一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药制剂质量控制的技术领域，特别涉及一种参芎葡萄糖注射液的化 学成分鉴定及活性成分筛选方法。
【背景技术】
[0002] "参芎葡萄糖注射液"由丹参和盐酸川芎嗪采用现代制剂技术制备而成的复方制 剂，临床上主要广泛应用于心血管疾病的治疗。现代研究表明，丹参中的多种化学成分以及 盐酸川芎嗪均具有心脏保护作用的生物活性，但丹参及盐酸川芎嗪配伍所制成的复方制剂 "参芎葡萄糖注射液"，其化学成分与药效之间的关系目前尚无文献报道。由于"参芎葡萄糖 注射液"药效物质基础尚不明确，参；葡萄糖注射液现行质量标准的含量测定项目只对丹 参素和盐酸川芎嗪进行定量控制，难以全面反映制剂的化学成分特征。因此，建立一种能快 速、有效地确定参芎葡萄糖中各成分的化学结构及其主要活性成分的方法，实现对其物质 群的全面控制，为参芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学试验依据，具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于，提供一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选 方法。
[0004] 本发明针对"参；葡萄糖注射液"药效物质基础尚不明确，现行质量标准的含量测 定成分单一的问题，首次对参芎葡萄糖注射液的化学成分进行系统、整体研究，建立的方法 可以快速、有效地确定参芎葡萄糖注射液中各成分的化学结构及其主要活性成分，可为参 芎葡萄糖注射液的质量评价提供科学依据，提升制剂的质量控制水平。
[0005] 本发明所述的参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法，由以下步 骤组成：
[0006] 步骤一、拟定化学成分鉴定分析条件步骤
[0007] 运用超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱方法，运用 超高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-DAD-Q/T0F)技术， 拟定的分析条件；
[0008] 步骤二、获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分步骤
[0009] 根据步骤一中所拟定的化学成分鉴定分析条件，分别吸取对照品溶液和参芎葡萄 糖注射液供试品溶液进样测定，获取参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间 tR、紫外光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级 质谱图；
[0010] 步骤三、化学成分结构鉴定步骤
[0011] 针对步骤二所获取的参芎葡萄糖注射液中各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外 光谱图UV、分子式、各个成分的质量的一级质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图 来鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中所含有的化学成分的特征；其中一方面， 通过步骤二的对照品溶液比对试验，分析步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液中已知化 合物的结构；另一方面，通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收波长、分子离子及碎片离 子信息、质谱裂解特征，鉴定步骤二的参芎葡萄糖注射液供试品溶液的未知化合物结构；
[0012] 步骤四、心肌细胞萃取实验步骤
[0013] 利用固相萃取小柱富集纯化，制备参芎葡萄糖注射液样品，选择与参芎葡萄糖注 射液样品临床适应症心血管疾病相关的H9c2心肌细胞作为载体进行心肌细胞萃取，制备 细胞萃取阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液；
[0014] 步骤五、活性成分筛选步骤
[0015] 运用超高效液相色谱-电喷雾-三重四级杆串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS)技术，拟 定的分析条件，分别对步骤四的参芎葡萄糖注射液样品、细胞萃取空白对照溶液、细胞萃取 阴性对照溶液、参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液进样分析；应用多反应监测（MRM)的 离子通道即MRM方式，通过对母离子和子离子特异性的跟踪监测，筛选出参芎葡萄糖注射 液中能与心肌细胞有相互作用的成分，即为参芎葡萄糖注射液中具有心血管作用的潜在活 性成分。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二中，所述拟定的分析条件具体如下：
[0017] 1)拟定 UPLC 液相条件：色谱柱：Agilent Plus Plus C18 (2. ImmX 100mm，1. 8 μ m) 柱；柱温：20°C ;流速：0. 30mL · min S流动相：0.1 %甲酸乙腈（A)-O. I %甲酸水（B);梯度 洗脱条件：〇 ~18min，5 % ~62 % (A) ; 18 ~19min，62 % ~100 % (A);进样体积：1 μ L ;
[0018] 2、拟定Q-TOF质谱条件：采用电喷雾电离源ESI ;在负离子模式下采集数据；数据 采集范围m/z 50~1000 ;毛细管电压2800V ;雾化气N2，雾化气压力I. 2Bar ;去溶剂气N2, 去溶剂气流速8L · min \去溶剂气温度200°C ;质谱数据采集及处理软件为Compassl. 2。
[0019] 在本发明的一个优选实施例中，所述步骤二中，所述参芎葡萄糖注射液供试品溶 液的制备方法如下：取参芎葡萄糖注射液10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀即可；所述对 照品溶液的制备方法如下：分别精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭 香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸D适量，分别置于8个IOmL容量瓶中，加甲醇溶解并稀 释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1. 056, L 049, L 084, L 103, L 020, L 046, L 036， I. 057mg · mL 1的丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、 丹酚酸D对照品溶液。
[0020] 在本发明的一个优选实施例中，所述步骤三中，通过参芎葡萄糖注射液供试品溶 液与对照品比较各个色谱峰/成分的保留时间tR、紫外光谱图UV、各个成分的质量的一级 质谱图和某成分的特征碎片离子的二级质谱图，分别鉴定丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、盐酸 川爭秦、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸B ;通过未知化合物的分子式、紫外最大吸收 波长、分子离子及碎片离子信息、质谱裂解特征，分别鉴定丹酚酸I/H、紫草酸和丹酚酸C。
[0021] 在本发明的一个优选实施例中，所述步骤四中，所述参芎葡萄糖注射液样品制备 方法如下：取参芎葡萄糖注射液100mL，经减压浓缩至小体积，用lmol/L的盐酸溶液调节供 试品溶液pH值至3,经Oasis HLB固相萃取小柱（用5mL甲醇活化Oasis HLB小柱，用2mL 水冲洗至无醇味后上样）纯化，先用水洗脱以除去供试品中的糖类成分，再用甲醇洗脱，收 集甲醇洗脱液减压浓缩得到浸膏，将浸膏用水溶解至浓度为2mg/mL得到参芎葡萄糖注射 液样品。
[0022] 在本发明的一个优选实施例中，所述步骤四中，所述制备细胞萃取阴性对照溶液、 参芎葡萄糖注射液细胞萃取样品溶液和细胞萃取空白对照溶液的制备方法如下：
[0023] ⑴DMEM培养基的配制
[0024] 每袋培养基先加入600mL三蒸水，加入3. 7g NaHCO3,0.1 lg丙酮酸钠，终浓度 为lOOU/mL的青霉素和链霉素，适量两性霉素，充分搅拌溶解，定容至1L，调节pH值为 7. 0-7. 2,0. 22 μ m滤器过滤除菌，分装，4°C冰箱保存备用；
[0025] (2)H9c2心肌细胞的培养
[0026] 取冻存于液氮中的H9c2细胞一株，置37°C水浴中迅速溶解后移入装有ImL含 10%胎牛血清DMEM培养基的离心管中充分混合，经1000r/min，离心5min弃上清，沉淀用 3mL含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬后置于37°C、5% CO2的条件下静置培养；生长2~ 3d细胞达到融合时用0. 25%胰蛋白酶-0. 53mmol/L EDTA配制的消化液传代，将细胞继 续置于37°C、5% CO2的条件下静置培养；取对数生长期的H9c2心肌细胞，以每孔100 μ L， 6-8X IO5个/mL接种于96孔培养板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37°C、5% CO2培养箱中培养48h后得到H9c2心肌细胞；用于实验。
[0027] (3)细胞萃取实验
[0028] ①选择步骤（2)制备的胞浆饱满、生长状态良好的H9c2细胞接种到6孔板中，实 验首先用经37°C温浴的PBS A轻轻冲洗细胞表面，去除残留在细胞表面的死细胞