一种发热伴血小板减少综合征病毒感染IgM抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒的制作方法

一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及免疫荧光法检测技术领域，尤其涉及一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒。


背景技术：

2.发热伴血小板减少综合征(severe fever withthrombocytopenia syndrome,sfts)是一种急性传染性疾病，由布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndromebunyavirus,sftsv)感染所致，该新病毒隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，2009年在中国首次被发现，近年来已在大半个中国地区流行传播，致数千人患病甚至死亡，平均病死率约10％，陆续地在韩国、日本和美国也有类似疫情报道。该疾病主要临床症状表现为高热、厌食、肌肉痛、寒战、淋巴结肿大、白细胞降低、血小板减少和多器官功能衰竭等，少数患者病情较重且发展迅速，可因多脏器功能衰竭而死亡。截至2011年底的监测和调查结果显示，病例多发生于4～10 月份，以青壮年居多。潜伏期尚不十分明确，可能为1周～2周。急性起病，主要临床表现为发热，体温多在38℃以上，重者持续高热，可达40℃以上，部分病例热程可长达10天以上。伴乏力、明显纳差、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。查体常有颈部及腹股沟等浅表淋巴结肿大伴压痛、上腹部压痛及相对缓脉。少数病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血(dic)等多脏器功能衰竭死亡。目前，国内外广泛应用的qpcr检测方法则因实验仪器要求高、操作繁琐，扩增完成后需要通过电泳、显影等步骤对产物进行判别，不适合基层医院及现场快速检测的要求。因此，开发一款能够适用于临床疾控快速筛查要求，且灵敏性高、特异性强且价格低廉的发热伴血小板减少综合征病毒感染快速检测方法及其检测试剂盒，对于疾病感染的控制和临床诊治显得尤其重要。基于上述陈述，本发明提出了一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决现有技术中检测方法对实验仪器要求高、操作繁琐，扩增完成后需要通过电泳、显影等步骤对产物进行判别，不适合基层医院及现场快速检测的要求的问题，而提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒。
4.一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法，包括以下步骤：
5.(1)消化已培养好的感染发热伴血小板减少综合征病毒的细胞；
6.(2)完成步骤(1)中消化操作后，用含3％血清的dmem液体吹散细胞；
7.(3)收集步骤(2)中完成吹散处理的细胞于ep管中进行离心，设置离心转速为300g，离心时间为15min，收集离心后的沉淀；
8.(4)用无菌pbs清洗步骤(3)中收集的沉淀2
‑
3次；
9.(5)将步骤(4)清洗完成的沉淀在显微镜下边观察边用pbs调节细胞浓度至其可以在载玻片孔内铺成单层，即得细胞悬浮液；
10.(6)将步骤(5)中的细胞悬浮液滴加入12孔载玻片中，每孔滴加2μl细胞悬液铺孔爬片；
11.(7)待步骤(6)中孔内细胞悬浮液挥发后，用冷丙酮(
‑
20℃
ꢀ‑
4℃)固定5
‑
10min，晾干冻存玻片备用；
12.(8)将需要检测的患者血清用pbs于无菌状态下以1:80的比例进行稀释；
13.(9)将步骤(8)中稀释好的血清加入抗原片孔中，每孔20μl，每片抗原片设置一孔加20μl pbs做空白对照，同时设置阳性对照和阴性对照；
14.(10)将步骤(9)中的抗原片放入湿盒，置于37℃温箱内孵育 45min；
15.(11)完成步骤(10)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
16.(12)以步骤(8)中相同的比例将二抗进行稀释，然后加入到经步骤(11)处理后的抗原片孔中，同样放置在湿盒中，然后置于37℃温箱孵育45min；
17.(13)完成步骤(12)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
18.(14)滴加甘油封片剂于步骤(13)清洗吹干后的抗原片上，盖上盖玻片封片，避光保存，荧光显微镜下观察，即可进行患者检测。
19.优选的，所述步骤(1)具体操作如下：将发热伴血小板减少综合征病毒感染vero细胞，培养5
‑
7天，待超过60％的细胞出现细胞病变效应后，收集细胞培养物上清液，并用0.25％的胰蛋白酶消化细胞。
20.优选的，所述步骤(9)中的阳性对照为已经确诊发热伴血小板减少综合征患者血清滴加的孔；阴性对照为滴加正常人血清的孔。
21.本发明还提出了一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测试剂盒，其包括：细胞悬浮液、患者血清和二抗；所述试剂盒由12个孔组成，每孔滴加2μl细胞悬液铺孔爬片，待孔内细胞悬浮液挥发后，用冷丙酮固定；将患者血清用pbs稀释后加入抗原片孔中，每孔20μl，每片抗原片设置一孔加20μl pbs做空白对照，同时设置阳性对照和阴性对照；将抗原片放入湿盒孵育；完成孵育，清洗、吹干；将二抗稀释后加入抗原片孔中，同样放置在湿盒中孵育；完成孵育，清洗、吹干，滴加甘油封片剂盖上盖玻片封片，即得检测试剂盒。
22.本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法及其检测试剂盒，具有以下有益效果：
23.1、本发明检测发热伴血小板减少综合征病原体的特异性及敏感性相对较高，发明人进行假阳性率及假阴性率的检测(即采用多例健康人血清和确诊患者血清分别用该方法进行测定，荧光显微镜下观察)，假阳性率小于0.01，同时假阴性率可忽略不计，检测准确率高、检测效率高，检测成本低。
24.2、现有技术方案中，还未有人利用抗原片方法来检测该种病原体，本方案不仅提
高了临床检验的特异性及灵敏性，并且充分考虑到患者的经济水平，检测方法操作简便，成本低。
附图说明
25.图1为本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm 抗体检测试剂盒示意图。
26.图2为本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm 抗体检测用免疫荧光法中的阳性对照示意图。
27.图3为本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm 抗体检测用免疫荧光法中的阴性对照示意图。
28.图4为本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm 抗体检测用免疫荧光法中的空白对照示意图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
30.实施例一
31.本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法，包括以下步骤：
32.(1)将发热伴血小板减少综合征病毒感染vero细胞，培养5天，待超过60％的细胞出现细胞病变效应后，收集细胞培养物上清液，并用0.25％的胰蛋白酶消化细胞；
33.(2)完成步骤(1)中消化操作后，用含3％血清的dmem液体吹散细胞；
34.(3)收集步骤(2)中完成吹散处理的细胞于ep管中进行离心，设置离心转速为300g，离心时间为15min，收集离心后的沉淀；
35.(4)用无菌pbs清洗步骤(3)中收集的沉淀2次；
36.(5)将步骤(4)清洗完成的沉淀在显微镜下边观察边用pbs调节细胞浓度至其可以在载玻片孔内铺成单层，即得细胞悬浮液；
37.(6)将步骤(5)中的细胞悬浮液滴加入12孔载玻片中，每孔滴加2μl细胞悬液铺孔爬片；
38.(7)待步骤(6)中孔内细胞悬浮液挥发后，用冷丙酮(
‑
20℃) 固定5min，晾干冻存玻片备用；
39.(8)将需要检测的患者血清用pbs于无菌状态下以1:80的比例进行稀释；
40.(9)将步骤(8)中稀释好的血清加入抗原片孔中，每孔20μl，每片抗原片设置一孔加20μl pbs做空白对照，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为已经确诊发热伴血小板减少综合征患者血清滴加的孔；阴性对照为滴加正常人血清的孔；
41.(10)将步骤(9)中的抗原片放入湿盒，置于37℃温箱内孵育 45min；
42.(11)完成步骤(10)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
43.(12)以步骤(8)中相同的比例将二抗进行稀释，然后加入到经步骤(11)处理后的
抗原片孔中，同样放置在湿盒中，然后置于 37℃温箱孵育45min；
44.(13)完成步骤(12)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
45.(14)滴加甘油封片剂于步骤(13)清洗吹干后的抗原片上，盖上盖玻片封片，避光保存，荧光显微镜下观察，即可进行患者检测。
46.实施例二
47.本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法，包括以下步骤：
48.(1)将发热伴血小板减少综合征病毒感染vero细胞，培养6天，待超过70％的细胞出现细胞病变效应后，收集细胞培养物上清液，并用0.25％的胰蛋白酶消化细胞；
49.(2)完成步骤(1)中消化操作后，用含3％血清的dmem液体吹散细胞；
50.(3)收集步骤(2)中完成吹散处理的细胞于ep管中进行离心，设置离心转速为300g，离心时间为15min，收集离心后的沉淀；
51.(4)用无菌pbs清洗步骤(3)中收集的沉淀3次；
52.(5)将步骤(4)清洗完成的沉淀在显微镜下边观察边用pbs调节细胞浓度至其可以在载玻片孔内铺成单层，即得细胞悬浮液；
53.(6)将步骤(5)中的细胞悬浮液滴加入12孔载玻片中，每孔滴加2μl细胞悬液铺孔爬片；
54.(7)待步骤(6)中孔内细胞悬浮液挥发后，用冷丙酮(4℃) 固定10min，晾干冻存玻片备用；
55.(8)将需要检测的患者血清用pbs于无菌状态下以1:80的比例进行稀释；
56.(9)将步骤(8)中稀释好的血清加入抗原片孔中，每孔20μl，每片抗原片设置一孔加20μl pbs做空白对照，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为已经确诊发热伴血小板减少综合征患者血清滴加的孔；阴性对照为滴加正常人血清的孔；
57.(10)将步骤(9)中的抗原片放入湿盒，置于37℃温箱内孵育 45min；
58.(11)完成步骤(10)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
59.(12)以步骤(8)中相同的比例将二抗进行稀释，然后加入到经步骤(11)处理后的抗原片孔中，同样放置在湿盒中，然后置于 37℃温箱孵育45min；
60.(13)完成步骤(12)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
61.(14)滴加甘油封片剂于步骤(13)清洗吹干后的抗原片上，盖上盖玻片封片，避光保存，荧光显微镜下观察，即可进行患者检测。
62.实施例三
63.本发明提出的一种发热伴血小板减少综合征病毒感染igm抗体检测用免疫荧光法，包括以下步骤：
64.(1)将发热伴血小板减少综合征病毒感染vero细胞，培养7天，待超过80％的细胞出现细胞病变效应后，收集细胞培养物上清液，并用0.25％的胰蛋白酶消化细胞；
65.(2)完成步骤(1)中消化操作后，用含3％血清的dmem液体吹散细胞；
66.(3)收集步骤(2)中完成吹散处理的细胞于ep管中进行离心，设置离心转速为300g，离心时间为15min，收集离心后的沉淀；
67.(4)用无菌pbs清洗步骤(3)中收集的沉淀2次；
68.(5)将步骤(4)清洗完成的沉淀在显微镜下边观察边用pbs调节细胞浓度至其可以在载玻片孔内铺成单层，即得细胞悬浮液；
69.(6)将步骤(5)中的细胞悬浮液滴加入12孔载玻片中，每孔滴加2μl细胞悬液铺孔爬片；
70.(7)待步骤(6)中孔内细胞悬浮液挥发后，用冷丙酮(
‑
10℃) 固定8min，晾干冻存玻片备用；
71.(8)将需要检测的患者血清用pbs于无菌状态下以1:80的比例进行稀释；
72.(9)将步骤(8)中稀释好的血清加入抗原片孔中，每孔20μl，每片抗原片设置一孔加20μl pbs做空白对照，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为已经确诊发热伴血小板减少综合征患者血清滴加的孔；阴性对照为滴加正常人血清的孔；
73.(10)将步骤(9)中的抗原片放入湿盒，置于37℃温箱内孵育 45min；
74.(11)完成步骤(10)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡 5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
75.(12)以步骤(8)中相同的比例将二抗进行稀释，然后加入到经步骤(11)处理后的抗原片孔中，同样放置在湿盒中，然后置于 37℃温箱孵育45min；
76.(13)完成步骤(12)中的孵育反应后，将抗原片置于玻片染色缸中，加入pbs浸润抗原片，将玻片染色缸置于微量振荡器上震荡5min，重复3次，以清洗抗原片，清洗完成后室温吹干；
77.(14)滴加甘油封片剂于步骤(13)清洗吹干后的抗原片上，盖上盖玻片封片，避光保存，荧光显微镜下观察，即可进行患者检测。
78.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。