参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱建立方法和质量控制方法

专利名称：参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱建立方法和质量控制方法
技术领域：
本发明涉及中药指纹图谱建立方法和质量控制方法技术领域，具体地说，本发明是一种参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱建立方法和质量控制方法。
背景技术：
中药复方成分复杂，传统的以单一成分作为指标进行质量控制手段越来越不能适应目前中药质量控制的要求。在中药现代化过程中，具有整体性和模糊性两个基本特性的中药指纹图谱已成为现阶段可较为全面反映中药内在质量的有效手段。参芎葡萄糖注射液由丹参和盐酸川芎嗪配伍组成，具有抗血小板聚集，扩张冠状动脉作用，临床用于闭塞性脑血管病及其它缺血性血管疾病的治疗。参芎葡萄糖注射液现行质量标准(WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量测定项目只对丹参素和盐酸川芎嗪进行定量控制，难以全面反映制剂的化学成分特征。随着我国药品生产质量控制水平的提高和对注射剂安全、疗效、质量可控等问题重视程度的不断深入，国家食品药品监督管理局相继提出了“国家药品标准提高行动计划”和“中药注射剂安全性再评价工作”，以全面提升药品质量控制水平。因此，建立一种参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱质量控制方法，能更好地保证制剂批次间的质量均一性和稳定性，为参芎葡萄糖注射液的质量控制与综合评价提供科学的参考依据。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，通过该方法建立参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱。本发明的目的之二在于提供上述参芎葡萄糖注射液原料的质量控制方法。本发明的目的之三在于提供一种参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，通过该方法建立参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱。本发明的目的之四在于提供上述参芎葡萄糖注射液中间体的质量控制方法。本发明的目的之五在于提供一种参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱的建立方法，通过该方法建立参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱。本发明的目的之六在于提供上述参芎葡萄糖注射液制剂的质量控制方法。作为本发明第一方面的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，由以下步骤组成I、对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img · mL-1的对照品溶液；2、供试品溶液的制备取丹参药材用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提出，定容得丹参药材供试品溶液；3、供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到丹参药材的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ;柱温为35°C 55°C ;进样量为5 15 μ L ;流速为0.5 1.0mL.mirT1 ；4、对照指纹图谱的建立:通过对10批次以上丹参药材的指纹图谱进行测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立丹参药材对照指纹图谱。在上述参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤2供试品溶液的制备过程具体如下:取过40目筛丹参药材粉末0.5g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参药材供试品溶液。在上述参芎葡萄糖 注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定中,所述测定具体为=DiamonsilC18色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脱，O 7min, A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ;12 15min,A18% 20% ；15 22min,A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温 4(TC，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参药材指纹图谱。在上述参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定中，在丹参药材指纹图谱中，以第15号峰丹酚酸B的峰面积最大，以丹酚酸B的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间:第I号共有峰的相对保留时间为0.097±0.0Olmin ’第2号共有峰的相对保留时间为0.111±0.0Olmin ；第3号共有峰的相对保留时间为0.123±0.0Olmin ;第4号共有峰的相对保留时间为0.198±0.002min ’第5号共有峰的相对保留时间为0.234±0.002min ’第6号共有峰的相对保留时间为0.271±0.003min ’第7号共有峰的相对保留时间为0.472±0.005min ；第8号共有峰的相对保留时间为0.491±0.005min ;第9号共有峰的相对保留时间为0.662±0.007min ;第10号共有峰的相对保留时间为0.687±0.007min ’第11号共有峰的相对保留时间为0.788±0.008min ;第12号共有峰的相对保留时间为0.813±0.008min ；第13号共有峰的相对保留时间为0.877±0.009min;第14号共有峰的相对保留时间为0.914±0.009min ;第15号共有峰的相对保留时间为Imin ’第16号共有峰的相对保留时间为1.047±0.0lmin ;第16号共有峰的相对保留时间为1.076±0.0lmin0在上述参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，在丹参药材指纹图谱中确定了 17个特征峰，其中峰5、7、13、
14、15、17分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。作为本发明第二方面的参芎葡萄糖注射液原料的质量控制方法，是将丹参药材的指纹图谱与丹参药材对照指纹图谱比较；经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于0.90。作为本发明第三方面的参芎葡萄糖注射液的中间体指纹图谱的建立方法，由以下步骤组成:
I、对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img · mL-1的对照品溶液；2、取丹参半成品，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；3、供试品溶液的测定吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到丹参半成品的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ;柱温为35°C 55°C ;进样量为5 15 μ L ;流速为O. 5 I. OmL · mirT1 ；4、对照指纹图谱的建立通过对10批次以上丹参半成品的指纹图谱测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立丹参半成品对照指纹图谱。在上述参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤2供试品溶液的制备过程具体如下取丹参半成品O. 15g，精密称定，加水溶解稀释，定容至50mL，摇匀，上清液用O. 45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参半成品供试品溶液。在上述参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定中，所述测定具体为DiamonsilC18色谱柱(4. 6mmX250mm,5μ m);流动相乙腈(A) -O. 05%磷酸(B)，流速ImL · min—1，梯度洗脱，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温40°C，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参半成品指纹图
-i'TfeP曰。

在上述参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定中，在丹参半成品指纹图谱中，以4号峰丹参素的峰面积最大，以丹参素的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间第I号共有峰的相对保留时间为O. 371 ±0. 003min ;第2号共有峰的相对保留时间为O. 423±0. 004min ;第3号共有峰的相对保留时间为O. 455±0. 004min ;第4号共有峰的相对保留时间为O. 754±0. 007min ;第5号共有峰的相对保留时间为Imin ’第6号共有峰的相对保留时间为I. 340±0. 013min ；第7号共有峰的相对保留时间为I. 509±0. 015min ’第8号共有峰的相对保留时间为
I.759±0. 017min ’第9号共有峰的相对保留时间为2. 462±0. 025min ;第10号共有峰的相对保留时间为2. 583±0. 026min ’第11号共有峰的相对保留时间为3. 033±0. 030min ；第12号共有峰的相对保留时间为3. 268±0. 033min;第13号共有峰的相对保留时间为
3.404±0. 034min ;第14号共有峰的相对保留时间为3. 732±0· 037min ;第15号共有峰的相对保留时间为3. 791 ±0. 038min ;第16号共有峰的相对保留时间为4. 010±0. 040min。在上述参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，在丹参半成品指纹图谱中确定了 16个特征峰，其中峰5、
7、11、13、15、16分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。
作为本发明第四方面的参芎葡萄糖注射液的中间体质量控制方法，是将丹参半成品的指纹图谱与丹参半成品的对照指纹图谱比较，经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于0.90。作为本发明第五方面的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，由以下步骤组成:1、对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img ^mL-1的对照品溶液；2、供试品溶液的制备:取参芎葡萄糖注射液制剂，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；3、供试品溶液的测定:吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ；柱温为35°C 55°C ;进样量为5 15 μ L ;流速为0.5 1.0mL.mirT1 ；

4、对照指纹图谱的建立:通过对10批次以上参芎葡萄糖注射液原料或其中间体，或其制剂的测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立其对照指纹图谱。在本发明参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法的一个优选实施例中，所述步骤2供试品溶液的制备为取过40目筛丹参药材粉末0.5g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参药材供试品溶液；取丹参半成品0.15g，精密称定，加水溶解稀释，定容至50mL，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参半成品供试品溶液；精密量取参芎葡萄糖注射液制剂10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀，即得参芎葡萄糖注射液供试品溶液。在上述参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定中，所述测定具体为DiamonsilC18色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m)；流动相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脱，O 7min, A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ;12 15min,A18% 20% ；15 22min,A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温 4(TC，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参半成品指纹图谱。在上述参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤3供试品溶液的测定，在丹参药材指纹图谱中，以15号峰丹酚酸B的峰面积最大，以丹酚酸B的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间:第I共有峰的相对保留时间为0.097±0.0Olmin ’第2共有峰的相对保留时间为0.111±0.0Olmin ;第3共有峰的相对保留时间为0.123±0.0Olmin ;第4共有峰的相对保留时间为0.198±0.002min ；第5共有峰的相对保留时间为0.234±0.002min ;第6共有峰的相对保留时间为0.271 ±0.003min ;第7共有峰的相对保留时间为0.472±0.005min ;第8共有峰的相对保留时间为0.491±0.005min ;第9共有峰的相对保留时间为0.662±0.007min ;第10共有峰的相对保留时间为0.687±0.007min ;第11共有峰的相对保留时间为0.788±0.008min ；第12共有峰的相对保留时间为0.813±0.0OSmin;第13共有峰的相对保留时间为O. 877±0. 009min ’第14共有峰的相对保留时间为O. 914±0· 009min ;第15共有峰的相对保留时间为Imin ;第16共有峰的相对保留时间为I. 047±0. Ol ;第17共有峰的相对保留时间为 I. 076±0· Olmin ；在丹参半成品指纹图谱中，以4号峰丹参素的峰面积最大，以丹参素的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为第I共有峰的相对保留时间为O. 371±0. 003min ；第2共有峰的相对保留时间为O. 423±0. 004min ;第3共有峰的相对保留时间为
O.455±0. 004min ;第4共有峰的相对保留时间为O. 754±0. 007min ;第5共有峰的相对保留时间为Imin ;第6共有峰的相对保留时间为I. 340±0. 013min ;第7共有峰的相对保留时间为I. 509±0. 015min ’第8共有峰的相对保留时间为I. 759±0. 017min ;第9共有峰的相对保留时间为2. 462±O. 025min ;第10共有峰的相对保留时间为2. 583±O. 026min ；第11共有峰的相对保留时间为3. 033±0. 030min ;第12共有峰的相对保留时间为3. 268±0. 033min ;第13共有峰的相对保留时间为3. 404±0. 034min ;第14共有峰的相对保留时间为3. 732±0· 037min ’第15共有峰的相对保留时间为3. 791±0. 038min ’第16共有峰的相对保留时间为4. 010±0. 040min ;在参芎葡萄糖注射液指纹图谱中，以5号峰盐酸川芎嗪的峰面积最大，以盐酸川芎嗪的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为第I共有峰的相对保留时间为O. 302±0. 003min ;第2共有峰的相对保留时间为O. 347±0. 003min ’第3共有峰的相对保留时间为O. 618±0. 006min ;第4共有峰的相对保留时间为O. 822±0. OOSmin ;第5共有峰的相对保留时间为Imin ;第6共有峰的相对保留时间为I. 233±0. 012min ;第7共有峰的相对保留时间为2. 375±0. 023min ’第8共有峰的相对保留时间为2. 658±0. 026min ’第9共有峰的相对保留时间为3. 034±0. 030min ;第9共有峰的相对保留时间为3. 254±0. 032min。在上述参芎葡萄糖注 射液制剂的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立，在丹参药材指纹图谱中确定了 17个特征峰，其中峰5、7、13、
14、15、17分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在丹参半成品指纹图谱中确定了 16个特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在参芎葡萄糖注射液指纹图谱中确定了 10个特征峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分别依次为丹参素、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱的建立方法的一个优选实施例中，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。作为本发明第六方面的参芎葡萄糖注射液制剂的质量控制方法，是将参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱与参芎葡萄糖注射液制剂对照指纹图谱比较；经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于O. 90 ;将参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱进行比对，制剂指纹图谱中各特征峰均须在原料和中间体指纹图谱中得到追踪，不得有色谱峰缺失。本发明针对现行参弯葡萄糖注射液质量标准的不足,首次提出对参弯葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱进行测定，提供一种简单、可靠、重复性好，可全面控制参芎葡萄糖注射液内在质量的中药指纹图谱测定方法。
本发明可实现在同一色谱条件下对参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱进行检测，通过相关性研究说明指纹图谱各特征峰的来源和归属，能用于参芎葡萄糖注射液产品质量控制和工艺条件控制，确保制备工艺的稳定性，更好地保证产品批次间的质量均一性和稳定性，提升制剂的质量控制水平。


图1为混合对照品溶液图谱。图2为丹参药材对照指纹图谱。图3为18批丹参药材指纹图谱相似度评价图。图4为丹参半成品对照指纹图谱。图5为13批丹参半成品指纹图谱相似度评价图。图6为参芎葡萄糖注射液对照指纹图谱。图7为18批参芎葡萄糖注射液指纹图谱相似度评价图。图8为原料(A)和中间体(B)指纹图谱对比图。图9为中间体(A)和制剂(B)指纹图谱对比图。
具体实施例方式本发明所述的参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱质量控制方法是经过大量的筛选试验得到的最佳方案，以下实验研究为本发明的优选过程:一、色谱条件与系统适用性试验1、仪器与试药超快速液相色谱系统(UFLC，岛津，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Lcsolution工作站)；AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。乙腈(德国MERCK公司)为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。丹参素钠(批号110855200508)，盐酸川芎嗪(批号110817-200305)，原儿茶醛(批号110810-200705)对照品购于中国药品生物制品检定所；迷迭香酸(批号MUST-10120901 )，丹酚酸B (批号MUST-11031401 )，丹酚酸A (批号MUST-10012901)对照品购于北京恒元启天化工技术研究院；丹参药材采于四川省中江丹参药材种植基地，由贵阳医学院药学院药用植物与生药学教研室龙庆德副教授鉴定；丹参半成品和参芎葡萄糖注射液(贵州景峰注射剂有限公司提供)。2、色谱条件的选择试验曾对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.5%乙酸等不同配比流动相系统进行考察，经等度或梯度试验比较，结果表明，以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱分离效果较好，所检测的各色谱峰既能达到基线分离，又缩短了分析时间。实验中米用了 KromasilC18 (5.0mmX 200mm, 5 μ m,大连依利特)，HypersilC18 (5.0mmX 250mm，5 μ m,大连依利特)，InersilC18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m,日本 GLSciencesInc.)和DiamonsilC18 (5.0mmX 250mm, 5 μ m,迪马公司)色谱柱，结果以DiamonsilC18色谱柱的分离效果较好，指纹峰型基本一致，因此最终选择了 DiamonsilClS柱。采用阵列二极管检测器对丹参药材、半成品和制剂的指纹图谱检测波长进行了选择，结果表明检测波长在230nm时，药材、中间体及制剂的信息量较大，能兼顾各成分色谱峰的丰度、分离度和基线等。通过对仪器、流动相、检测波长、柱温等色谱条件进行优化考察的基础上，获得了能适用于参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂进行指纹图谱检测的相同色谱条件DiamonsilC18色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流动相乙腈(A) -O. 05%磷酸(B)，流速ImL · mirT1,梯度洗脱，
O 7min,A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ； 12 15min,A18% 20% ； 15 22min,A20% 23% ；22 32min，A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90%。柱温40 °C，检测波长230nm,进样量10 μ L。二、对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img · mL-1的对照品溶液。三、供试品溶液的制备I、丹参药材供试品溶液的制备取过40目筛丹参药材粉末(原料)约O. 5g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，上清液用微孔滤膜(O. 45 μ m)滤过，取续滤液，即得丹参药材供试品溶液。2、丹参半成品供试品溶液的制备取丹参半成品(中间体)约O. 15g，精密称定，加水溶解稀释，定容至50mL，摇匀，上清液用微孔滤膜(O. 45 μ m)滤过，取续滤液，即得丹参半成品供试品溶液。3、参芎葡萄糖注射液供试品溶液的制备精密量取参芎葡萄糖注射液(制剂)10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀，即得参芎葡萄糖注射液供试品溶液。四、指纹图谱的测定与评价I、丹参药材指纹图谱的测定与评价从18批丹参药材供试品指纹图谱的检测结果来看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
12、13、14、15、16、17号峰在18批药材中都在相同的相对保留时间处出现，其指纹峰面积之和占总量均大于90%，因而标定此17个色谱峰为共有特征峰。通过对照品比对试验指认了6个色谱峰，其中峰5、7、13、14、15、17分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在丹参药材指纹图谱中，以15号峰丹酚酸B的峰面积最大，以丹酚酸B的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为(单位为min) :1 (0.097±0.001) ；2(O. 111±0· 001)；3(0. 123±0· 001)；4(0. 198±0· 002)；5(0. 234±0· 002)；6(0. 271±0· 003)；7 (O. 472±0· 005) ;8 (O. 491 ±0. 005) ;9 (O. 662 ± O. 007 ) ; 10 (O. 687 ± O. 007 ) ; 11(O. 788±0. 008) ;12 (O. 813±0. 008) ;13 (O. 877±0. 009) ;14 (O. 914±0. 009) ; 15 (I);16 (I. 047±0. 01) ;17 (I. 076±0. 01)。2、丹参半成品指纹图谱的测定与评价从13批丹参半成品指纹图谱的检测结果来看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、
13、14、15、16号峰在13批丹参半成品中都在相同的相对保留时间处出现，其指纹峰面积之和占总量均大于95%，因而标定此16个色谱峰为共有指纹特征峰。通过对照品比对试验指认了 7个色谱峰，其中峰5、7、11、13、15、16分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在丹参半成品指纹图谱中，以4号峰丹参素的峰面积最大，以丹参素的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为(单位为min):1 (0.371 ±0.003) ;2(0.423±0.004) ;3 (0.455±0.004) ;4 (0.754±0.007) ;5 (I) ；6 (1.340±0.013);7 (1.509±0.015) ;8 (1.759 ± 0.017 ) ;9 ( 2.462 ± 0.025 ) ; 10 (2.583 ± 0.026 ) ; 11(3.033±0.030) ;12 (3.268±0.033) ; 13 (3.404±0.034) ; 14 ( 3.732±0.037) ; 15(3.791±0.038) ;16 (4.010±0.040)。3、参芎葡萄糖注射液指纹图谱的测定与评价从17批供试品的检测结果来看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号峰在17批制剂中都在相同的相对保留时间处出现，其指纹峰面积之和占总量均大于95%，因而标定此10个色谱峰为共有指纹特征峰。通过对照品比对试验指认了 7个色谱峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分别依次为丹参素、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。4、参芎葡萄糖注射液原料、中间体及制剂指纹图谱相关性研究在相同色谱条件下对丹参药材、丹参半成品和制剂进行指纹图谱检测，结果表明，制剂指纹图谱中各特征峰除5号峰(盐酸川芎嗪)来源于组方中的盐酸川芎嗪原料药外，其余特征峰均来源于组方中的丹参，均可在丹参药材和丹参半成品中得到追踪，无色谱峰缺失，制剂与药材、半成品指纹图谱有良好的相关性，见表I。表I药材、中间体、制剂指纹图谱相关性
权利要求
1.参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，由以下步骤组成: (1)、对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img.mL-1的对照品溶液； (2)、供试品溶液的制备:取丹参药材用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提出，定容得丹参药材供试品溶液； (3)、供试品溶液的测定:吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到丹参药材的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ;柱温为35°C 550C ;进样量为5 15 μ L ;流速为0.5 1.0mL.mirT1 ； (4)、对照指纹图谱的建立:通过对10批次以上丹参药材的指纹图谱进行测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立丹参药材对照指纹图谱。
2.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备过程具体如下:取过40目筛丹参药材粉末0.5g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参药材供试品溶液。
3.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定中,所述测定具体为=DiamonsilC18色谱柱(4.6mmX 250mm,5μ m);流动相乙腈(A) -0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脱，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温40°C，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参药材指纹图谱。
4.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定中，在丹参药材指纹图谱中，以第15号峰丹酚酸B的峰面积最大，以丹酚酸B的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间:第I号共有峰的相对保留时间为0.097±0.0Olmin ’第2号共有峰的相对保留时间为0.111±0.0Olmin ；第3号共有峰的相对保留时间为0.123±0.0Olmin ;第4号共有峰的相对保留时间为0.198±0.002min ’第5号共有峰的相对保留时间为0.234±0.002min ’第6号共有峰的相对保留时间为0.271±0.003min ;第7号共有峰的相对保留时间为0.472±0.005min ；第8号共有峰的相对保留时间为0.491±0.005min ;第9号共有峰的相对保留时间为0.662±0.007min ;第10号共有峰的相对保留时间为0.687±0.007min ’第11号共有峰的相对保留时间为0.788±0.008min ;第12号共有峰的相对保留时间为0.813±0.008min ；第13号共有峰的相对保留时间为0.877±0.009min;第14号共有峰的相对保留时间为0.914±0.009min ;第15号共有峰的相对保留时间为Imin ;第16号共有峰的相对保留时间为1.047±0.0lmin ;第16号共有峰的相对保留时间为1.076±0.0lmin0
5.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，在丹参药材指纹图谱中确定了 17个特征峰，其中峰5、.7、13、14、15、17分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。
6.如权利要求1所述的参芎葡萄糖注射液原料的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。
7.参芎葡萄糖注射液原料的质量控制方法，是将权利要求1至6任一项权利要求所述的丹参药材的指纹图谱与丹参药材对照指纹图谱比较；经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于0.90。
8.参芎葡萄糖注射液的中间体指纹图谱的建立方法，其特征在于，由以下步骤组成: (1)、对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img.mL-1的对照品溶液； (2)、取丹参半成品，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液； (3)、供试品溶液的测定:吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到丹参半成品的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ;柱温为35°C 55°C ;进样量为5 15 μ L ;流速为0.5 L OmL.mirT1 ； (4)、对照指纹图谱的建立:通过对10批次以上丹参半成品的指纹图谱测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立丹参半成品对照指纹图谱。
9.如权利要求8所述的参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备过程具体如下:取丹参半成品0.15g，精密称定，加水溶解稀释，定容至50mL，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参半成品供试品溶液。
10.如权利要求8所述的参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定中，所述测定具体为DiamonsilC18色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m);流动相乙腈(A) -0.05 %磷酸(B)，流速 ImL.mirT1,梯度洗脱,O 7min，A2% 4% ；7 12min，A4% 18% ;12 15min，A18% 20% ；15 22min，A20% 23% ；22 32min，A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温40°C，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参半成品指纹图谱。
11.如权利要求8所述的参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定中，在丹参半成品指纹图谱中，以4号峰丹参素的峰面积最大，以丹参素的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间 第I号共有峰的相对保留时间为0.371±0.003min ’第2号共有峰的相对保留时间为0.423±0.004min ；第3号共有峰的相对保留时间为0.455±0.004min ;第4号共有峰的相对保留时间为0.754±0.007min ;第5号共有峰的相对保留时间为Imin ’第6号共有峰的相对保留时间为1.340±0.013min ’第7号共有峰的相对保留时间为1.509±0.015min ;第8号共有峰的相对保留时间为1.759±0.017min ;第9号共有峰的相对保留时间为2.462±0.025min ；第10号共有峰的相对保留时间为2.583±0.026min ’第11号共有峰的相对保留时间为3.033±0.030min ;第12号共有峰的相对保留时间为3.268±0.033min ’第13号共有峰的相对保留时间为3.404±0.034min ;第14号共有峰的相对保留时间为3.732±0.037min ；第15号共有峰的相对保留时间为3.791±0.038min;第16号共有峰的相对保留时间为4.010±0.040min。
12.如权利要求8所述的参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(4)对照指纹图谱的建立中，在丹参半成品指纹图谱中确定了 16个特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A0
13.如权利要求8所述的参芎葡萄糖注射液中间体的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤4对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。
14.参芎葡萄糖注射液的中间体质量控制方法，是将权利要求8-13任一项权利要求所述的丹参半成品的指纹图谱与丹参半成品的对照指纹图谱比较，经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于0.90。
15.参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，由以下步骤组成: (1)、对照品溶液的制备:精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，加甲醇溶解，稀释制成浓度分别为Img.mL-1的对照品溶液； (2)、供试品溶液的制备:取参芎葡萄糖注射液制剂，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液； (3)、供试品溶液的测定:吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，得到参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱；指纹图谱检测的色谱条件为:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱；检测波长为200 300nm ;柱温为35°C 55°C ;进样量为5 15 μ L ;流速为0.5 1.0mL.mirT1 ； (4)、对照指纹图谱的建立:通过对10批次以上参芎葡萄糖注射液原料或其中间体，或其制剂的测定，确定其共有指纹特征峰，并经中药指纹图谱相似度评价软件拟合建立其对照指纹图谱。
16.权利要求15所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤(2)供试品溶液的制备为取过40目筛丹参药材粉末0.5g，精密称定，精密加入水25ml，称定重量，加热回流提取2h，放冷再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参药材供试品溶液；取丹参半成品0.15g，精密称定，加水溶解稀释，定容至50mL，摇匀，上清液用0.45 μ m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得丹参半成品供试品溶液；精密量取参芎葡萄糖注射液制剂10mL，加水稀释，定容至25mL，摇匀，即得参芎葡萄糖注射液供试品溶液。
17.权利要求15所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定中，所述测定具体为DiamonsilC18色谱柱(4.6mmX250mm,5μ m);流动相乙腈(A) -0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脱，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱温40°C，检测波长230nm，进样量10 μ L ;记录60min色谱图，即得到所需的丹参半成品指纹图-1'TfeP曰。
18.权利要求15所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤(3)供试品溶液的测定， 在丹参药材指纹图谱中，以15号峰丹酚酸B的峰面积最大，以丹酚酸B的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间:第I共有峰的相对保留时间为0.097±0.0Olmin ’第2共有峰的相对保留时间为0.111±0.0Olmin ’第3共有峰的相对保留时间为0. 123±0. 00lmin ’第4共有峰的相对保留时间为0. 198±0. 002min ；第5共有峰的相对保留时间为0. 234±0. 002min ;第6共有峰的相对保留时间为0. 271 ±0. 003min ’第7共有峰的相对保留时间为0. 472±0. 005min ;第8共有峰的相对保留时间为0. 491±0. 005min ;第9共有峰的相对保留时间为0. 662±0. 007min ;第10共有峰的相对保留时间为0. 687±0. 007min ;第11共有峰的相对保留时间为0. 788±0. 008min ；第12共有峰的相对保留时间为0.813±0. 00Smin ;第13共有峰的相对保留时间为.0. 877±0. 009min ;第14共有峰的相对保留时间为0. 914±0 009min ;第15共有峰的相对保留时间为1min ;第16共有峰的相对保留时间为1. 047±0. 01 ;第17共有峰的相对保留时间为 1. 076±0 0lmin ； 在丹参半成品指纹图谱中，以4号峰丹参素的峰面积最大，以丹参素的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为第1共有峰的相对保留时间为0. 371±0. 003min ；第2共有峰的相对保留时间为0. 423±0. 004min ;第3共有峰的相对保留时间为.0. 455±0. 004min ;第4共有峰的相对保留时间为0. 754±0. 007min ;第5共有峰的相对保留时间为1min ;第6共有峰的相对保留时间为1. 340±0. 013min ;第7共有峰的相对保留时间为1. 509±0. 015min ’第8共有峰的相对保留时间为1. 759±0. 017min ’第9共有峰的相对保留时间为2. 462±0. 025min ;第10共有峰的相对保留时间为2. 583±0. 026min ；第11共有峰的相对保留时间为3. 033±0. 030min;第12共有峰的相对保留时间为.3. 268±0. 033min ;第13共有峰的相对保留时间为3. 404±0. 034min ;第14共有峰的相对保留时间为3. 732±0 037min ’第15共有峰的相对保留时间为3. 791±0. 038min ;第16共有峰的相对保留时间为4. 010±0. 040min ;在参芎葡萄糖注射液指纹图谱中，以5号峰盐酸川芎嗪的峰面积最大，以盐酸川芎嗪的保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间为第1共有峰的相对保留时间为0. 302±0.003min;第2共有峰的相对保留时间为.0. 347±0. 003min ;第3共有峰的相对保留时间为0. 618±0. 006min ;第4共有峰的相对保留时间为0. 822±0. 00Smin ;第5共有峰的相对保留时间为1min ;第6共有峰的相对保留时间为1. 233±0. 012min ;第7共有峰的相对保留时间为2. 375±0. 023min ’第8共有峰的相对保留时间为2. 658±0. 026min ;第9共有峰的相对保留时间为3. 034±0. 030min ;第9共有峰的相对保留时间为3. 254±0. 032min。
19.权利要求15所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤(4)对照指纹图谱的建立，在丹参药材指纹图谱中确定了 17个特征峰，其中峰5、7、.13、14、15、17分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在丹参半成品指纹图谱中确定了 16个特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分别依次为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在参芎葡萄糖注射液指纹图谱中确定了 10个特征峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分别依次为丹参素、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。
20.权利要求15所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述步骤(4)对照指纹图谱的建立中，采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对所得数据和图谱进行处理即得到对照指纹图谱。
21.参芎葡萄糖注射液制剂的质量控制方法，是将权利要求15至20任一项权利要求所述的参芎葡萄糖注射液制剂的指纹图谱与参芎葡萄糖注射液制剂对照指纹图谱比较；经中药指纹图谱相似度评价软件计算相似度应不得小于0.90 ;将参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱进行比对，制剂指纹图谱中各特征峰均须在原料和中间体指纹图谱中得到追踪，不得有 色谱峰缺失。
全文摘要
本发明公开一种参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂的指纹图谱建立方法及质量控制方法。本发明在相同色谱条件下对原料、中间体及其制剂进行指纹图谱检测。该方法用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂；乙腈-磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱；供试品指纹图谱与对照指纹图谱有良好的相关性，相似度大于0.90，且参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂指纹图谱有良好的相关性，制剂指纹图谱中各特征峰均可在原料和中间体中得到追踪。本发明建立的参芎葡萄糖注射液原料、中间体及其制剂指纹图谱能用于参芎葡萄糖注射液产品制备工艺条件控制和质量控制，确保产品制备工艺和质量的稳定性。本发明提供的指纹图谱检测方法操作简便，准确可靠，适用于参芎葡萄糖注射液的质量控制。
文档编号G01N30/88GK103149310SQ20131002148
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者叶湘武, 郑林, 王永林, 兰燕宇 申请人:贵州景峰注射剂有限公司