，50nM 标记亚油酸（linoleic acid 简称 LA)，50nM 标 记亚麻酸（linolenic acid简称LNA)或50nM标记花生四稀酸（arachidonic acid简称 ARA)。在第一反应体系中，这些脂肪酸只包含其中之一即可。
[0057] 其中，被14C标记的脂肪酸溶液是预先按被14C标记的脂肪酸：牛血清蛋白（BSA)= 3:2(摩尔比）单独配制后，再加入至第一反应体系中。其中，所述脂肪酸包括但不限于棕榈 酸、油酸、亚油酸、亚麻酸或花生四烯酸等之任意一种。
[0058] 第二反应体系含有 83. 3mM KC1，16. 7mM MgCl2,0. 7mM EGTA，13. 3mM H印es，13. 3mM DTT，5mM ATP，0.2mM NAD+，0.2mM CoA，2.6mM KCN 和 0.38mM rotenone、和被 14C 标记的脂肪 酸溶液。
[0059] 其中，被14C标记的脂肪酸溶液的配制方法同上，预先按脂肪酸：牛血清蛋白（BSA) = 3:2(摩尔比）单独配制后，再加入至第二反应体系中。其中，所述脂肪酸包括但不限于 棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等之任意一种。其中，被 14C标记的脂肪酸溶液包 括：50nM 14C 标记棕榈酸（palmitic acid 简称 PA)，50nM 标记油酸（oleic acid 简称 0A)， 50nM 标记亚油酸（linoleic acid 简称 LA)，50nM 标记亚麻酸（linolenic acid 简称 LNA)， 50nM标记花生四稀酸（arachidonic acid简称ARA)。在第二反应体系中仅包含前述脂肪 酸的其中之一即可。
[0060] 具体地，将预先配制好的第一反应体系、第二反应体系，分别加入多个塑料试管 中，在一定的反应时间内可以同时进行测定，以评定组织偏好利用哪一种脂肪酸。本发明测 定方法实施的多个不同实验条件，见以下表1。
[0061] ②取适量新鲜蟹、奸的肝胰腺（hepatopancreas)与肌肉（muscle)，用冰浴鹿糖勾 浆液清洗3次，滤纸吸干多余水分。以如下比例（W: V单位：g/ml)冰浴机械匀浆：肝胰腺： 蔗糖匀浆液=1:10 ;肌肉：蔗糖匀浆液=1:20。制成的虾蟹匀浆液分别为含有蟹的肝胰腺 与蔗糖匀浆液的虾蟹匀浆液；含有虾的肝胰腺与蔗糖匀浆液的虾蟹匀浆液；含有蟹的肌肉 与蔗糖匀浆液的虾蟹匀浆液；含有虾的肌肉与蔗糖匀浆液的虾蟹匀浆液。
[0062] 分别向第一反应体系、第二反应体系中加入100 μ 1虾蟹匀浆液，在两种反应体 系中，均在25°C和35°C水浴环境中分别进行反应，持续反应，反应时间分别为肝胰腺组织 60min，肌肉组织30min。
[0063] 表 1
[0064]
【主权项】
1. 一种虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，包括以下步骤： ① 配置用于线粒体和过氧化物酶体反应的第一反应体系；配制用于抑制线粒体活性的 第二反应体系； ② 分别向所述第一反应体系、所述第二反应体系中加入虾蟹匀浆液，进行反应； ③ 分别向所述第一反应体系、所述第二反应体系中加入反应终止剂，过夜，抽滤后取上 清液，加入闪烁液； ④ 用入液闪仪测定其放射性强度，从而得到虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率。
2. 如权利要求1所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述第一 反应体系包含 80 ~85mM KC1，15 ~18mM MgCl2,0. 5 ~0. 9mM EGTA，12 ~14mM 4-羟乙基哌 嗪乙磺酸，12 ~14mM DTT，3 ~6mM ATP，0? 1 ~0? 2mM NAD+，0? 1 ~0? 2mM CoA，0? 4 ~0? 6M L-肉碱，0. 4~0. 6mM L-苹果酸，23~25 y M细胞色素C，以及40~50nM被14C标记的脂 肪酸溶液。
3. 如权利要求1所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述第二 反应体系包含 80 ~85mM KC1，15 ~18mM MgC12,0. 5 ~0. 9mM EGTA，12 ~14mM 4-羟乙基 哌嗪乙磺酸，12 ~14mM DTT，3 ~6mM ATP，0? 1 ~0? 2mM NAD+，0? 1 ~0? 2mM CoA，2 ~3mM KCN，0. 2~0. 4mM鱼藤酮，以及40~50nM被14C标记的脂肪酸溶液。
4. 如权利要求2或3所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述被 14C标记的脂肪酸溶液包含被 14C标记的脂肪酸与牛血清蛋白；其中，被14C标记的脂肪酸为 被14C标记的棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸或花生四烯酸之任意一种。
5. 如权利要求4所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述被14C 标记的脂肪酸与所述牛血清蛋白的摩尔比为1~1. 5:0. 5~1。
6. 如权利要求1所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述虾蟹 匀浆液包括蟹或虾的肝胰腺或肌肉、以及蔗糖匀浆液；其中，所述蟹或虾的肝胰腺与所述 蔗糖匀浆液的摩尔比为1~2:10~30 ;所述蟹或虾的肌肉与蔗糖匀浆液的摩尔比为1~ 2:10 ~20〇
7. 如权利要求6所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，其特征在于，所述步骤 ②中，反应在25°C~35°C下进行。
8. -种应用于如权利要求1所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中的反应体 系，其特征在于，所述反应体系含有：80~85mM KC1，15~18mM MgC12,0. 5~0. 9mM EGTA， 12 ~14mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，12 ~14mM DIT，3 ~6mM ATP，0? 1 ~0? 2mM NAD+，0? 1 ~ 0.2mM C〇A，0.4~0.6M L-肉碱，0.4~0.6mM L-苹果酸，23~25yM细胞色素C，以及40~ 50nM被14C标记的脂肪酸溶液。其中，所述被14C标记的脂肪酸溶液包含被14C标记的脂肪 酸与牛血清蛋白；其中，所述被 14C标记的脂肪酸为被14C标记的棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻 酸或花生四烯酸之任意一种。
9. 一种应用于如权利要求1所述的虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中的反应体 系，其特征在于，所述反应体系含有：80~85mM KC1，15~18mM MgC12,0. 5~0. 9mM EGTA， 12 ~14mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，12 ~14mM DIT，3 ~6mM ATP，0? 1 ~0? 2mM NAD+，0? 1 ~ 0. 2mM CoA，2~3mM KCN，0. 2~0. 4mM鱼藤酮，以及40~50nM被14C标记的脂肪酸溶液。 其中，所述被14C标记的脂肪酸溶液包含被 14C标记的脂肪酸与牛血清蛋白；其中，所述被14C 标记的脂肪酸为被14C标记的棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸或花生四烯酸之任意一种。
10. -种应用于如权利要求1所述虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中的试剂盒， 其特征在于，所述试剂盒包括第一反应体系、第二反应体系、虾蟹匀浆液、反应终止剂和闪 烁液。
【专利摘要】本发明提出了一种虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率的测定方法，其包括：配置第一反应体系、第二反应体系，向第一、第二反应体系中加入虾蟹匀浆液进行反应，反应终止后，取上清液，加入闪烁液，用入液闪仪测定其放射性强度，从而得到虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率。本发明间接反映虾蟹组织对脂肪酸的利用偏好，测定机体对脂肪酸进行β氧化的效率，作为衡量机体生存状态的直接敏感指标，还可以用于评定机体对脂肪酸利用效率，进而评定机体的代谢状况。
【IPC分类】G01N23-00
【公开号】CN104807837
【申请号】CN201510186016
【发明人】杜震宇, 马倩倩, 张南南, 陈立侨
【申请人】华东师范大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月17日