一种多糖中脂肪酸含量的检测方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种多糖中脂肪酸含量的检测方法。


背景技术：

2.细胞中的脂质按照功能分类主要有3类：储藏脂类，结构脂类，调节脂类，据文献报道，小肠粘膜组织中脂质主要是膜脂与粘附在小肠表面的脂肪，膜脂主要包括磷脂、糖脂和胆固醇三种类型。磷脂是构成膜脂的基本成分，约占整个膜脂的50％以上。
3.糖脂是含糖而不含磷酸的脂类，含量约占膜脂总量5％以下。糖脂也是两性分子，其结构与鞘磷脂很相似，只是由一个或多个糖残基代替了磷脂酰胆碱而与鞘氨醇的羟基结合。其含量较少。胆固醇是中性脂质胆固醇主要存在真核细胞膜上，含量一般不超过膜脂的1/3。胆固醇功能是提高双脂层的力学稳定性，调节双脂层流动性，降低水溶性物质的通透性。食物中的脂肪在消化道分解为脂肪酸被小肠吸收，重新合成脂肪附着在小肠黏膜上；食物中的糖和蛋白质，如果摄入量超过消耗量，也会转化为脂肪酸，进一步合成脂肪附着在小肠上。因此粘附在小肠表面的脂肪与脂肪酸可以相互转化。
4.粘多糖是含氮的不均一多糖，是构成细胞间结缔组织的主要成分，也广泛存在于哺乳动物各种细胞内。化学组成为糖醛酸和氨基己糖交替出现，有时含硫键。也称为糖胺聚糖。重要的粘多糖有：皮肤素，肝素钠，角质素，软骨素和透明质酸等。近10年来由于膜的化学功能，免疫物质的化学研究与发展以及新药资源寻找与开发等，发现糖类具有多种多样的功能，在生命现象中参与了细胞的各种活动。因此，多糖的研究开始活跃起来。关于动物粘多糖在生物学、医学范围内的研究正在不断深入展开。已经证实，此类成分具有多种药理活性，包括抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤及抗放射等作用。粘多糖大多从动物组织中提取，脂质作为细胞膜的主要组成部分，在生产多糖的提取过程中有可能会引入一定量的脂质，进而影响多糖的药理，因此多糖尤其是肝素钠中脂质检测方法的建立非常重要。
5.针对多糖中脂肪酸，我们提出了一种多糖中脂肪酸含量的检测方法。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种多糖中脂肪酸含量的检测方法，本发明利用该方法可以快速、准确地定量肝素钠中各类脂肪酸，从而保证肝素钠的质量。
7.本发明提供如下技术方案：一种多糖中脂肪酸含量的检测方法，包括以肝素钠多糖为例其检测特征包括以下步骤：
8.s1、标准溶液的配制：
9.内标溶液：二甘醇二甲醚溶液；
10.标准储备液a：称取各脂肪酸甲酯标准品适量，用内标液配制为溶液；
11.标准储备液b：吸取脂肪酸甲酯溶液，加入内标液定容；
12.回收标准溶液(肉豆蔻酸、棕榈酸)：称量适量肉豆蔻酸、棕榈酸，加入正己烷，配制
成溶液。
13.s2、样品溶液的配制
14.皂化：称取样品于西林瓶中，加入氢氧化钠溶液，水浴加热；
15.甲基化：冷却皂化后溶液至室温，加入甲醇和浓硫酸，漩涡搅拌，冷却至室温；
16.萃取：加入氯化钠溶液和二甘醇二甲醚溶液萃取甲基化溶液；
17.样品溶液：将有机相层转移到分液漏斗，加入氢氧化钠溶液，混匀后，收集有机相于gc进样瓶。
18.s3、标准加入样品溶液(检验萃取率)：
19.皂化：称取肝素钠于西林瓶中，加入氢氧化钠溶液和回收率标准溶液，水浴加热；
20.甲基化：冷却皂化后溶液至室温，加入甲醇和浓硫酸，漩涡搅拌，冷却至室温；
21.萃取：加入氯化钠溶液和二甘醇二甲醚溶液萃取甲基化溶液；
22.标准加入样品溶液：将有机相层转移到分液漏斗中，加入氢氧化钠溶液，混匀后，收集有机相于gc进样瓶。
23.s4、实验分析：
24.选择气相色谱仪、fid检测器、100％聚乙二醇毛细管色谱柱，在程序升温过程中对标准溶液，标准加入样品溶液，样品溶液进行分析，标准溶液中任何两个连续成分峰完全分离，分离度不小于2.0，肉豆蔻酸甲酯(c14)、棕榈酸甲酯(c16)在标准加入样品溶液中的峰面积是标准溶液中峰面积(以平均值计)的0.7,-1.3倍；
25.s5、计算结果：
26.萃取效率适用性：按下式计算
[0027][0028]
r：标准加入样品溶液中(肉豆蔻酸甲酯(c14)或棕榈酸甲酯(c16))与标准溶液平均峰面积之比；
[0029]
a标加：标准加入样品溶液中(肉豆蔻酸甲酯(c14)或棕榈酸甲酯(c16))峰面积；
[0030]
a样品：样品溶液中(肉豆蔻酸甲酯(c14)或棕榈酸甲酯(c16))平均峰面积；
[0031]
a标准：标准溶液中(肉豆蔻酸甲酯(c14)或棕榈酸甲酯(c16))平均峰面积；
[0032]
c标准：(肉豆蔻酸甲酯或棕榈酸甲酯)重量/(肉豆蔻酸甲酯或棕榈酸甲酯)分子量；
[0033]
c标加：(肉豆蔻酸或棕榈酸)重量/(肉豆蔻酸或棕榈酸)分子量；
[0034]
其中：肉豆蔻酸(c14)分子量为228.37，肉豆蔻酸甲酯分子量为242.40，棕榈酸(c16)分子量为256.42，棕榈酸甲酯(c16)的分子量为270.00。
[0035]
s6、按下式计算供试溶液中各脂肪酸含量(％)：
[0036][0037]
其中：a
t
：样品溶液中各脂肪酸甲酯峰的平均峰面积；
[0038]ast
：标准溶液中各脂肪酸甲酯峰的平均峰面积；
[0039]ct
：样品溶液浓度(约100mg/ml)；
[0040]cst
：标准储备液b中各脂肪酸甲酯的浓度(约0.01mg/ml)；
[0041]
c：标准品中各脂肪酸甲酯的含量。
[0042]
优选的，所述s1中的二甘醇二甲醚吸取量为53ul到500ml容量瓶。
[0043]
优选的，所述s1中标准储备液a配制浓度为1mg/ml，标准储备液b中各脂肪酸甲酯的浓度为0.01mg/ml，回收标准溶液中肉豆蔻酸、棕榈酸的浓度为0.1mg/ml。
[0044]
优选的，所述s2中皂化称取样品量1000mg于20ml西林瓶中再加入2ml15％w/v氢氧化钠溶液，水浴加热25min，甲基化加入甲醇5ml，浓硫酸1ml，旋涡搅拌30min。
[0045]
优选的，所述s2中萃取加入300μl20％w/v氯化钠溶液和3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液，样品溶液中加入6ml1.2％w/v氢氧化钠溶液。
[0046]
优选的，所述s3中皂化称取样品量1000mg于20ml西林瓶中再加入2ml15％w/v氢氧化钠溶液和1ml回收率标准溶液，水浴加热25min，甲基化加入甲醇5ml，浓硫酸1ml，旋涡搅拌30min。
[0047]
优选的，所述s3中萃取加入300μl20％w/v氯化钠溶液和3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液，标准加入样品溶液中加入6ml1.2％w/v氢氧化钠溶液。
[0048]
优选的，所述s4中气相色谱仪的程序升温条件为：80℃下保持2min，然后以4.5℃/min升温至220℃，保持23min。
[0049]
优选的，所述s4中气相色谱仪的进样口温度：250℃，检测器温度(fid)：250℃，载气：氦气，流速：4.0ml/min。
[0050]
优选的，s4中色谱柱长度为30m，内径为0.32mm，膜厚为0.5um。
[0051]
与现有技术对比，本发明具备以下有益效果：
[0052]
该多糖中脂肪酸含量的检测方法，通过将脂肪转化为脂肪酸，克服了脂肪不容易气化，不能采用气相色谱仪检测的难题，能够有效控制肝素钠中脂肪酸的含量，降低肝素钠的致病风险；整个检测方法简单、快速、准确率高，便于工业化推广应用。
附图说明
[0053]
图1为本发明标准溶液色谱图；
[0054]
图2为本发明标准加入溶液色谱图；
[0055]
图3为本发明样品溶液色谱图。
具体实施方式
[0056]
为了使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例的附图，对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，为了保持本公开实施例的以下说明清楚且简明，本公开省略了已知功能和已知部件的详细说明，以避免不必要地混淆本发明的概念。
[0057]
1、仪器与用具
[0058]
气相色谱仪(fid检测器)、天平(十万分之一)、恒温水浴锅、容量瓶、分液漏斗、移液枪及配套枪头
[0059]
2、试剂与试液
[0060]
肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)、脂肪酸甲酯、乙酸甲酯(c6)、辛酸甲酯(c8)、癸酸甲酯(c10)、月桂酸甲酯(c12)、肉豆蔻酸甲酯(c14)、棕榈酸甲酯(c16)、硬脂酸甲酯(c18)、花
生酸甲酯(c20)、山嵛酸甲酯(c22)、木蜡酸甲酯(c24)、正己烷、甲基叔丁醚、硫酸、氯化钠、氢氧化钠、甲醇、二甘醇二甲醚、浓硫酸
[0061]
3、溶液配制
[0062]
3.1标准溶液的配制：
[0063]
内标溶液：吸取53μl二甘醇二甲醚于500ml容量瓶中，加入稀释液定容至刻度。
[0064]
标准储备液a：分别称取各脂肪酸甲酯标准品适量，用内标液稀释，配制为1mg/ml脂肪酸甲酯溶液。
[0065]
标准储备液b：吸取1mg/ml脂肪酸甲酯溶液各1ml溶于100ml容量瓶中，加入内标液定容至刻度。(混合溶液中各脂肪酸甲酯的浓度为0.01mg/ml)。
[0066]
回收标准溶液(肉豆蔻酸、棕榈酸)：称量适量肉豆蔻酸、棕榈酸，加入正己烷，配制成含1mg/ml肉豆蔻酸、棕榈酸的溶液，再吸取该溶液适量，加入正己烷稀释成浓度0.1mg/ml。
[0067]
3.2样品溶液：
[0068]
皂化：称取1000mg肝素钠于20ml西林瓶中，加入2ml15％w/v氢氧化钠溶液，盖上盖子置于100℃水浴加热5min，漩涡搅拌5～10s后继续水浴加热25min。
[0069]
甲基化：冷却皂化后溶液至室温，加入5ml甲醇和1ml浓硫酸，盖上盖子置于80℃漩涡搅拌30min，最后冷却至室温。
[0070]
萃取：加入300μl20％w/v氯化钠溶液和3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液于甲基化溶液中，轻轻混匀5min，收集有机相(上层)于10ml的容量瓶中，再用3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液萃取下层液收集有机相，重复2次，最后将收集的有机相转入先前收集有机相的10ml容量瓶中。如果收集的有机相体积小于10ml，则加入0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液定容至10ml。
[0071]
样品溶液：将收集的有机相转移到分液漏斗中，加入6ml1.2％w/v氢氧化钠溶液，混匀5min后，收集2ml有机相于gc进样瓶中，盖紧。
[0072]
3.3标准加入样品溶液(检验萃取率)：
[0073]
皂化：称取1000mg肝素钠于20ml西林瓶中，加入2ml15％w/v氢氧化钠溶液和1ml回收率标准溶液，盖上盖子置于100℃水浴加热5min，漩涡搅拌5-10s后继续水浴加热25min。
[0074]
甲基化：冷却皂化后溶液至室温，加入5ml甲醇和1ml浓硫酸，盖上盖子置于80℃漩涡搅拌30min，最后冷却至室温。
[0075]
萃取：加入300μl20％w/v氯化钠溶液和3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液于甲基化溶液中，轻轻混匀5min，收集有机相(上层)于10ml的容量瓶中，再用3ml0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液萃取下层液收集有机相，重复2次，最后将收集的有机相转入先前收集有机相的10ml容量瓶中。如果收集的有机相体积小于10ml，则加入0.1mg/ml二甘醇二甲醚溶液定容至10ml。
[0076]
标准加入样品溶液：将收集的有机相转移到分液漏斗中，加入6ml1.2％w/v氢氧化钠溶液，混匀5min后，收集2ml有机相于gc进样瓶中，盖紧。
[0077]
气相色谱仪(fid检测器)、天平(十万分之一)、恒温水浴锅、容量瓶、分液漏斗、移液枪及配套枪头。
[0078]
4、测方法
[0079]
检测器：fid检测器
[0080]
色谱柱：db-wax(固定相：100％聚乙二醇；30mx0.32mm,0.5μm)
[0081]
进样口温度：250℃。
[0082]
载气：氦气，流速：4.0ml/min。
[0083]
5、数据处理：
[0084]
5.1、萃取效率适用性：
[0085]
由附图1-3图谱可知
[0086]
以棕榈酸甲酯为例：
[0087]
a标加＝53781
[0088]
a样品＝4676
[0089]
a标准＝61872
[0090]
c标准＝20mg/270.00＝0.074
[0091]
c标加＝20mg/256.42＝0.078
[0092][0093]
5.2脂肪酸含量：
[0094]
以棕榈酸甲酯为例：
[0095]
at＝4676
[0096]
ast＝61872
[0097]
ct＝100mg/ml
[0098]
cst＝0.01mg/ml
[0099]
c＝98％
[0100][0101]
该检测方法经过完整的方法学验证，系统适应性中6针进样标准溶液中各脂肪酸甲酯的峰面积rsd符合规定；第一针标准溶液中任何两个连续成分峰之间的分离度符合规定；肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)在标准加入样品溶液中的回收率c14：90.3％，c16：95.1％，专属性中目标峰无干扰，各脂肪酸甲酯峰与相邻峰之间的分离度不小于1.3；肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)在标准加入样品溶液中的回收率为c14：93.5％，c16：92.7％；相关系数平方r2分别为：0.997，,0.997，0.996，0.995，0.995，0.996，0.996，0.996，0.997，0.999；己酸甲酯(c6)的loq为2.8ug/ml、辛酸甲酯(c8)的loq为3.1ug/ml、癸酸甲酯(c10)的loq为3.4ug/ml、月桂酸甲酯(c12)的loq为3.8ug/ml、肉豆蔻酸甲酯(c14)的loq为3.9ug/ml、棕榈酸甲酯(c16)的loq为3.6ug/ml、硬脂酸甲酯(c18)的loq为3.5ug/ml、花生酸甲酯(c20)的loq为3.6ug/ml、山嵛酸甲酯(c22)的loq为3.0ug/ml、木蜡酸甲酯(c24)的loq为1.2ug/ml。6次进样loq溶液中各脂肪酸甲酯的峰面积rsd(％)为2.2，4.0，2.2，1.8，1.9，1.3，0.74、2.3，4.8，3.3；方法精密度中肝素钠样品溶液中各脂肪酸甲酯含量的rsd(％)结果：c8：11％，c14：11％，c16：4.4％，c18：7.6％；标准加入样品溶液中各脂肪酸甲酯含量的rsd(％)分别为：1.1％，0.91％，1.3％，2.0％，0.79％，0.53％，0.47％，1.9％，1.5％，2.3％；中间精密度12次测量的各脂肪酸甲酯含量的rsd分别为：8.1％，12％，15％，8.0％，
6.6％，11％，7.3％，3.4％，5.2％，2.1％。方法准确度各水平浓度下各脂肪酸甲酯每次检测回收率为70-130％；耐用性(初始柱温55℃、65℃，升温速度2.5℃/min、3.5℃/min，流速3.5ml/min、4.5ml/min)各结果均符合规定，证明该方法可行。
[0102]
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。