椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及三种中国特产浅色易结晶蜂蜜(椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜)的鉴别方法，属于食品科学领域。
【背景技术】
[0002]蜂蜜(honey)是由蜜蜂采集蜜源植物的花内蜜腺或花外蜜腺分泌物后，在蜜蜂物质与酶的作用下反复加工酿造而成的天然甜物质。除了葡萄糖、果糖等主要成分外，蜂蜜中还含有与蜜源植物种类密切相关的酚类、蛋白质、氨基酸和有机酸等微量活性物质，正是这些物质的存在使得蜂蜜具有抗菌消炎，抗氧化，抗肿瘤，保护心血管等功效。不同植物源的蜂蜜其化学成分、色泽、味道均会有差异，这些差异将影响其销量。
[0003]锻树蜜(Lindenhoney)、笤子蜜{Vicia villosa Roth honey)和油菜蜜(Rapehoney)均属我国特产蜜种。其中椴树蜜主产于我国东北地区，花期在六月中旬至七月中旬，蜂蜜呈透明浅琥珀色，香味浓郁，易结晶，结晶后细腻如脂，洁白晶莹，故又得名白蜜。笤子蜜主产于我国云南地区，又名雪脂莲蜜。苕子蜜未结晶时晶莹剔透，气味清香，结晶后颗粒较细，为乳白色。这两种蜂蜜颜色浅，味道好深受消费者青睐，然而受其产量影响，市场售价相对较高。油菜蜜在我国种植面积最广、产量最大，呈现浅琥珀色，带有油菜花香气，极易结晶。尽管其价格远低于椴树蜜和笤子蜜，但由于口味略差，需求量较低。然而油菜蜜结晶后色泽形态与上述两种蜂蜜非常相似，难以用感官进行鉴别，常被用于冒充高价蜂蜜。因而，建立一种可靠的方法来区分上述三种蜂蜜是控制这三种中国特产浅色易结晶蜂蜜质量的关键。
[0004]指纹图谱这一技术来源于法医学，其基础是采用色谱或色谱联用等技术建立样品共有特征性组分的特征图谱。高效液相色谱(HPLC)拥有高效的分离度，同时电化学检测器(ECD)对具有氧化还原性质的化合物具有很高的响应，所以HPLC与ECD联用可把复杂的蜂蜜成分进行分离而形成高低不同的峰，组成色谱图。谱图中的色谱峰代表了各种不同化学成分和其含量。因此HPLC-ECD指纹图谱可以对样品进行定量及定性的分析，进而对蜂蜜样品质量进行评价和控制。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种有效区分三种中国特产浅色易结晶蜂蜜的分析方法，该分析方法使用HPLC-ECD建立椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的指纹图谱，提取特征共有峰信息与化学计量学方法相结合来区分这三种浅色易结晶蜂蜜，从而控制椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的质量。
[0006]本发明的目的通过以下方案实现:
一种区分椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤:
(I)椴树蜜(14批次)、笤子蜜(11批次)和油菜蜜(15批次)样品溶解于蒸馏水中，调节PH至2，将所得蜂蜜样品水溶液注入填装有XAD - 2树脂的层析柱，依次用pH为2的盐酸水溶液，蒸馏水冲洗，最后甲醇洗脱，减压浓缩去除洗脱液甲醇，所得残渣用色谱纯甲醇溶解定容后作为供试样品溶液，4°C密封保存；
(2)吸取供试样品溶液进行HPLC- E⑶分析，将所得HPLC - E⑶色谱数据导入指纹图谱软件，建立椴树蜜(14批次)、笤子蜜(11批次)和油菜蜜(15批次)样品的指纹图谱；
(3)分析椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜样品的指纹图谱，得到大量共有峰信息，挑选峰面积大于500 nA*min的色谱峰作为特征共有峰，共计17个；
(4)以17个特征共有峰的峰面积为变量，运用化学计量学中的判别分析方法对蜂蜜样品进行分析，得到两个Fisher显著判别函数:
Y1=-0.047Χ!+1.199Χ2+0.022Χ3+1.498Χ4_0.076Χ5Y2=0.664Χ!+0.065Χ2+0.465Χ3+0.095Χ4-0.68IX5
第一个Fisher判别函数占总方差的97.3%，第二个占2.7%，二者占总方差的100%，所测蜂蜜样品得到区分。使用原始数据整体正确分类率100%，使用交叉验证方法正确率为100%，样品被准确分为三类；
(5)以17个特征共有峰的峰面积为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法对蜂蜜样品进行分析，三种蜂蜜样品均得到正确分类。
[0007]HPLC-ECD 色谱条件:色谱柱:Zorbax SB-C18 (250 X 4.6 mm, 5 Pm);流动相:甲醇和0.15%的甲酸水溶液；洗脱方式:梯度洗脱；流速1.0 mL/min ;检测电压:900 mV ;柱温:30 Γ。
[0008]本发明的优点及其积极效果:(I)本发明所用蜂蜜样品采自中国不同地区，经反复验证，该方法灵敏度高、分类效果好、可行性强，可以准确鉴别椴树蜜、苕子蜜和油菜蜜。
(2)HPLC对分析样品的分离效果好，且所使用的电化学检测器灵敏度优于常规的紫外检测器，检测限低，适用于分析具有氧化还原性质且含量低的化合物。(3)本发明建立了三种蜂蜜样品的HPLC - ECD指纹图谱并得到17个特征共有峰信息，可作为蜂蜜样品质量评价和控制的依据。(4)以三种蜂蜜样品的17个特征共有峰的峰面积为变量结合化学计量学方法，三种蜂蜜样品均得到正确分类。
【附图说明】
[0009]图1为A.14批次椴树蜜HPLC - E⑶指纹图谱；
图2为B.11批次苕子蜜HPLC - E⑶指纹图谱；
图3为C.15批次油菜蜜HPLC - E⑶指纹图谱；
图4为40批次蜂蜜样品判别分析图；
图5为40批次蜂蜜样品聚类分析图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图与实施例作进一步的说明。
[0011 ] 分别称取不同产地的椴树蜜(14批次编号L1-L14)，笤子蜜(11批次编号Vl-Vl I)和油菜蜜(15批次编号R1-R15)样品各10 g，置于100 mL烧杯中，加入60 mL蒸馏水充分溶解后用HCl调节pH至2 ;将蜂蜜样品水溶液注入装有Amberlite XAD - 2型吸附树脂的层析柱(30 cm X 2.5 cm)中，依次用150 mL pH值为2的酸性(HCl)水溶液，200 mL蒸馏水洗脱，去除糖类等极性物质，再用200 mL甲醇洗脱吸附在树脂上的酚类化合物，收集甲醇，42 °C减压浓缩至干，残渣用色谱纯甲醇定容至2 mL，所得溶液用0.45 ym微孔滤膜过滤后作为供试样品溶液，4 °C密封放置，供HPLC - E⑶分析。
[0012]HPLC-ECD 分析中色谱柱选用 Zorbax SB - C18 反相色谱柱(250 mmX4.6 mm, 5μπι),流动相A为甲醇，B为0.15%的甲酸水溶液；梯度洗脱程序如下:0 min - 10 minA 5% - 15% ； 10 min - 20 min A 15% ；20 min - 25 min A 15% - 17% ；25 min - 30 min A17% - 30% ；30 min - 50 min A 30% - 40% ；50 min - 60 min A 40% - 55% ；60 min - 70 minA 55%-80% ；70 min-75 min A 80% ;流动相流速为 1.0 mL/min ;进样量为 10 μ L ;检测电压为900 mVo
[0013]将所得HPLC - ECD色谱数据导入指纹图谱软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版)，分别建立椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜样品的HPLC - ECD指纹图谱，挑选峰面积大于500 nA*min的色谱峰作为特征共有峰共计17个，参见表1，图1椴树蜜，图2苕子蜜，图3
油菜蜜。
[0014]以17个特征共有峰的峰面积为变量，运用化学计量学中的判别分析方法和聚类分析方法对蜂蜜样品进行分析，样品均被分为三类，分别参见图4、图5。
[0015]根据上述方法，分别建立了椴树蜜(14批次)，笤子蜜(11批次)和油菜蜜(15批次)样品的HPLC-ECD指纹图谱，并分析样品的指纹图谱共有峰信息，挑选其中17个色谱峰作为特征共有峰，结合化学计量学中判别分析和聚类分析的方法，对蜂蜜样品进行分类分析，所测试样品的正确归类率达到100%。因此，本发明适用于三种中国特产浅色易结晶蜂蜜椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的鉴别。
【主权项】
1.一种区分椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤: (1)椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜样品溶解于蒸馏水中，调节PH至2，将所得蜂蜜样品水溶液注入填装有XAD - 2树脂的层析柱，依次用pH为2的盐酸水溶液，蒸馏水冲洗，最后甲醇洗脱，减压浓缩去除洗脱液甲醇，所得残渣用色谱纯甲醇溶解定容后作为供试样品溶液，4°C密封保存； (2)吸取供试样品溶液进行HPLC- E⑶分析，将所得HPLC - E⑶色谱数据导入指纹图谱软件，分别建立椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜样品的指纹图谱； (3)分析椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜样品的指纹图谱，得到大量共有峰信息，挑选峰面积大于500 nA*min的色谱峰作为特征共有峰，共计17个； (4)以17个特征共有峰的峰面积为变量，运用化学计量学中的判别分析方法对蜂蜜样品进行分析，得到两个Fisher显著判别函数:Y1=-0.047Χ!+1.199Χ2+0.022Χ3+1.498Χ4_0.076Χ5 Y2=0.664Χ!+0.065Χ2+0.465Χ3+0.095Χ4-0.68IX5 第一个Fisher判别函数占总方差的97.3%，第二个占2.7%，二者占总方差的100%，所测蜂蜜样品得到区分； (5)以17个特征共有峰的峰面积为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法对蜂蜜样品进行分析，三种蜂蜜样品均得到正确分类。2.根据权利要求1所述的区分椴树蜜、笤子蜜和油菜蜜的鉴别方法，其特征在于HPLC-ECD色谱条件为:色谱柱:Zorbax SB-C18 (250 X 4.6 mm, 5 Pm);流动相:甲醇和0.15%的甲酸水溶液；洗脱方式:梯度洗脱；流速1.0 mL/min ;检测电压:900 mV ;柱温:30 °C。
【专利摘要】本发明公开了一种有效鉴别椴树蜜、苕子蜜和油菜蜜的方法，首先用XAD?2型树脂从蜂蜜样品中提取出酚类化合物，进行HPLC?ECD分析，使用所得到的HPLC?ECD色谱数据建立椴树蜜，笤子蜜和油菜蜜样品的HPLC?ECD指纹图谱，分析椴树蜜，笤子蜜，油菜蜜样品的指纹图谱，得到大量的共有峰信息，经分析比较后挑选出共计17个共有峰作为特征共有峰，结合化学计量学的方法对三种蜂蜜进行分类。本发明设计合理，所选分析仪器灵敏度高，分离效果好，可行性强，解决了椴树蜜和笤子蜜质量控制中的一个重要的技术问题。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105044230
【申请号】CN201510372397
【发明人】赵静, 曹炜, 程妮, 吕新刚
【申请人】西北大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月30日