一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法，包括取材、固定、漂洗、脱水、树脂渗透、包埋、聚合、修块、半薄切片和染色等步骤，其特点是：①采用了4%多聚甲醛--2.5%戊二醛固定液二次固定技术；②使用了粘度很低、渗透能力很强的伦敦白胶（LRWhite）树脂作为包埋剂；③建立了一种成熟种子的干切技术；④建立了一种45℃--60℃二级展片法。本发明克服了常规方法制作的成熟种子切片严重卷曲、无法展片、容易破碎以及无法进行碘染色的缺点，能够获得组织、细胞结构完整、清晰，反差明显的谷物成熟种子树脂切片，从而为研究成熟种子的结构和功能提供了准确的技术支持。
【专利说明】一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及显微组织切片【技术领域】，特别是涉及一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法。
【背景技术】
[0002]谷物包括水稻、小麦、玉米等禾本科植物，它们的种子是粮食、饲料和工业原料的主要来源。在谷物中，胚乳是种子的重要组成部分，它的主要贮藏物质为淀粉和蛋白。淀粉在淀粉体中积累，贮藏蛋白在蛋白体中积累。谷物种子中淀粉、蛋白的含量和比例决定了谷物的营养价值，对谷物的加工和利用具有重要影响，因此研究种子胚乳中的淀粉和蛋白对提高种子的品质和产量具有重要的意义。
[0003]在食品、饲料和工业领域大量使用的是谷物成熟种子，而目前对谷物种子形态结构的研究主要集中在种子的发育阶段，对成熟种子的研究还鲜有报道，主要由于:①随着种子的发育和灌浆充实，淀粉含量逐渐逐渐升高，种子逐渐变硬，包埋剂很难渗透，导致切片容易破碎；②传统的切片方法需要制作水槽进行展片和捞片，而成熟种子由于内部较致密，切片会严重卷曲，在水槽里无法展开；③传统的切片方法无法切下完整的成熟种子断面，只能切下零碎的区域，对研究种子内各成分的区域分布带来了困难。因此亟需对现有的切片制作方法进行改良和优化，发明一种谷物成熟种子的切片制作方法。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有切片制作方法的不足，本发明提供了一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法。
[0005]本发明所采用的技术方案如下:
[0006](I)取材:选取粒形正常的谷物成熟种子，小心剥去颖壳，取出完整颖果备用；
[0007](2)固定:
[0008]①配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(p H7.4)+80mL10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液；
[0009]②将所取颖果浸泡在固定液中，固定液的用量为样品体积的40倍,放于4°C冰箱中固定12h，使颖果软化和初步固定；
[0010]③再用锋利的刀片将软化的颖果从中部横断开，切取颖果中部Imm厚的组织块，再次浸泡于固定液中，放于4°C冰箱中固定48h,使组织和细胞充分固定。
[0011](3)漂洗:吸去固定液，用0.1M磷酸缓冲液漂洗固定后的颖果，共漂洗5次，每次30min,充分洗去固定液。
[0012](4)脱水:配制浓度为30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度对颖果逐级脱水，每级15min。
[0013](5)树脂渗透:
[0014]①配制伦敦白胶(LRW hite)树脂:40mL树脂+0.8g催化剂(Benzoyl Peroxide),磁力搅拌使充分溶解，放于4°C冰箱24h后使用；
[0015]②配制浓度为25%、50%和75%的树脂乙醇溶液:树脂和无水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0016]③按照25% -50% -75% -100% -100%的梯度对颖果逐级渗透，每级12h。
[0017](6)包埋:将渗透完的颖果横断面朝下放于包埋模具内，缓慢注入纯树脂浸没颖果，避免出现气泡。
[0018](7)聚合:将包埋模具放在烘箱内，60°C聚合1-2天(时间必须控制在2天之内，防止引起树脂皱缩，导致切片困难)，使树脂硬化。
[0019]⑶修块:
[0020]①先用锉刀将样品表面包埋剂磨去，露出颖果。
[0021]②然后将包埋块夹在切片机的样品夹上，顶端露出2_，在体视显微镜下用锋利的刀片在颖果的四周以和水平面成45°的角削去包埋剂，其侧面修成锥形体，样品的正面修成上下边平行的多边形。
[0022](9)半薄切片:
[0023]①安装玻璃刀，放在刀夹中夹紧；
[0024]②调整好包埋块和玻璃刀的位置，在体视镜下对刀，使刀锋和样品面对齐:
[0025]a)打开底部的背光灯，关闭其他照明灯，进刀使样品面与刀锋靠近，可以看见样品面上出现一个亮条，利用这个亮条判断样品与刀是否对齐；
[0026]b)先调整样品面上下两条边与刀锋平行:观察亮条的上下两条边是否平行，若不平行，则调整样品夹旋转旋钮，使其平行。
[0027]c)再调整样品面的左右与刀锋平行:观察亮条的左右两条边是否等长，若不等长，则调整刀锋旋转旋钮，使其相等。
[0028]d)最后调整样品面的上下与刀锋平行:上下移动样品面，观察亮条左右两条边的长度是否变化，若有变化，则调整样品面旋转旋钮，使其长度不变；
[0029]③对刀完成后，进刀使刀锋与样品接近，样品面下缘与刀锋等高，转动样品臂升降钮使样品臂上下运动，使刀锋刚好切到组织为止。
[0030]④切片厚度设为2微米，进行手动切片:右手缓慢转动样品臂升降钮开始切片，在切片的整个过程中，左手拿睫毛笔轻轻放在切片前端边缘的正上方，防止其卷曲。此过程最为关键，左手要始终保持稳定，防止睫毛碰到刀锋或戳破切片；
[0031]⑤取干净的载玻片，滴加蒸馏水，用镊子小心夹住切片边缘，将切片以和水平面成45 °角轻轻放在水滴上,45 V加热板上干燥,使切片展平。
[0032]⑥将切片放于烘箱中，60°C 12h，防止染色过程中脱片。
[0033](10)染色:
[0034]①碘液配制:5g碘+1g碘化钾+85mL蒸馏水，完全溶解后用50%甘油稀释80倍作为染液。
[0035]②番红-甲基紫染液配制:a)番红染液:lg番红+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸馏水。
[0036]③考马斯亮蓝R250染液配制:lg考马斯亮蓝R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
[0037]④碘染色(染淀粉，呈蓝紫色):滴加碘液后避光静置lOmin，用盖玻片封片后显微镜下观察；
[0038]⑤番红-甲基紫染色(染结构):
[0039]a)切片放于加热板上加热至55°C ；
[0040]b)滴加番红染液染色12min ；
[0041]c)水洗5min，加热板上烘干；
[0042]d)滴加甲基紫染液染色5min ；
[0043]e)水洗5min，加热板上烘干后显微镜下观察。
[0044]⑥考马斯亮蓝R250染色(染蛋白，呈深蓝色):
[0045]a)切片放于加热板上加热至55°C ；
[0046]b)滴加7%醋酸处理5min ；
[0047]c)滴加考马斯亮蓝R250染液染色1min ；
[0048]d)滴加7%醋酸,分色2min ；
[0049]e)水洗5min，加热板上烘干后显微镜下观察。
[0050]切片经碘液、番红-甲基紫染液或考马斯亮蓝R250染液染色后，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像。
[0051]与现有切片制作方法相比，本发明的优势在于:
[0052](I)建立了适用于多种谷物成熟种子的树脂切片制作方法。
[0053](2)采用了 4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液二次固定技术，先对整个种子进行软化和预固定，再将种子切薄后进行再次固定，这样可以完好地保存成熟种子的细胞结构。
[0054](3)使用了粘度很低、渗透能力很强，并且亲水性也很强的树脂伦敦白胶(LR White)作为包埋剂，它可以用于体积很大、内部很致密的成熟种子包埋，并且方便各种水性染料进入，染色效果极佳，使用非常方便。
[0055](4)建立了一种成熟种子干切技术，在切片过程中无需制作水槽，可以直接对包埋块进行干切，简化了步骤。
[0056](5)可以完整地切下颖果的整个断面，克服了常规方法会使切片严重卷曲、无法展片以及容易破碎的缺点。
[0057](6)建立了 45°C -60°C二级展片法，成熟种子切片与载玻片粘合牢固，在染色过程中不会脱片。
[0058](7)该方法制成的切片可以用碘液对淀粉粒进行特异性染色，而Epon812、Spurr’ s树脂制成的切片无法用碘液进行染色，只能用PAS (高碘酸-希夫试剂)法对淀粉粒进行染色。PAS法染色的淀粉粒容易变形，并且清晰度和反差都很低，不利于淀粉粒结构的观察，而碘染色的淀粉粒结构清晰，反差明显，更利于观察。
【专利附图】
【附图说明】
[0059]图1为水稻种子包埋块修块后表面的形状；
[0060]图2为切片过程关键步骤的示意图，其中，A:睫毛；B:切片前端；C:玻璃刀锋；D:包埋块正面；
[0061]图3为碘染色成熟水稻种子切片的显微照片，其中，1:淀粉体；2:淀粉粒；
[0062]图4为番红-甲基紫染色成熟水稻种子切片的显微照片，其中，1:淀粉体；2:淀粉粒;3:细胞壁；
[0063]图5为考马斯亮蓝R250染色成熟水稻种子切片的显微照片，其中，4:蛋白体。
【具体实施方式】
[0064]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0065]实施例1:
[0066](I)取材:从稻穗上取下水稻成熟种子，用解剖针小心剥去颖壳，取出完整颖果，挑选10粒粒形正常的颖果放于青霉素瓶中备用；
[0067](2)固定:
[0068]①配制0.2mol/L磷酸缓冲液(P H 7.4):
[0069]a)母液A (0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):称取71.64g Na2HP04.12H20，用蒸馏水定容至100mL ；
[0070]b)母液B (0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液):称取31.21g Na H2P04.2H20，用蒸馏水定容至100mL ；
[0071]c)按照A液:B液=81:19的比例混合，调节p H至7.4。
[0072]②配制10%多聚甲醛水溶液:
[0073]a)称取20g多聚甲醒于250mL三角锥形瓶中，加入200mL蒸懼水,放入25*9mm规格的磁力搅拌子；
[0074]c)配制0.lmol/L氢氧化钠水溶液:称取40mg氢氧化钠于1mL离心管中，加入1mL蒸馏水，混合均匀；
[0075]d)向锥形瓶中逐滴滴加0.lmol/L氢氧化钠水溶液至多聚甲醛水溶液恰好澄清；
[0076]e)冷却至室温,调节P H至7.4。
[0077]③配制4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液:100mL 0.2mol/L磷酸缓冲液(p H7.4)+80mL10%多聚甲醛水溶液+20mL 25%戊二醛水溶液充分混匀，调节p H至7.4。
[0078]④往青霉素瓶中加入1mL 4%多聚甲醛-2.5 %戊二醛固定液，使颖果浸泡在固定液中，放于4°C冰箱中固定12h，使颖果软化和初步固定；
[0079]⑤用镊子取出颖果，用锋利的刀片将软化的颖果从中部横断开，切取颖果中部1_厚的组织块，再次浸泡于青霉素瓶中的固定液中，放于4°C冰箱中固定48h，使组织和细胞充分固定。
[0080](3)漂洗:
[0081]①配制0.lmol/L磷酸缓冲液(p H 7.4): 10mL 0.2mol/L磷酸缓冲液+10mL蒸馏水，充分混匀。
[0082]②用干净的吸管小心吸去固定液，不要碰到颖果断面，再用0.lmol/L磷酸缓冲液漂洗固定后的颖果，共漂洗5次,每次30min,充分洗去固定液。
[0083](4)脱水:配制浓度为30 %,50 %,70 %和90 %的乙醇水溶液，按照30% -50% -70% -90% -100% -100%的梯度对颖果逐级脱水:每级 1mLjj^K 15min。
[0084](5)树脂渗透:
[0085]①配制伦敦白胶(LR W hite)树脂:量取40mL树脂于50mL离心管中，称取0.8g催化剂(Benzoyl Peroxide)倒入离心管中,磁力搅拌20min使充分溶解,放于4°C冰箱24h后使用；
[0086]②配制浓度为25%、50%和75%的树脂乙醇溶液:树脂和无水乙醇按照1:3、1:1和3:1的比例混配而成；
[0087]③按照25% -50% -75% -100% -100 %的梯度对颖果逐级渗透:每级5mL，放于4°C冰箱，渗透12h。
[0088](6)包埋:用镊子轻轻夹住颖果侧面，将横断面朝下放于包埋模具内，用200mL移液枪缓慢注入纯树脂浸没颖果，避免出现气泡。
[0089](7)聚合:将包埋模具放在烘箱内，60°C聚合1-2天(时间必须控制在2天之内，防止引起树脂皱缩，导致切片困难)，使树脂硬化。
[0090](8)修块:
[0091]①先用锉刀将样品表面包埋剂磨去，露出颖果。
[0092]②然后将包埋块夹在切片机的样品夹上，顶端露出2mm，在体视显微镜下用锋利的刀片在颖果的四周以和水平面成45°的角削去包埋剂，其侧面修成锥形体，样品的正面修成上下边平行的六边形，如图1所示。
[0093](9)半薄切片:
[0094]①安装玻璃刀，放在刀夹中夹紧；
[0095]②调整好包埋块和玻璃刀的位置，在体视镜下对刀，使刀锋和样品面对齐:
[0096]a)打开底部的背光灯，关闭其他照明灯，进刀使样品面与刀锋靠近，可以看见样品面上出现一个亮条，利用这个亮条判断样品与刀是否对齐；
[0097]b)先调整样品面上下两条边与刀锋平行:观察亮条的上下两条边是否平行，若不平行，则调整样品夹旋转旋钮，使其平行；
[0098]c)再调整样品面的左右与刀锋平行:观察亮条的左右两条边是否等长，若不等长，则调整刀锋旋转旋钮，使其相等；
[0099]d)最后调整样品面的上下与刀锋平彳丁:上下移动样品面，观察売条左右两条边的长度是否变化，若有变化，则调整样品面旋转旋钮，使其长度不变；
[0100]③对刀完成后，进刀使刀锋与样品接近，样品面下缘与刀锋等高，转动样品臂升降钮使样品臂上下运动，使刀锋刚好切到组织为止。
[0101]④切片厚度设为2微米，进行手动切片:右手缓慢转动样品臂升降钮开始切片，在切片的整个过程中，如图2所示，包埋块的正面D匀速、缓慢地下移，玻璃刀锋C逐渐切下切片，左手拿睫毛笔轻轻放在切片前端B边缘的正上方，防止其卷曲。此过程最为关键，左手要始终保持稳定，防止睫毛A碰到刀锋或戳破切片；
[0102]⑤取干净的载玻片，滴加蒸馏水，用镊子小心夹住切片边缘，将切片以和水平面成45 °角轻轻放在水滴上,45 V加热板上干燥,使切片展平。
[0103]⑥将切片放于烘箱中，60°C烘12h，防止染色过程中脱片。
[0104](10)染色:
[0105]①碘液配制:5g碘+1g碘化钾+85mL蒸馏水，完全溶解后用50%甘油稀释80倍作为染液。
[0106]②番红-甲基紫染液配制:
[0107]a)番红染液:Ig番红+1mL 95%乙醇溶解，再定容至10mL ；
[0108]b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+10mL蒸馏水。
[0109]③考马斯亮蓝R250染液配制:lg考马斯亮蓝R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
[0110]④碘染色(染淀粉，呈蓝紫色):滴加碘液后避光静置lOmin，用盖玻片封片后显微镜下观察；
[0111]⑤番红-甲基紫染色(染结构):
[0112]a)切片放于加热板上加热至55°C ；
[0113]b)滴加番红染液染色12min ；
[0114]c)水洗5min，加热板上烘干；
[0115]d)滴加甲基紫染液染色5min ；
[0116]e)水洗5min，加热板上烘干后显微镜下观察。
[0117]⑥考马斯亮蓝R250染色(染蛋白，呈深蓝色):
[0118]a)切片放于加热板上加热至55°C ；
[0119]b)滴加7%醋酸处理5min ；
[0120]c)滴加考马斯亮蓝R250染液染色1min ；
[0121]d)滴加7%醋酸,分色2min ;
[0122]e)水洗5min，加热板上烘干后显微镜下观察。
[0123]切片经碘液、番红-甲基紫染液或考马斯亮蓝R250染液染色后，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像，如图3、图4和图5。图3为切片经碘液染色，显示出水稻胚乳细胞内完整和清晰的淀粉粒2，多个多角形淀粉粒2排列组成淀粉体I。图4为切片经番红-甲基紫染液染色，显示清晰的细胞壁3、淀粉体I和淀粉粒2，图5为切片经考马斯亮蓝R250染液染色，显示胚乳细胞内完整和清晰的蛋白体4。
【权利要求】
1.一种谷物成熟种子的树脂切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取材:谷物成熟种子，剥去颖壳，取完整颖果； (2)固定:将所取颖果浸泡在4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中24 h，使颖果软化；将软化的颖果横断开，切取颖果中部I mm厚的组织块，再次浸泡于4%多聚甲醛一2.5%戊二醛固定液中48 h，使组织和细胞充分固定； (3)漂洗:用0.1 M磷酸缓冲液漂洗固定后的颖果，充分洗去固定液； (4)脱水:用30%-50%-70%-90%-100%-100%乙醇对颖果逐级脱水，每级15min ； (5)树脂渗透:用25%-50%-75%-100%-100%伦敦白胶树脂对颖果逐级渗透，每级12h ； (6)包埋:将渗透完的颖果放于包埋模具内，注入纯树脂； (7)聚合:将包埋模具放在烘箱内，60°C聚合1-2天，使树脂硬化； (8)修块:对包埋块进行手工修块，将颖果周围多余树脂削去； (9)半薄切片:用超薄切片机切厚度为2微米切片，将切片转移到载玻片上的水滴上，将载玻片放在45°C加热板上干燥，使切片展平； (10)染色:展平的切片经碘液、番红-甲基紫染液或考马斯亮蓝R250染液染色，在光学显微镜下观察，可获得分辨率高、反差适中的图像。
2.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定液的配方为:100 mL 0.2mol/L pH 7.4磷酸缓冲液、80 mL 10%多聚甲醛水溶液和20 mL 25%戊二醛水溶液。
3.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固定液的用量为样品体积的40倍，固定的温度为4°C。
4.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(5)中，所述25%-50%-75%树脂为100%伦敦白胶树脂与100%乙醇分别按1:3、1:1和3:1的体积比混配而成。
5.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(6)中，所述颖果包埋时必须保持断面朝下，加入纯树脂时必须缓慢加入，防止产生气泡。
6.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(8)中，所述修块的具体过程为: ①先用锉刀将样品表面包埋剂磨去，露出颖果； ②然后将包埋块夹在切片机的样品夹上，顶端露出2mm，在体视显微镜下用锋利的刀片在颖果的四周以和水平面成45--的角削去包埋剂，其侧面修成锥形体，样品的正面修成上下边平行的多边形。
7.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(9)中，所述半薄切片的切片方法中，直接对包埋块进行干切，完整地切下颖果的整个断面。
8.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(9)中，所述半薄切片的切片方法为: ①安装玻璃刀，放在刀夹中夹紧； ②调整好包埋块和玻璃刀的位置，在体视镜下对刀，使刀锋和样品面对齐: a)打开底部的背光灯，关闭其他照明灯，进刀使样品面与刀锋靠近，可以看见样品面上出现一个亮条，利用这个亮条判断样品与刀是否对齐； b)先调整样品面上下两条边与刀锋平行:观察亮条的上下两条边是否平行，若不平行，则调整样品夹旋转旋钮，使其平行； C)再调整样品面的左右与刀锋平行:观察亮条的左右两条边是否等长，若不等长，则调整刀锋旋转旋钮，使其相等； d)最后调整样品面的上下与刀锋平行:上下移动样品面，观察亮条左右两条边的长度是否变化，若有变化，则调整样品面旋转旋钮，使其长度不变； ③对刀完成后，进刀使刀锋与样品接近，样品面下缘与刀锋等高，转动样品臂升降钮使样品臂上下运动，使刀锋刚好切到组织为止； ④切片厚度设为2微米，进行手动切片:右手缓慢转动样品臂升降钮开始切片，在切片的整个过程中，左手拿睫毛笔轻轻放在切片前端边缘的正上方，防止其卷曲； 此过程最为关键，左手要始终保持稳定，防止睫毛碰到刀锋或戳破切片； ⑤取干净的载玻片，滴加蒸馏水，用镊子小心夹住切片边缘，将切片以和水平面成45--角轻轻放在水滴上，45°C加热板上干燥,使切片展平； ⑥将切片放于烘箱中，60°C12h，防止染色过程中脱片。
9.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(10)中，所述染液的配方为: ①碘液:5g碘+1g碘化钾+85mL蒸馏水，完全溶解后用50%甘油稀释80倍作为染液； ②番红-甲基紫染液: a)番红染液:lg番红+10mL 95%乙醇溶解，再定容至100 mL ； b)甲基紫染液:0.5g甲基紫+100 mL蒸馏水； ③考马斯亮蓝R250染液:lg考马斯亮蓝R250+7%醋酸水溶液，60°C溶解。
10.根据权利要求1所述的切片制作方法，其特征在于，步骤(10)中，所述染色方法为:①碘染色:滴加碘液后避光静置10min，用盖玻片封片后显微镜下观察；淀粉呈蓝紫色； ②番红-甲基紫染色: a)切片放于加热板上加热至55°C； b)滴加番红染液染色12min ； c)水洗5min,加热板上烘干； d)滴加甲基紫染液染色5min ; e)水洗5min，加热板上烘干后显微镜下观察； ③考马斯亮蓝R250染色: a)切片放于加热板上加热至55°C； b)滴加7%醋酸处理5min ； c)滴加考马斯亮蓝R250染液染色10min ；d)滴加7%醋酸，分色2 min ； e)水洗5 min，加热板上烘干后显微镜下观察，蛋白呈深蓝色。
【文档编号】G01N1/30GK104374601SQ201410743579
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】韦存虚, 蔡灿辉, 赵凌霄 申请人:扬州大学