0027]
进一步，所述金属纳米簇包括牛血清蛋白-金纳米簇或牛血清蛋白-银纳米簇或多肽-金纳米簇或多肽-银纳米簇中的一种。
[0028]
实施例4：本实施例提供了一种快速荧光蛋白酶活性检测方法，包括以下步骤：s1、预先设定一份蛋白酶含量值参考表；s2、配置荧光用探针的荧光溶液：以市售纯度高于98%的芘、尼罗红、 香豆素481、 苏丹红、 氟硼荧染料为荧光探针，将疏水性染料溶解到市售光谱纯丙酮、 氯仿或甲醇的有机溶剂中并添加具有不同温度下和200nm不同紫外光激发下呈现不同发光颜色的荧光材料， 配制荧光溶液；s3、根据预先设定的蛋白酶含量值参考表对应不同颜色的荧光溶液；创建蛋白酶荧光色参考表；s4、测定样品中是否有蛋白酶；s5、然后将样品中含有蛋白酶的样品放入到s2的荧光溶液中，进行培养，在温度为20-37℃条件下,培养1.5小时；s6、用户在35
°
c下进行荧光光谱跟踪检测，获得显示不同的荧光颜色，然后在蛋白酶荧光色参考表中查找对应的蛋白酶含量值。
[0029]
进一步，还包括在标记蛋白酶时还需要预先创建不同温度下，对应荧光材料的颜色变化，然后根据样品的实时温度，查询对应标记荧光的颜色值。
[0030]
进一步，在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法如下：取样品中的部分，
加入浓度为2-3μm的氮杂环罗丹明双酰胺培养液培养1-3小时，然后通过检测培养液的荧光強度，判断蛋白酶的存在情况，荧光强度越高，蛋白酶越多。
[0031]
本实施例中在步骤s4中测定样品中是否有蛋白酶的具体方法如下：取样品中的部分，加入浓度为2μm的氮杂环罗丹明双酰胺培养液培养2小时，然后通过检测培养液的荧光強度，判断蛋白酶的存在情况，荧光强度越高，蛋白酶越多。
[0032]
经过实验证明发现通过本实施例的方法能够更加清楚的让用户后期知道样品中蛋白酶的含量，预先设置的表格如下：最终实验数据结果：尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。