一步针对训练样本使用有监督分析方法即偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)显示食管癌及健康对照间的代谢轮廓的差异和 分类趋势。如图3所示，食管癌同健康对照间具有代谢模式差异和明显的组间分类趋势，其 建模的 R2X = 0· 167, R2Y = 0· 569, Q2Y = 0· 523。 表1.食管癌早期诊断的代谢组学研究的基线和临床病理特征
7、食管癌早期诊断的差异代谢物筛选和化学物质鉴定
[0023] 为筛选出早期食管癌诊断的差异代谢物，我们借助于PLS-DA建模的变量重要性 评分（VIP)和单变量的非参数检验（nonparametric Kruskal-Wallis rank sum test)进 行筛选。变量筛选标准为：VIP彡I ;且经假发现率FDR的多重检验校正后q值小于0. 05。 按照此标准，共筛选出在食管癌与健康对照之间差异表达血清代谢组标记物551个，进一 步根据R语言的CAMERA包确定差异代谢物的准分子离子、加合物和同位素信息，排除化学 信号和人体内没有的，获得242个潜在代谢标记物。 针对上述242个潜在代谢标记物，按照以下化学物质鉴定步骤（如代谢标记物L-色氨 酸RT 181. 38s，m/z 205. 0974的鉴定过程，见图4)，进行代谢标记物的鉴定： (1)根据潜在代谢标记物的一级质谱裂解分布特征，结合R语言的CAMERA软件包 (CAMERA为Ri吾言 package 软件包Collection of annotation related methods for mass spectrometry data, http://bioconductor. org/packages/release/bioc/html/CAMERA, html)确定潜在代谢标记物的准分子离子、加合物和同位素信息，推测潜在代谢标记物的分 子质量和分子式； ⑵根据分子质量查找在线人类代谢物数据库HMDB (http: //www. hmdb. ca/)和 METLIN(http://metlin. scripps. edu/)，确定若干备选化合物； (3)对242个潜在代谢标记物进行RRLC-QT0F/MS/MS二级质谱实验，进一步获得代谢物 相应的质谱离子碎片信息，并同数据库中备选化合物进行二级质谱图碎片离子匹配；比对 化合物标准样品库的色谱和质谱特征进行最终的物质确定。 根据上述鉴定方法，通过二级质谱或标准品确认的情况下共成功鉴定出25个血清代谢 标记物，这25个血清大小标记物的通用名（Common Name)分别为：beta_Ala_Lys ;L_Carnos ine ；cis-9-Palmitoleic acid ；Palmitic acid ；01eic Acid ；LPA (18:1(9Z)/0:0)； LysoPC(14:0/0:0) ；LysoPC (18:2(9Z, 12Z)) ；LysoPC(24:0) ；PC(14:1 (9Z)/P-18:1 (IlZ))； PC(16:0/18:2(9Z, 12Z)) ；PC(24:1 (15Z)/22:6(4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) ；Linoleic acid ；NADH ；Cortisol ；L-Tyrosine ；L-Tryptophan ；Glycocholic Acid ；Taurocholate ； Hypoxanthine ；A1lantoic ac id；Inosine ；Sphingosine I-phosphate ；3-〇-Sulfogalact osylceramide(dl8:1/20:0) ；Lact osylceramide(dl8:1/22:0)〇
[0024] 对比已发表文献，本发明这25个血清代谢标记物均为首次在早期食管鳞状细胞 癌中发现，这对于早期食管癌的诊断、治疗有十分重要的意义。其中，beta-Ala-Lys的中文 译名为beta-丙氨酸-赖氨酸，L-Carnosine的中文译名为左旋肌肽，cis-9-Palmitoleic acid的中文译名为顺-9-十六碳稀酸，Palmitic acid的中文译名为棕榈酸，OleicAcid的 中文译名为油酸，LPA的中文译名为溶血磷脂酸，LysoPC的中文译名为溶血卵磷脂，PC的中 文译名为磷脂，Linoleic acid的中文译名为亚油酸，NADH的中文译名为烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸，Cortisol的中文译名为皮质醇，L-Tyrosine的中文译名为L-酪氨酸，L-Tryptophan 的中文译名为L-色氨酸，GlycocholicAcid的中文译名为甘氨胆酸，Taurocholate的中 文译名为牛磺胆酸盐，Hypoxanthine的中文译名为次黄噪呤，Allantoic acid的中文 译名为尿囊酸，Inosine的中文译名为肌苷，Sphingosine 1-phosphate的中文译名为 卜磷酸鞘氨醇，3-0-Sulfogalactosylceramide的中文译名为硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇， Lactosylceramide的中文译名为乳糖神经酰胺，各中文译名因翻译可能存在偏差，以英文 标准名为准。 上述25个血清代谢标记物在HMDB和METLIN中的数据库检索信息如下表2所示，本领 域技术人员可以根据下表中的HMDB ID号、METLIN ID号得到这25个血清代谢标记物的详 细信息，例如化学结构式： 表2 25个血清代谢标记物在HMDB和METLIN的数据库检索信息
[0025] 此外，通过KEGG富集（enrichment)和代谢通路（pathway)分析，发现上述25 个血清代谢标记物与以下10个代谢通路密切相关：Glycerophospholipid metabolism ; Linoleic acid metabolism ;beta_Alanine metabolism ；Fatty acid biosynthesis ； Oxidative phosphorylation ；Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis ； Primary bile acid biosynthesis ；Pathways in cancer, and Bile secretion ； Purine metabolism ;Sphingolipid metabolism。上述 10 个代谢通路为代谢通路 KEGG 中的标准名（http: //www. genome, jp/kegg/)，其相应的中文译名为：甘油磷脂代谢 (Glycerophospholipid metabolism)、亚油酉爱代谢（Linoleic acid metabolism)、beta 丙氨酸代谢（beta-Alanine metabolism)、脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis)、 氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation)、苯基丙氨酸/酪氨酸和色氨酸代谢 (Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis)、初级胆汁酉爱合成（Primary bile acid biosynthesis)、癌症通路和胆汁分泌（Pathways in cancer，and Bile secretion)、噪呤代谢（Purine metabolism)、鞘脂类代谢（Sphingolipid metabolism)。这 证明食管癌发病早期这10个代谢通路发生了扰动，本发明的这一发现对于食管癌的预防 和药物的研发有很好的指导作用。 下表3为筛选得到的25个血清代谢标记物在食管癌患者和健康人群中的差异信息，其 中在正负两个离子模式下均发现了 L-Tryptophan。FC为食管癌和健康对照相比的变化倍 数（fold change)，根据FC信息可以看出：beta_丙氨酸-赖氨酸（beta-Ala-Lys)、溶血磷 脂酸 LPA (18:1 (9Z) /0:0)、溶血卵磷脂 LysoPC (14:0/0:0)、磷脂 PC (16:0/18:2 (9Z, 12Z))、 烟酰胺腺噪呤二核苷酸（NADH)、L-酪氨酸（L-Tyrosine), L-色氨酸（L-Tryptophan)、甘氨 胆酸（Glycoch olic Acid)、尿囊酸（Allantoic acid)、肌苷（Inosine)和 1-磷酸鞘氨醇 (Sphingosine 1-phosphat e)在食管癌组中相比健康组表达量明显升高，而其他的代谢标 记物在食管癌组中相比健康组表达量明显降低。 FDR为基于非参数检验多重比较校正的假发现率，其值均小于0. 05 ;AUC为单个代谢组 标记物的诊断试验评价的ROC曲线下面积AUC值，从该值可以看出这25个血清代谢标记物 单独作为标记物进行食管癌与非食管癌的诊断时，最低的AUC值为0. 61，最高的AUC值为 0. 85。由此可以看出，作为单一组分的诊断标记物来说，本发明筛选得到的25个血清代谢 标记物的诊断效果是较为显著的，以单一血清代谢标记物进行诊断具有一定的临床研究价 值。
[0026] 为了使诊断效果更好，可以将血清代谢标记物组合进行使用，例如可以根据血 清代谢标记物与代谢通路之间的关系进行组合，形成以下8种诊断标记物：（a)beta-丙 氨酸-赖氨酸（beta-Ala-Lys)和左旋肌肽（L-Carnosine)的组合；(b)顺-9-十六碳 稀酸（cis-9-Palmitoleic acid)、棕榈酸（Palmitic acid)和油酸（OleicAcid)的组 合；（c)溶血磷脂酸LPA (18:1 (9Z) /0:0)、溶血卵磷脂LysoPC (14:0/0:0)、溶血卵磷脂 LysoPC(18:2(9Z，12Z))和溶血卵磷脂 LysoPC(24:0)的组合；（d)磷脂 PC(14:1(9Z)/ P-18:1(11Z))、磷脂 PC(16:0/18:2 (9Z, 12Z))、磷脂 PC(24:1(15Z)/22:6 (4Z, 7Z,10Z,13 Z，16Z，19Z))和亚油酸（Linoleic acid)的组合；（e)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)、 L-酪氨酸（L-Tyrosine)和 L-色氨酸（L-Tryptophan)的组合；（f)皮质醇（Cortisol)、 甘氨胆酸（GlycocholicAcid)和牛磺胆酸盐（Taurocholate)的组合；(g)次黄噪呤 (Hypoxanthine)、尿囊酸（Allantoic acid)和肌苷（Inosine)的组合；(h)l-磷酸鞘氨醇 (Sphingosine Ι-phosphate)、硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇 3-〇-Sulfogalactosylceramide (dl8:1/20:0)和乳糖神经酰胺 Lactosylceramide (dl8:1/22:0)的组合。 还可以选择AUC效果好的几种代谢标记物进行组合形成诊断标记物，例如，诊断标记物 可以为下述血清代谢标记物中的两种或两种以上的组合：溶血磷脂酸LPA (18:1 (9Z) /0:0)， 溶血卵磷脂LysoPC(14:0/0:0)，溶血卵磷脂LysoPC(18:2(9Z，12Z))，溶血卵磷脂 1^8〇卩(：(24:0)，磷脂？〇（14:1(92)/?-18:1(112))，磷脂？〇（16:0/18:2(92，122))，磷 脂卩以24 :1(152)/22:6(42,72，102，132，162，192))，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（嫩腿)，皮 质醇（Cortisol), L-色氨酸（L-Trypto phan),牛磺胆酸盐（Taurocholate),次黄噪呤 (Hypoxanthine),肌苷（Inosine),硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇 3-〇-Sulfogalactosylcerami de (dl8:1/20:0)，乳糖神经酰胺 Lactosylceramide (dl8:1/22:0)。
[0027] 还可以为下述7种血清代谢标记物中的两种或两种以上的组合：溶 血磷脂酸LPA(18:1 (9Z)/0:0)、溶血卵磷脂LysoPC(14:0/0:0)、溶血卵磷脂 LysoPC (18:2 (9Z, 12Z))、溶血卵磷脂 LysoPC (24:0)、磷脂 PC (14:1 (9Z) /P-18:1 (11Z))、磷 脂 PC (16:0/18:2 (9Z, 12Z))和磷脂 PC (24:1 (15Z) /22:6 (4Z, 7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z))。 还可以为下述5种血清代谢标记物中的两种或两种以上的组合：L-酪氨酸 (L-Tyrosine)、L-色氨酸（L-Tryptophan)、甘氨胆酸（Glycocholic Acid)、牛磺胆酸盐 (Taurocholate)和皮质醇（C ortisol) 〇 表3.食管癌与健康对照间差异表达的25种血清代谢标记物
FDR为假发现率（多重比较）；AUC为ROC曲线下面积；FC为fold change变化倍数； RSD%为基于质量控制样本计算的变异系数。 下面，详细列举本发明3种优选诊断标记物的进一步应用效果，其他诊断标记物的应 用情况在此不再一一列举。 8、食管癌早期诊断模型及外部验证
[0028] 8. 1以上述鉴定的25个血清代谢标记物的组合作为诊断标记物，在训