专利名称：改进的生物标本图象分析仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的生物标本图象分析仪。
在本世纪八十年代，对癌症的诊断检测取得了重大突破，诞生了细胞图象分析技术Image cytometry(简称ICM技术)，美国CAS公司在九十年代初期推出了生物图象分析仪(CAS-200)，见USP4741043，4887892的报道。该分析仪是根据人体正常细胞DNA的含量是一个恒值，质量值为7.18pg(1pg＝10-12)的原理，以7.18pg为基准值(常用Di值＝1表示)来比对测量出Di＞1的异倍体，并用分布直方图及各种测量数据结果来提供癌变的各种定量特征，专门编制了一套识别挑选软件程序，以几何形态与光密度二项参数从数学模式上建立7.18pg标准，然后以形态、面积、光密度大小去找相符合的参照细胞。但是这样的测定误差较大，操作繁琐，不利于临床诊断。
其主要原因是(1)采用非人体的参照细胞定制的特殊载玻片，操作复杂，成本高，例如在USP4741043中报道了CAS-200采用鼠肝细胞为量值传递比对测量的基准。由于作为样本的鼠肝细胞参照片，是一群离散性很大的单体细胞。其中有二倍体的正常细胞，也有大量异倍体的异常细胞。而仪器是以数学模式来挑选基准细胞的。它必然有一个挑选区间参数，并规定了定标的细胞数大于20个但最多不超过128个，这就是通过大量标准细胞取平均值来达到规范系统量化差异。因此这种基准建立的本身就存在误差，更何况不能直接反映与人体正常细胞的量值关系，因此在实际应用时，制造企业必须对每套出厂仪器用人体正常细胞作计量，使用该设备的用户也必须定期与生产厂取得标准计量，是非常繁琐的，尤其当设备使用中出现故障，更将影响测试的准确性。(2)除了设备本身制造误差外，还存在量值传递标准产生的误差。由于每次使用仪器检测均需要一片样本参照细胞载玻片，每张载玻片的参照细胞不可能是简单的重复，因此带来了量值传递的误差。(3)由于采用标准片上制作的已知光密度标记规定仪器背景视场灰度值为195级时，(以0-255级为整个灰度级)该标记灰度值是32级而造成的误差。这是因为该方法只使投射在载玻片上的光强是恒定的，面透过载玻片的背景光强就会因细胞画面的内容变化而不同。也就是说只有以载玻片中特殊标记为画面内容时，其透过背景光的灰度值才是195级。而作为样本的鼠肝细胞参照片，每幅画面内容的离散性很大，往往一幅画面只能挑选个别数量的细胞，因此必须取多幅画面，大量的选取。由此可见误差的大小直接跟被选取画面图象的内容有关，与操作者的水准、工作态度也相关。(4)由于仪器只能接受鼠肝细胞为基准，因此一旦测量发生争议时，就无法在仪器上采用其它合理措施了，同时仪器的使用也受鼠肝细胞载玻片所束缚。(5)采用一定数量基准细胞积分光密度峰值与仪器内部预设存贮的光密度区间值产生修正染色差异的因子误差。同样是因为基准细胞光密度值的建立也是为被摄取的图象内容有关，与人为的因素有关，甚至在同一张载玻片中会获得差异因子，存贮光密度值区间范围越大，浓度差识别越钝化。
本发明的目的在于克服上述缺点，设计一种新的ICM分析系统，使该分析仪的成本降低、使用方便、分析层次提高、准确性强。
本发明提供了一种改进的生物标本图象分析仪，其特点是提供了新的ICM分析系统(即DNA图象定量分析系统)。该系统取消了参照细胞的特殊载玻片，采用仪器本身储存的正常人体细胞DNA值为基准的原始起点值传递基准，同时改进了原有仪器采用标准片上制作的已知光密度标记灰度，而采用人体正常细胞基准染色灰度或其它辅助组织如鸡血细胞、人体正常淋巴细胞、淋巴切片细胞的基准染色灰度完成仪器背景灰度的定标，从面减少了量值传递标准产生的误差，提高了修正浓度差异的准确性。
本发明提供一种改进的生物标本图象分析仪，该分析仪具有新的ICM分析技术系统，该系统主要由下列部份组成(1)建立人体正常血液组织细胞数据库a.取人体正常的血液组织细胞，采用DNA染色剂碱性品红染色，b.仪器从制成的涂片中选取单核细胞，c.选择至少5只以上的人体正常血液中的单核细胞图象，并储存在计算机中，d.在挑选单核细胞的过程中，设定其质量为7.18pg来建立标准细胞群的平均测量基准，并储存在计算机中，e.用挑选的单核细胞的灰度峰值作为修正染色浓度差异时的基准，编入计算病理细胞质量的程序中，f.系统存储有至少二种以上染色剂的信息内容，例如碱性品红或Feulgem Azure A及与其相配的滤玻片入为560nm或630nm(波长)，(2)建立辅助细胞组织数据库a.辅助细胞制片与选择的人体正常单核细胞制片同批染色，经处理后分别存储在计算机中，以供在测量病理片时作比对参考，b.以人体单核细胞为基准，检测辅助细胞的各项定量参数和质量的直方图，将此信息同时储存在辅助细胞组织数据库，c.将各辅助细胞的质量峰值作为设定值，建立各种辅助细胞的基准档案存储在辅助细胞组织的数据库；(3)仪器背景灰度定标a.检查系统背景视场灰度值及稳定性采用灰度测试软件，其测量灵敏度小于1级，取样时间不大于1秒，并把显示屏的显象平面最少划为512×512个象素点，一次取样象素面积不小于15×15象素点，系统在正常工作状态下，检查几乎整个显象平面内反映的视场背景灰度值及稳定性，b.检查系统线性特征系统在正常工作状态下，采用多阶梯灰度标准片，由灰度测试软件来检查显微镜光源强度的线性变化，反映在系统高分辨率显视屏上灰度值的线性变化，c.背景视场灰度的定标以人体正常细胞标准片(本发明是采用经DNA染色的血液涂片中的单核细胞设定重量为7.18pg)来调整显微镜光源强度，即显微镜的电源电压大小和摄象头手控增益电位器的位置，用灰度值测试软件来调试高分辨率图象显视器上的背景视场灰度值，上述灰度值必须低于255级饱和值，一般低30级以上，产品按各自配置的实际情况在调试上是一个定值。这一条与显微镜正常工作状态的调整，(即照明方式不局限于库勒照明)，作为设定菜单程序中决定背景视场灰度值定标一一对应的基本步骤。也是每次测试状态的定标基准，对于数据库中量值传递途径的生物组织，也以此定标方法类推；d.采用辅助细胞制成的标准样本细胞，(以DNA染色)来检查修正系统的各项测试指标的误差。
上述改进的ICM分析系统中所述的辅助细胞可以为鸡血细胞、鼠肝细胞、人体正常淋巴细胞或各种分类癌变细胞。
本发明改进的生物标本图象测试仪比CAS-200的测试效果有显著的提高，误差并明显减少，通过下列比较试验可以证明
1.测试样品名称非哺乳动物的鸡血细胞2.测试项目①DNA峰值质量及其误差②DNA平均值及其偏移值3.测试方法将样品分别在本发明改进的生物标本图象测试仪及CAS-200上各测试10次，每次测100只细胞。
4.测试结果①DNA峰值质量及误差本发明改进的生物标本图象测试仪，误差全部＜5％，CAS-200其中误差＞5％的占60％，最大误差达15％。
②DNA平均值及其编移值本发明改进的生物标本图象测试仪的偏移值最大为1.66％，CAS-200的偏移值最小为2.27％。
本发明改进的生物标本图象分析仪，不仅提高了修正浓度差异的准确性，而且背景视场灰度的定标与被测病理制片所摄取的画面背景灰度更吻合，更接近实际测试状态。因其操作方便、成本低、准确性高，能直接应用于临床，有利于ICM技术设备的推广普及。据估计每年我国癌症患者约达400万人，该仪器将为检测癌症创造条件，有益于人类医学事业的发展。
实例1、1.取人体正常的血液组织细胞制片染色。a)染色剂采用DNA染色剂。b)仪器从制成的涂片中选取单核细胞。c)采取图象处理技术选择25只人体正常血液中的单核细胞图象，并储存在计算机中。d)在挑选单核细胞的过程中，设定其质量为7.18pg来建立标准细胞群的平均测量基准，并储存在计算机中。e)用这些单核细胞的灰度峰值作为修正染色浓度差异时的基准，编入计算病理细胞质量的程序中去。
2.建立鸡血细胞组织数据库。a)制备鸡血细胞制片。b)把鸡血细胞制片与上一条中的人体正常单核细胞制片同批染色，经处理后分别存储在计算机中，以供在测量病理片时作比对参考。c)以人体单核细胞为基准，检测出这些鸡血细胞的各项定量参数和质量的直方图，把这些信息同样存储在细胞组织数据库。
3.仪器背景灰度定标。a.检查系统背景视场灰度值及稳定性采用灰度测试软件，其测量灵敏度小于1级，取样时间不大于1秒，并把显示屏的显象平面最少划为512×512个象素点，一次取样象素面积不小于15×15象素点，系统在正常工作状态下，检查几乎整个显象平面内反映的视场背景灰度值及稳定性，b.检查系统线性特征系统在正常工作状态下，采用多阶梯灰度标准片，由灰度测试软件来检查显微镜光源强度的线性变化，反映在系统高分辨率显视屏上灰度值的线性变化，c.背景视场灰度的定标以人体正常细胞标准片(本发明是采用经DNA染色的血液涂片中的单核细胞设定重量为7.18pg)来调整显微镜光源强度，即显微镜的电源电压大小和摄象头手控增益电位器的位置，用灰度值测试软件来调试高分辨率图象显视器上的背景视场灰度值。上述灰度值必须低于255级饱和值。一般低30级以上。产品按各自配置的实际情况在调试上是一个定值。这一条与显微镜正常工作状态的调整，(即照明方式不局限于库勒照明)，作为设定菜单程序中决定背景视场灰度值定标一一对应的基本步骤。也是每次测试状态的定标基准。对于数据库中量值传递途径的生物组织，也以此定标方法类推，d.采用辅助细胞制成的标准样本细胞，(以DNA染色)来检查修正系统的各项测试指标的误差。
实例2、按实例1同样方法操作，但不同的是选用鼠肝细胞建立鼠肝细胞组织数据库。
实例3、按实例1同样方法操作，但不同的是选用人体正常淋巴细胞建立人体正常淋巴细胞组织数据库。
实例4、按实例1同样方法操作，但不同的是选用肝癌细胞建立肝癌细胞组织数据库。
权利要求
1.一种改进的生物标本图象分析仪，其特征在于该分析仪具有一种ICM(Image cytometry)分析技术系统，该系统主要由下列部份组成(1)建立人体正常血液组织细胞数据库a.取人体正常的血液组织细胞，采用DNA染色剂碱性品红染色，b.仪器从制成的涂片中选取单核细胞，c.选择至少5只以上的人体正常血液中的单核细胞图象，并储存在计算机中，d.在挑选单核细胞的过程中，设定其质量为7.18pg来建立标准细胞群的平均测量基准，并储存在计算机中，e.用挑选的单核细胞的灰度峰值作为修正染色浓度差异时的基准，编入计算病理细胞质量的程序中，f.系统存储有至少二种以上染色剂的信息内容，例如碱性品红或Feulgem Azure A及与其相配的滤玻片入为560nm或630nm(波长)，(2)建立辅助细胞组织数据库a.辅助细胞制片与选择的人体正常单核细胞制片同批染色，经处理后分别存储在计算机中，以供在测量病理片时作比对参考，b.以人体单核细胞为基准，检测辅助细胞的各项定量参数和质量的直方图，将此信息同时储存在辅助细胞组织数据库，c.将各辅助细胞的质量峰值作为设定值，建立各种辅助细胞的基准档案存储在辅助细胞组织的数据库；(3)仪器背景灰度定标a.检查系统背景视场灰度值及稳定性采用灰度测试软件，其测量灵敏度小于1级，取样时间不大于1秒，并把显示屏的显象平面最少划为512×512个象素点，一次取样象素面积不小于15×15象素点，系统在正常工作状态下，检查几乎整个显象平面内反映的视场背景灰度值及稳定性；b.检查系统线性特征系统在正常工作状态下，采用多阶梯灰度标准片，由灰度测试软件来检查显微镜光源强度的线性变化，反映在系统高分辨率显视屏上灰度值的线性变化；c.背景视场灰度的定标以人体正常细胞标准片(本发明是采用经DNA染色的血液涂片中的单核细胞设定重量为7.18pg)来调整显微镜光源强度，即显微镜的电源电压大小和摄象头手控增益电位器的位置，用灰度值测试软件来调试高分辨率图象显视器上的背景视场灰度值，上述灰度值必须低于255级饱和值，一般低30级以上，产品按各自配置的实际情况在调试上是一个定值。这一条与显微镜正常工作状态的调整，(即照明方式不局限于库勒照明)，作为设定菜单程序中决定背景视场灰度值定标一一对应的基本步骤。也是每次测试状态的定标基准，对于数据库中量值传递途径的生物组织，也以此定标方法类推；d.采用辅助细胞制成的标准样本细胞，(以DNA染色)来检查修正系统的各项测试指标的误差。
2.根据权利要求1所述的一种改进的生物标本图象分析仪，其特征在于其中所述的辅助细胞组织可以为鸡血细胞、鼠肝细胞、人体正常淋巴细胞或各种分类癌变细胞。
全文摘要
本发明涉及一种改进的生物标本图象分析仪。该仪器的特征是提供了新的ICM(Image cytometry)分析系统，采用仪器本身设有正常人体细胞DNA值的标准及量值传递途径，并建立各种生物组织的数据库。操作简便、成本低、准确性高，宜于临床使用。
文档编号G01N33/53GK1164648SQ9611635
公开日1997年11月12日 申请日期1996年5月7日 优先权日1996年5月7日
发明者顾康庭, 刘志敏, 郑建英, 郭钧锋, 李玉梅, 陈丽华, 肖翔麟 申请人:德中贸易(上海)有限公司