食用油过氧化值酶生物传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体是食用油过氧化值酶生物传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002] 油脂在加工、贮藏、流通、使用等过程中，由于光、热和空气中的氧等作用常会发生 酸败变质的复杂变化。一般油脂尤其是富含不饱和脂肪酸的植物油在空气中氧的作用下会 氧化酸败，在氧化过程中生成过氧化物和氢过氧化物等中间产物，它们很容易分解而产生 挥发性和非挥发性脂肪酸、醛、酮和醇等，这些酸败产物常具有特殊的臭气和苦涩滋味，大 大影响油脂的感官性质，并且造成其营养价值大大下降。油脂中的脂质过氧化物的含量是 以每千克油脂中活性氧的毫克当量即过氧化值来表示的，过氧化值是判断油脂新鲜程度和 质量等级的重要标准。
[0003] 食用油过氧化值的检测是确保油品质量的关键手段，国内外广泛使用的测定方法 主要有高效液相色谱法和化学滴定法。高效液相色谱法需使用大型仪器，实际成本高，难以 作为普查使用；而化学滴定法的反应时间长，步骤繁琐，试剂需提前一周以上时间配制，全 部手工操作，易受操作人员的人为因素干扰。碘量法（CB/T5538)是油脂过氧化值国际通用 的分析方法，简单易行，在普通化验室里就可以进行，但碘量法测定过程易受多种外界因素 的影响，如溶液的PH值、温度、加水量及摇动速度、滴定终点的判断等因素，使其测定值的 波动性大，重复性差，所以造成该法灵敏度低，同时存在取样量大，难以适应于现代社会所 提出的精确、快速、便携、现场化的食品安全检测理念。
[0004] 目前我国各防疫部门检测食用油过氧化值都按照GB/T5009. 37-1996规定的分 析方法（化学滴定法）。国内外相继发表了检测过氧化值的发明文献专利，如中国专利 (CN87106131. 7) "过氧乙酸测定试纸及其制备方法"涉及用试纸测定水溶性消毒液中的过 氧乙酸的含量；日本专利（53-30383) "油脂中过氧化物测定试纸的制备方法"是以可溶性 淀粉、碘化钾作为主要成分，都具有如下缺陷：对光和氧敏感，易失效；反应时间长，超过5 分钟；只能定性和半定量测量，不能测出准确的数值等。目前尚未见到有关采用丝网印刷技 术产业化制作一次性用于食用油过氧化值检测酶电极的相关报道。
[0005] 经对现在技术文献的检索发现，中国专利申请号03132054. 6名称为"一种制备二 氧化钛凝胶膜电化学生物传感器的方法"，该专利中采用二氧化钛凝胶膜对传统电极进行 修饰，然后采用电化学的方法来检测过氧化氢。该方法制备修饰电极的过程相当复杂，电极 的准备时间超过2小时，制备出的修饰电极稳定性差，修饰电极不能长期保存，当保存时间 超过一个月，电极的响应灵敏度下降超过25%，因而不能大范围推广使用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供了一种食用油过氧化值的酶生 物传感器的制备方法，使其易于产业化制作和一次性使用，并且大大缩短了样品处理和检 测时间，从而实现样品的现场、快速、精确检测。
[0007] 本发明的原理如下：
[0008] 油脂属于低导电或非导电的、疏水性的物质，因此研宄测定油脂的过氧化物成分， 就是在有机相中测定有机过氧化物，就需要制备有机相过氧化物酶电极。本发明利用壳聚 糖良好的成膜性和较好的粘结能力以及其内部的极性化学基团，将辣根过氧化物酶（HRP) 固定在酶生物传感器检测电极中工作电极的表面，制成能够对食用油过氧化值进行快速检 测的电流型生物传感器，食用油中的过氧化物与酶底物在HRP的催化作用下发生氧化还原 反应，产生电子迀移，形成电流，电流强度与过氧化物浓度成正比，检测范围为lmeq/kg? 60meq/kg〇
[0009] 在于电极连线与对电极连成一体组成另一条电极基片，两条电极基本相互平行， 电极连线表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，两条电极基本设置在电极基片上，接线端子和 对电极均为裸露的导电材料薄膜，在相互平行的对电极和工作电极两端覆盖有隔离片，隔 离片与对电极、工作电极垂直放置，隔离片上部覆盖盖片，电极、隔离片和盖片之间的空隙 形成加样孔。本发明涉及一种应用丝网印刷电极检测食用油过氧化值的酶生物传感器的制 备方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤一，在酶生物传感器检测电极的工作电极上采用丝网印刷法印刷一层壳聚糖 膜，晾干后在电极的工作电极上印刷辣根过氧化物酶、缓冲溶液、膨胀剂、酶保护剂的混合 浆液，50°C干燥；辣根过氧化物酶的浓度为0. 5?6. 5mg/mL。使用丝网印刷机，使酶膜的厚 度达到1?4ym。
[0011] 步骤二，将上述烘干的电极板再次印刷含有酶底物3,3,5,5-四甲基联苯胺、反应 促进剂噻挫、表面活性剂0P-10、膨胀剂等的混合浆液，50°C干燥，粘贴上隔离片，然后盖上 盖片，在10-25°C环境下保存酶生物传感检测电极；所述表面活性剂可选用十二烷基硫酸 钠或0P-10或吐温20。反应促进剂是苯并噻唑的衍生物，分子结构为：R3C6HmN:C(R4)S;其 中m= 3-4 ;R3=H，CH3,C2H5;R4=H，OH，SH，NH2。酶底物是联苯胺的衍生物，分子式为： [1^孔顺2] 2;其中m= 2-4,Ri=H，CH3,C6H5,CH30,NH2;R2=H，CH3。
[0012] 步骤三，将待测的食用油样品与萃取液等体积混合形成反应液，并将生成的反应 液滴加到酶生物传感器检测电极的加样孔中；萃取试剂为选自30?70% (w/w)的甲醇水 溶液、乙醇水溶液、异丙醇水溶液和葵醇水溶液中的一种或两种以上的组合。
[0013] 步骤四，检测工作电极与对电极之间的电流，若电流在电流检测仪的检测范围之 内，则可通过电流检测仪自动处理转化，并与单片机中储存的标准曲线进行比对，转化为过 氧化值的浓度，直接由显示器显示出检测结果，若电流低于或高于电流检测仪的检测范围， 则显示器显示过氧化值的浓度低于检测范围的最小值或高于检测范围的最大值；所述电流 检测仪的检测范围为lmeq/kg-60meq/kg。
[0014] 与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0015] 1、本发明具有丝网印刷电极结构简单，加工方法简便、成本低，用该丝网印刷电极 制成的传感器检测过氧化值操作方便，样品前处理简单，检测时间短，只需5秒，抗干扰能 力强，检测灵敏度高。而且酶电极电化学分析法中修饰电极由于可以固定化和修饰电活性 物质，有效地提高了其选择性、可以有效消除其他物质的干扰。
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