用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于猪瘟检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法。
【背景技术】
[0002]猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热性、接触性传染病。我国采用免疫猪瘟兔化弱毒疫苗很好地预防和控制了猪瘟在我国的大规模流行，但近年来猪瘟又有卷土重来、死灰复燃的迹象，目前仍是危害我国养猪业的主要传染病之一。病原学检测方法因其病毒分离时间长，要求条件高，分离率低等因素的影响，很难对样品进行大批量检测；而采集样品进行血清学试验，对仪器设备和操作人员有较高的要求，不易于在基层的推广。胶体金免疫层析技是20世纪90年代发展起来的一种新型体外诊断技术。该诊断方法快速简便，操作简单，无需仪器，结果准确。其基本原理是利用微孔滤膜的渗透浓缩和毛细层析作用，使抗原抗体在固相膜上反应，然后用胶体金标记的抗体显色，阳性反应在膜上呈现红色，阴性反应则不出现红色。
[0003]目前，通常使用猪瘟反转录聚合酶链反应进行猪瘟检测，具体操作步骤如下:
[0004]1、样品采集:动物病死或扑杀后，取扁桃体、淋巴结和脾组织，-20°C冷藏。
[0005]2、样品处理:所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5生理盐水收集于离心管内，_70°C反复冻融三次，7000r/min，离心5分钟，取上清液。
[0006]3、RNA提取:依照Omega公司RNA提取试剂盒的操作程序提取总RNA。
[0007]4、RT-PCR操作程序:依照TakaRa公司的一步法RNA PCR试剂盒操作程序进行。
[0008]扩增条件为:50°C，反转录30分钟，94°C变性5分钟，进入循环，94°C 50秒，72°C 60秒，40个循环后72°C延伸10分钟。
[0009]5、RT-PCR产物检测:扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下与标准分子量比较，如见585bp片段，初步诊断为阳性。
[0010]现有技术的缺点
[0011]RT-PCR扩增过程中，需要用到的Taq酶，同时因为试验用引物的合成等原因，导致试验成本较高；组织处理步骤、RT-PCR扩增步骤致使试验时间过长；凝胶电泳过程中所使用的染色剂EB (溴化乙锭)具有高致癌性。
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于提供一种用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡及其制备和使用方法，旨在解决RT-PCR扩增过程存在的试验成本较高、试验时间过长、染色剂EB具有高致癌性的问题。
[0013]本发明是这样实现的，一种用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡，该用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡包括:PVC底板、样品垫、金标记抗体玻璃纤维膜、硝酸纤维素包被膜、吸水纸、检测线、质控线；
[0014]涂覆每毫升金标记抗体溶液涂覆10平方厘米的玻璃纤维素膜胶体金颗粒标记抗猪瘟病毒的单克隆抗体的金标记抗体玻璃纤维膜；
[0015]硝酸纤维素包被膜的底面粘贴在PVC底板上面，硝酸纤维素包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸，玻璃纤维膜远离硝酸纤维素包被膜的一端的上面粘贴样品垫，硝酸纤维素包被膜的上面设有检测线包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体，质控线包被抗鼠抗体，硝酸纤维素包被膜为硝酸纤维素膜，检测线包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体；抗猪瘟病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于硝酸纤维素包被膜上并呈两条线平行排列，形成检测线、质控线，通过检测线和质控线的显色来进行定性。
[0016]本发明的另一目的在于提供一种用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡的制备方法，该用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡的制备方法包括以下步骤:
[0017]步骤一，胶体金溶液的制备，将双蒸水置磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，按终浓度为万分之二的量迅速加入浓度为I %的氯金酸溶液，煮沸5分钟；再按所加入氯金酸溶液
1.8倍的体积量加入浓度为I %的柠檬酸三钠溶液，煮沸10分钟后，冷却至室温，用双蒸水定容至氯金酸终浓度为万分之二，常温避光保存备用；
[0018]步骤二，金标抗体玻璃纤维膜的制备，用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按25 μ g抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗猪瘟病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5 %体积量加入浓度为10 %的BSA溶液，混匀，静置5分钟，1000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用；
[0019]步骤三，硝酸纤维素包被膜的制备，在硝酸纤维素膜上喷涂抗猪瘟病毒的单克隆抗体及抗鼠IgG抗体，并呈两条线平行排列，分别形成检测线和质控线，37°C烘干处理2小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用；
[0020]步骤四，大板组条，各组分规格(长X宽):PVC底板:30cmX7.6cm;样品垫:30cmX 3.0cm ;金标记抗体玻璃纤维膜:30cmX0.7cm ;硝酸纤维素包被膜:30cmX2.0cm ;吸水纸:30cmX3.2cm ；
[0021]步骤五，用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度为4毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“ + ”号，无非特异性条带；
[0022]步骤六，将I份已切好的试纸条、一包干燥剂和一根塑料滴管装在铝箔袋内，用封口机密封，密封完毕后放入试剂盒中，常温干燥保存。
[0023]进一步，在步骤二中，10% BSA溶液、标记洗涤液和金标抗体保存液的具体组分配比如下:
[0024]10% BSA溶液:每100mL双蒸水中含牛血清白蛋白10g ；
[0025]标记洗涤液??每100mL双蒸水中含牛血清白蛋白4g，2g聚乙二醇8000，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.21 lg，并调节pH至8.1 ；
[0026]金标抗体保存液:每100mL双蒸水中含牛血清白蛋白25g，5g聚乙二醇8000，Tris 10.2g，氢氧化钠2.5g，7.5mL吐温-20，并调节pH至8.5。
[0027]进一步，在步骤三中:
[0028]检测线，调试喷膜仪，喷液量为I μ 1/cm,用包被缓冲液稀释抗猪瘟病毒的单克隆抗体，浓度为2.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线；
[0029]质控线，调试喷膜仪，喷液量为I μ 1/cm,用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
[0030]进一步，包被缓冲液的具体组分配比为??每100mL双蒸水中含牛血清白蛋白0.0lg，十二水合磷酸氢二钠30.072g，磷酸二氢钾2.176g。
[0031]进一步，在步骤四中，组分按如下方法进行组条:将硝酸纤维素包被膜的底面粘贴在PVC底板上，在硝酸纤维素包被膜两端的上面分别粘贴金标记抗体玻璃纤维膜和吸水纸，在金标记抗体玻璃纤维膜远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；即在PVC底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标记抗体玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸，组成大板；组装车间的湿度要控制在30%以下。
[0032]本发明的另一目的在于提供一种用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡的使用方法，该用于检测猪瘟的快速诊断检测试纸卡的使用方法包括以下步骤:
[0033]步骤一，用棉签蘸取鼻腔分泌物或取血液检测；
[0034]步骤二，鼻腔分泌物，将棉签浸入样品稀释液试管，搅拌混匀后，静置，用一次性滴管取上清液作为检测液；
[0035]步骤三，血清，采血1ml，1500转/分钟，离心，用一次性滴管取血清作为检测液；
[0036]步骤四，将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温；
[0037]步骤五，将试纸卡水平放置，用滴管向试纸卡孔逐滴加