一种丝网印刷型多位点酶电极及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于新型生物传感器技术领域，具体是一种丝网印刷型多位点酶电极及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 在生物传感器领域，酶电极占有重要的地位。酶电极是指将活性物质酶固定在电 极表面，探测电流型或电位型催化反应信号，具有酶的分子识别和催化功能，又有电化学电 极响应快，操作简便的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度。
[0003] 在酶电极研宄的基础上引入了电子介体修饰的方法，不同的电子介体，如小分子 染料、二茂铁系化合物、氧化还原聚合物等，可以改变电极电位，促使了在酶反应过程中产 生的电子于酶的活性中心和电极表面之间转移，提高酶电极反应过程的电流响应，且排除 其它活性物质的干扰。电子介体在近来得到迅速发展，使用的电子介体根据作用机理，将其 分为了两类：第一类是含有过渡金属元素的化合物或配合物，包括二茂铁及其衍生物，锇、 钉及其配合物，铁氰酸盐和过渡金属纳米材料等，通过过渡金属价态的改变，促使电极和酶 之间的电子传递；第二类是有机化合物，通改变分子中特殊官能团的结构进行传递电子，包 括了有机染料，导电有机盐，四硫富瓦烯（TTF)，醌及其衍生物，富勒烯等。此外，金属纳米 离子也属于电子介体的一种。电子介体性质对酶电极具有影响，采用的锇-聚乙烯基吡啶 (Os(bpy) 22 (PVP) 1(IC12,Os-PVP)具有了良好生物相容性，保障酶的活性，且优异的电荷转移 性能提高了电极表面的电子传输效率，相比于游离扩散型的电子介体，在反应过程中不易 流失，保障了电流信号的强度。可以降低检测时水体中还原性物质的干扰等特点。所以选 择适当的介体修饰酶电极，以获得较好的实验结果。
[0004] 在实际应用的分析中通常将样品滴加到这类电极的工作区域或直接把电极放入 样品液中。近来出现了流动注射分析（FIA)与丝网印刷生物传感器联用技术，为了提供 多步骤化学反应，简化分析流路操作，在实际应用的在线和过程分析工作中，顺序注射分析 (SIA)和电化学生物传感器联用技术得到了关注。如Ledru等采用FIA与电化学丝网印刷 电极结合检测HRP-SPCE与H202体系间电子直接转移，该方法提高了传感器分析的精确度和 灵敏度。如Gomes等采用SIA与钼电极电化学生物传感器结合检测L-乳酸；Niculescu等 采用喷壁式FIA和SIA与石墨棒及丝网印刷脱氢酶电极结合监测酒发酵过程中的乙醇。与 FIA相比，SIA检测系统中泵阀到检测器间管道较短，消耗试剂较少，可通过注射泵定量抽 吸实现多步骤的定量反应与分析，且不需要因为检测项目变化而改变流路系统，有利于提 供自动实时的在线监测。采用SIA与酶传感器联用的技术，能够简化实验步骤，节约试剂， 灵敏度高，实现自动在线检测。
[0005] 根据丝网印刷电极上固定酶数量的不同，可以分为单位点酶电极和多位点酶电 极。单位点酶电极的缺点主要是检测物质不全，或容易出现假阳性或者假阴性。多位点酶 电极是用固定在同一丝网电极上的多种酶催化连续或同时发生的多个反应，多位点酶电极 可以扩大酶电极选择检测底物的范围、调整酶电极电位、提高检测性能，且具有了更加快速 简单测定，多位点酶电极采用不同酶对底物有不同的电流响应，具有单酶电极难以达到的 性能，有很大的应用潜能。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种丝网印刷型多位点酶电极及其制备方法和应用。该多 位点酶电极在检测分析环境中有机污染物上具有简便快捷特点；为环境污染物快速测定提 供了一种准确，灵敏及自动化的检测技术；为复杂的环境检测手段扩宽了检测范围及选择 性。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] -种丝网印刷型多位点酶电极，包括基底电极，所述基底电极表面的多位点固定 有酶；所述基底电极为丝网印刷电极；所述酶为氧化酶。
[0009] 作为本发明进一步的方案：所述氧化酶包括辣根过氧化物酶和漆酶。
[0010] 所述丝网印刷型多位点酶电极的制备方法，步骤为：
[0011] (1)以碳浆印刷碳电极层，碳电极层印刷完毕后烘干；再印刷绝缘层，绝缘层印刷 完毕后烘干；超声清洗后晾干即得到丝网印刷电极，待用；
[0012] (2)用磷酸盐缓冲液配制辣根过氧化物酶酶液和漆酶酶液；将这两种酶液分别与 戊二醛溶液和牛血清白蛋白溶液混匀，得到辣根过氧化物酶混合液和漆酶混合液；
[0013] (3)将辣根过氧化物酶混合液、漆酶混合液、辣根过氧化物酶酶液、漆酶酶液中的 一种或多种，顺序滴加到丝网印刷电极的每一个工作区域，然后干燥密封反应，即得到丝网 印刷型多位点酶电极。
[0014] 作为本发明进一步的方案：用浓度为0.lmol/L、pH= 7. 0的磷酸盐缓冲液配制 lg/L的辣根过氧化物酶酶液；用浓度为0.lmol/L、pH= 4. 5的磷酸盐缓冲液配制lg/L漆 酶酶液；戊二醛溶液的质量浓度为〇. 3 % ;牛血清白蛋白溶液的浓度为1?2g/L。
[0015] 一种应用丝网印刷型多位点酶电极制备的多位点酶生物传感器，包括对电极以及 作为工作电极的丝网印刷型多位点酶电极。
[0016] 一种应用丝网印刷型多位点酶电极检测酚类化合物的方法，以循环伏安或计时电 流的方法测定溶液中底物浓度；底物为H202和酚类化合物，H202和酚类化合物浓度范围均为 0? 1?1.Ommol/L;采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0? 05?0? 25mol/L，pH= 4. 0? 8. 0〇
[0017] 作为本发明进一步的方案：所述酚类化合物为邻苯二酚，邻苯二酚的浓度取 0. 8mmol/L,H202的浓度取 0? 6mmol/L〇
[0018] 作为本发明进一步的方案：所述缓冲液的浓度取0. 15mol/L，pH= 6。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0020] 本发明的酶电极以多种氧化酶联用分析酚类物质，利用戊二醛，BSA交联将锇聚合 物分别与HRP、漆酶混合后固定于四位点电极上，加入H202作为辅助，对两种酶共同反应强 的邻苯二酚底物进行检测，对酚类化合物提供较好的分析能力和抗干扰能力。本发明的多 位点酶电极制作方法简单，成本低廉，操作工艺简单，电子和酶之间电子传递速率高；本发 明的检测灵敏度高，快捷准确，节约试剂；采用SIA与丝网印刷型电化学生物传感器联用方 法，提供更有利的在线长期实时检测环境，可以用于湖泊、水库、河流、污水处理厂、农药厂 等的污染快速监测，也可以用于蔬菜等食品中有机磷农药残留的快速检测。在制备单酶位 点电极或是二者联用的酶电极应用中，提高了生物传感器的检测灵敏度及测定范围，使得 检测结果更为快速准确。
【附图说明】
[0021] 图1为四位点电极示意图；
[0022] 图2为四位点电极的pH影响；
[0023] 图3为四位点电极的缓冲液浓度影响；
[0024] 图4为四位点电极的邻苯二酚底物浓度影响；
[0025] 图5为四位点电极H202的浓度影响；
[0026] 图6a_6d邻苯二酚不同浓度下四位点酶电极的电流响应；
[0027] 图7a_7d为四位点酶电极的电流响应与邻苯二酚浓度的线性关系；
[0028] 图8为四位点两种酶电极的平均电流峰值比较；
[0029] 图中：1和2为对电极，3为工作电极。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。如无特殊说 明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0031] 一种丝网印刷型多位点酶电极，包括基底电极，所述基底电极表面的多位点固定 有酶；所述基底电极为丝网印刷电极；所述酶为氧化酶，包括辣根过氧化物酶（HRP)和漆 酶。
[0032] 所述丝网印刷型多位点酶电极的制备方法，步骤为：以碳浆印刷碳电极层，碳电极 层印刷完毕后，将碳电极层放入90°C的烘箱中，保温30min;再印刷绝缘层，绝缘层印刷完 毕后，放入90°C的烘箱中，保温15min;再放入水中超声清洗3min，然后取出用水清洗，晾 干即得到丝网印刷电极，待用；用浓度为0.lmol/L、pH= 7. 0的磷酸盐缓冲液（PBS)配制 lg/L的辣根过氧化物酶酶液和浓度为0.lmol/L、pH= 4. 5的磷酸盐缓冲液（PBS)配制lg/ L漆酶酶液，以及相应的质量浓度为0. 3%的戊二醛溶液；用水配制分别配置1?2g/L的 牛血清白蛋白（BSA)溶液；将这两种酶液分别与戊二醛溶液和牛血清白蛋白溶液按照1 : 0. 5-2:0. 5-2的