两栖类趾骨石蜡切片制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对动物骨骼处理的方法，具体为两栖类趾骨石蜡切片制作方法。
【背景技术】
[0002]年龄结构是研宄生物种群数量变化的重要基础，对于有害动物的防治、野生生物资源的保护和利用、以及濒危动物种群的拯救和恢复具有重要的意义。骨骼的生长与营养状况、代谢水平、生长状况、环境因子等相关，从而使骨组织疏密程度不一，呈现轮环特点。因此，骨骼的轮环是动物年龄鉴定的重要材料和依据，如脊椎骨关节凹面的轮环。
[0003]研宄发现两栖类趾骨也呈现出轮环特征，其年龄与趾骨上的环轮数相一致。利用趾骨上的环轮数来进行两栖类的年龄鉴定可以最大程度的减少对动物的伤害，实现动物资源的可持续利用。因此，利用趾部骨组织石蜡切片来鉴别两栖类年龄的方法已被普遍采用。通常趾部骨组织石蜡切片方法步骤繁琐、耗时长、操作复杂，且染色效果难以得到保证，直接影响到两栖类种群年龄的判定。
【发明内容】
[0004]针对上述技术问题本发明提供一种，操作步骤简单的两栖类趾骨石蜡切片制作方法，具体的技术方案为:
[0005]两栖类趾骨石蜡切片制作方法，包括以下步骤:
[0006](I)用10%的生理盐甲醛溶液将已除去外表皮肤和肌肉组织的两栖类趾骨固定保存，时间为2-4小时；
[0007](2)用5-10%的生理盐硝酸溶液或质量浓度为5-10%的硝酸水溶液将固定后的两栖类趾骨脱钙，时间为24-48小时；
[0008](3)用Harris苏木精染色液将脱钙后的趾骨整体染色140分钟，染色方法为褪回染色法；
[0009](4)然后按常规手段对趾骨进行脱水、透明、包埋、切片、贴片、封片处理。
[0010]所述10%生理盐甲醛溶液，为每1ml的甲醛溶液加上90ml生理盐水，甲醛溶液浓度为37-40%，即福尔马林溶液，生理盐水为质量浓度0.65%氯化钠溶液。
[0011]所述的Harris苏木精染色液的质量浓度为0.5%。
[0012]所述的两栖类趾骨为后肢第四趾，即最长趾。
[0013]本发明所提供的两栖类趾骨石蜡切片制作方法，通过简化操作步骤、优化各步骤制作时间、调整染色步骤、采用褪回染色方法，提高染色效果。本方法克服了传统方法的步骤繁琐、耗时长、操作复杂，且染色效果难以得到保证，直接影响到两栖类种群年龄判定的准确性等问题。本方法操作简单、耗时少、染色效果好，适应于科研和野生动物保护工作中对大规模、批量化的两栖类趾骨石蜡切片制作的要求，提高了种群年龄鉴定的准确率。
【附图说明】
[0014]图1为传统方法制得的蛾眉树蛙两栖类趾骨石蜡切片观察图；
[0015]图2为本实施例蛾眉树蛙两栖类趾骨石蜡切片观察图。
【具体实施方式】
[0016]结合附图和实施案例对本发明作进一步说明。
[0017](I)取材、固定:
[0018]取蛾眉树蛙的第四趾，除去外面的皮肤和肌肉组织，用10%生理盐甲醛溶液固定2-4小时；
[0019](2)脱钙，即软化:
[0020]用5-10%的生理盐硝酸溶液或5-10%的硝酸水溶液将固定后的样本脱钙，时间约24-48小时，直至骨组织软化为止，用针能够轻轻刺入骨组织；
[0021](3)染色，整染法:
[0022]用Harris苏木精染色将脱钙后的样本进行整体染色140分钟，染色方法为褪回染色法，特点是将被染材料浸入浓度较高的染液中，使其染色过度，然后再用化学药剂进行褪色或分色，除去组织中多余的染料，达到所需要的色度。在褪回染色法中，为了在脱色后切片颜色得到更鲜明的分化，过染时间一般延长一些。
[0023](4)流水蓝化:
[0024]将染色好的样本用流水蓝化30分钟。
[0025](5)脱水:
[0026]将蓝化好的样本先分别放入70%和80%的乙醇溶液中各脱水一小时，再放入I %曙红酒精溶液中染5-10分钟，I %曙红酒精溶液为每I克曙红加入100毫升95%的乙醇溶液中配制而成；然后再用95%的乙醇溶液脱水一小时，同时可以洗去多余的红色，最后经无水酒精中脱水一小时。
[0027](6)透明:
[0028]用二甲苯与酒精1:1的混合液透明15分钟，放入纯二甲苯透明30分钟，其间更换一次溶液。
[0029](7)浸蜡:
[0030]该步骤在恒温箱中进行，将透明好的样本浸入二甲苯与石蜡1:1的混合液中，置于高于石蜡熔点2度的恒温箱中保持半小时，然后将蛙趾骨移入装有纯石蜡的蜡杯中浸蜡一小时，其间更换一次蜡杯。
[0031](8)包埋:
[0032]在包埋纸盒中的石蜡处于半凝固状态时，立即将已浸好蜡的趾骨按照一定的顺序竖放在纸盒中，此时纸盒中的蜡还未完全浸没趾骨，应立即继续加入溶化的蜡直到浸没趾骨。
[0033](9)切片
[0034]将包埋好的样本切成厚度为12-13 μm的薄片，切片厚度与染色时间和分色时间成正相关，薄的切片相对于厚的切片颜色浅一些。
[0035](10)贴片和展片
[0036]a.贴片时，在载玻片上涂上少量粘贴剂，加少许蒸馏水于涂平的粘贴剂表面，使其均匀散开成一薄层；
[0037]b.将蜡带分割成适当的小段或小蜡片，光滑面向下，排列于粘帖剂表面的蒸馏水层上；
[0038]c.将载玻片平稳拿起，用酒精灯在下面微微加热，蜡带小段因受热而展平；
[0039]d.展片后，适当倾斜，让多余的蒸馏水流去，或用吸水纸吸掉。
[0040](11)烤片:
[0041]将贴好蜡带的载玻片放在37到40°C的恒温箱中，烤片5-10小时，蜡片牢固地贴在载玻片上。
[0042](12)脱蜡
[0043]将烤干的石蜡切片置于盛有二甲苯的容器中，溶掉其上的石蜡，需30-40分钟，时间长短与温度相关。
[0044]图1为传统方法制得的蛾眉树蛙两栖类趾骨石蜡切片观察图，图2为本实施例蛾眉树蛙两栖类趾骨石蜡切片观察图，从两幅图对比可以看出，本实施例制得的切片骨内的轮环线清晰可见，提高了年龄鉴定的准确率；并且制片时间缩短，效率提高。
【主权项】
1.两栖类趾骨石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)用10%的生理盐甲醛溶液将已除去外表皮肤和肌肉组织的两栖类趾骨固定保存，时间为2-4小时； (2)用5-10%的生理盐硝酸溶液或质量浓度为5-10%的硝酸水溶液将固定后的两栖类趾骨脱钙，时间为24-48小时； (3)用Harris苏木精染色液将脱钙后的趾骨染色140分钟，染色方法为褪回染色法； (4)然后按常规手段对趾骨进行脱水、透明、包埋、切片、贴片、封片处理。
2.根据权利要求1所述两栖类趾骨石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(I)中所述10%生理盐甲醛溶液，为每1ml的甲醛溶液加上90ml生理盐水，生理盐水为质量浓度0.65%氯化钠溶液。
3.根据权利要求1或2所述两栖类趾骨石蜡切片制作方法，其特征在于，步骤(3)中所述的Harris苏木精染色液的质量浓度为0.5%。
【专利摘要】本发明涉及一种对动物骨骼处理的方法，具体为两栖类趾骨石蜡切片制作方法，用10％的生理盐甲醛溶液将两栖类趾骨固定保存，再进行脱钙，用Harris苏木精染色液将脱钙后的趾骨用褪回染色法染色、脱水、透明、包埋、切片、贴片、封片处理。该方法操作简单、耗时少、染色效果好，适应于科研和野生动物保护工作中对大规模、批量化的两栖类趾骨石蜡切片制作的要求，提高了种群年龄鉴定的准确率。
【IPC分类】G01N1-28
【公开号】CN104764645
【申请号】CN201510208343
【发明人】廖文波, 米志平, 曾燏
【申请人】西华师范大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月27日