构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于KNbO3-Au NPsOBi2S3构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用KNbO3-Au NPs作为基底材料和Bi2S3作为发光材料，制备一种检测肿瘤标志物的无标记型电化学发光免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0002]癌症是一大类恶性肿瘤的统称。肿瘤的发病率高，生长和转移速度快，对人类的健康有极大的危害。肿瘤标记物是肿瘤细胞产生和释放的以抗原、酶、激素等形式的代谢产物，并可用于临床某些肿瘤的诊断和辅助诊断。因此，在临床研宄上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法引起人们的广泛关注。
[0003]目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析，时间分辨荧光免疫分析法等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特性相结合，使其具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
[0004]电化学发光免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，因此本发明制备了一种基于KNbO3-Au NPsOBi2S3电化学发光免疫传感器，实现了对肿瘤标志物的检测。
[0005]KNbO3纳米立方体具有比表面积大、无毒、生物相容性好等优点，Au NPs能够提高复合材料的导电性，从而提高电子传输能力。因此本发明将金纳米粒子修饰的KNbO3纳米立方体第一次被引入到免疫传感器的制备中，利用其生物相容性好，比表面积大，电子传递能力优异等特点，从而起到增强电化学发光信号的作用。Bi2S3纳米片具有低毒，光电转换效率高等特点。因此，本发明利用Au原子和Bi2S3中的硫原子之间的Au-S键的强相互作用将1(他03和Bi 2S3进行化学结合，制备了复合材料KNbO 3_Au NPsOBi2S3;通过Au原子较好的生物相容性，实现了抗体在电极表面的固定；将复合材料KNbO3-Au NPsOBi2S3引入传感器的制备中，构建了一种超灵敏的无标记型电化学发光免疫传感器。Bi2S3作为电化学发光材料第一次在免疫传感器中应用。复合材料KNbO3-Au NPsOBi2S3在检测过程中可产生良好的电化学发光信号，有效地降低了传感器的检出限，可用于多种肿瘤标志物的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前肿瘤标志物检测方法的不足。
【发明内容】
[0006](I)基于复合材料KNbO3-Au NPsOBi2S3，构建了一种无酶、快速且灵敏的无标记型电化学发光免疫传感器。
[0007](2)将该无标记型电化学发光免疫传感器应用于多种肿瘤标志物的检测。
[0008]本发明的技术方案如下:
1.一种基于KNbO3-Au NPsOBi2S3构建的电化学发光免疫传感器的制备方法
(1)将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
(2)取6μ?、4.0 ~ 12.0 mg/mL KNbO3-Au NPsOBi2S3壳聚糖溶液滴加到电极表面，室温下晾干；
(3)滴加6μ?,6 ~ 12 Pg/mL的肿瘤标志物抗体，超纯水冲洗电极表面，4 °0冰箱中干燥；
(4)滴加3μ?、质量分数为I ~ 2%的BSA溶液用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?,Ο.005 ~ 5 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，4 °〇冰箱中干燥，制得KNbO3-Au NPsOBi2S3构建的电化学发光免疫传感器。
[0009].KNbO3-Au纳米立方体基底材料的制备
准确称取0.63 g高纯氧化铌和86~88 g氢氧化钾分散在装有30 mL超纯水的玻璃瓶中，将溶液转移至密封的50 mL聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至150。C并维持72小时；反应结束后将产物冷却至室温，将这种合成物分别用超纯水和无水乙醇清洗至少3次，将获得的产物在35 ° C真空干燥箱中干燥备用；
准确称取0.4-0.6 g制备好的KNbO3粉末，分散于装有100 mL超纯水的玻璃瓶中，在持续搅拌的条件下，加入NH3.H2O,调整溶液pH为11，然后，向混合溶液中加入质量分数为1%的HAuCl4.4H20溶液，所得悬浮液加热至80 ° C并维持I小时，再对其进行离心处理，将得到的沉淀物用超纯水和无水乙醇清洗至少3次，将获得的产物在40 ° C真空干燥箱中干燥12小时，最后于管式炉中在300 T条件下高温煅烧I小时。
[0010].发光材料Bi2S3纳米片的制备
准确称取1.72 ~1.92g硝酸铋分散于装有25 mL乙二醇的玻璃瓶中，用氮气向溶液中吹气鼓泡15分钟，得到溶液A，与此同时，称取1.25-1.45g硫化钠分散于装有10 mL乙二醇和20 mL超纯水混合溶剂的玻璃瓶中，将混合液持续搅拌15分钟，得到溶液B ;在持续搅拌条件下，将溶液B逐滴加入到溶液A中；将1.922 g尿素和20 mL超纯水加入到混合溶液中，持续搅拌30分钟；将溶液转移至密封的50 mL聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至180° C并维持24小时；冷却至室温，然后将沉淀用超纯水和无水乙醇清洗至少3次；最后，将获得的产物在60。C真空干燥箱中干燥12小时。
[0011]肿瘤标志物的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 6.0 ~ 8.0包含有0.1 mol/L KCl和20 ~ 140 mmol/L K2S2O8^ PBS缓冲溶液中进行测试；
(2)用MP1-F流动注射化学发光分析仪对10mL、50 mmol/L的pH 7.5包含有0.1 mol/L KCl和100 mmol/L K2S2Oi^ PBS缓冲溶液中的分析物进行检测，扫描电压范围为-2 ~ OV，光电倍增管高压为800 V，扫描速率为0.1 V s-1;
(3)当峰值趋于稳定后，记录电化学发光光谱。
[0012]上述所述肿瘤标志物选自下列之一:前列腺特异性抗原PSA、甲胎蛋白AFP、甲状旁腺激素PTH鳞状细胞相关抗原SCCA、人核基质蛋白NMP-22、癌胚抗原CEA、人绒毛膜促性腺激素HCG、酸性磷酸酶ACP、人胎盘催乳素HPL、卵巢癌糖类抗原CA 125、乳腺癌易感基因CA15-3、糖蛋白抗原CA50、CA 19-9, CA549、CA72-4、细胞角蛋白、磷化蛋白p53、碱性磷酸酶ALP、神经原特异性烯醇化酶NSE、促肾上腺皮质激素ACTH、生长激素GH。
[0013]本发明的有益成果
(I) KNbO3为立方体结构，其大的表面积能够增加Au NPs在其表面的负载量，进而增加抗体的负载量。首次引入到免疫传感器制作，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。
[0014](2 )Bi2S3为片状结构，其具有强而稳定的电化学发光信号，首次作为电化学发光材料在免疫传感器中应用。
[0015](3)将KNbOjP Bi 2S3利用Au原子和Bi 2S3中的S原子之间的Au-S键的强相互作用结合起来，制备了复合材料KNbO3-Au NPsiBi2S3,从而较好的提高传感器的稳定性。
[0016](4)将壳聚糖应用到电化学免疫传感器的制备当中，利用其优异的成膜性能，防止了复合材料KNbO3-Au NPsOBi2S3从电极表面上脱落，同时利用壳聚糖具有很好的生物相容性和低毒性，有利于抗体在电极表面的固定。
[0017](5)本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
[0018](6)本发明制备的电化学发光免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测，对常见肿瘤标志物检测限可达3 pg/mL。
【具体实施方式】
[0019]实施例1 一种基于KNbO3-Au NPsOBi2S3电化学发光免疫传感器的制备