表示载玻片17、生物样品 16和流体腔15内部的介电常数。
[0049] OIRD信号的基频Λ I (Ω)和倍频Λ 1(2 Ω)信号分别正比于Ap-As的虚部和实 部。对于不同的生物样品、或同一样品的不同浓度、或生物分子之间的反应，OIRD信号的基 频和倍频信号都会有差异，从而能够在OIRD信号中获得生物分子或生物分子反应的信息。
[0050] 如果生物样品16、流体腔15内的液体以及载玻片17都是透明的，或者说它们的介 电常数e s、ede。都只有实数，则由公式⑴可知，有实部，因此OIRD信号将只 有一路基频（虚部）信号。
[0051] 根据本发明的一个方面，提供一种生物芯片，其中在载玻片与生物样品之间设置 一缓冲层。缓冲层与载玻片之间形成第一界面，缓冲层与生物样品之间形成第二界面。通 过理论计算可知，由于该第一界面和第二界面上的反射光引起的干涉作用，使OIRD信号中 的基频和倍频信号的强度都随着缓冲层厚度的改变而发生周期性的变化。换句话说，随着 缓冲层厚度的不同，OIRD基频和倍频信号的强度可以在正极大值和负极大值之间变化。因 此，通过合理地设置缓冲层的厚度，可同时获取基频和倍频两路信号，还可以使OIRD信号 的基频或倍频信号的强度获得最大值，从而提高OIRD检测方法的检测灵敏度和分辨率。
[0052] 另外，由于采用本发明提供的生物芯片，可同时获取两路信号（基频和倍频），而 根据两路信号就可拟合出被检测生物样品的一些物理特性。这是目前基于"三层模型"的 生物芯片（只能获取一路基频信号）所实现不了的。
[0053] 根据本发明的一个实施例提供了一种生物芯片，其结构如图3所示，包括：
[0054] 载玻片2 ;
[0055] 载玻片2上的缓冲层5 ;
[0056] 附着在缓冲层5上厚度为Inm的活化层3 ;
[0057] 多个生物样品1，以矩阵状、单分子层的形式被固定在活化层3上；
[0058] 流体腔4,覆盖在载玻片2上，流体腔4中提供有反应液，用于和多个生物样品1反 应。
[0059] 由于活化层3的厚度很薄，可忽略其对检测结果的影响，因此只需考虑生物芯片 中的载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4这四层的作用，因此本发明提供的生物芯片 也可被称作是基于"四层模型"的生物芯片。
[0060] 通过理论计算可知，本实施例提供的"四层模型"生物芯片所得到的OIRD信号中， 基频和倍频信号的强度都随着缓冲层5的厚度的改变而发生周期性的变化。下文中将给出 该理论计算的推导过程。
[0061] 图4a和图4b示出了在进行OIRD检测时，四层模型生物芯片中的光路图（其中活 化层3由于非常薄而被省略）。其中图4a为生物芯片表面没有结合生物样品1的区域（包 括载玻片2、缓冲层5和流体腔3三层）的光路图，而图4b为生物芯片表面结合了生物样品 1的区域（包括载玻片2、缓冲层5、生物样品1和流体腔4四层）的光路图。
[0062] 根据OIRD的基本原理，在四层模型下，OIRD检测生物芯片的基频信号Λ I (Ω)和 倍频信号Λ I (Ω)可以分别表示成：
[0063] Δ I ( Ω ) = I0 [ I r4p I I r4s | sin ( φ 4ρ- φ 0- φ 4s) -1 r3p | | r3s | sin ( φ 3ρ- φ 0- φ 3s) ] J1 ( jt ) sin2 α (2) Δ I (2 Ω ) = I0 [ (| r4p |2-1 r3p |2) cos2 α - (| r4s |2-1 r3s |2) sin2 α ] J2 ( jt ) (3)
[0064] 其中 I。是初始光强，I r4p I、I r4s I、I r3p I 和 I r3s I 分别是 r4p 和;r4s 的幅值，Φ 4ρ、Φ 4s、 Φ3ρ和Φ3；5分别是r4p、r4s、r 3p和r3s的相位（幅角）；Φ。是半波片引入的相位差；α是检 偏器光轴的角度，J1O )和J2( π )分别是一阶和二阶贝塞尔函数，其值分别为〇. 2846和 0.4854。
[0065] 下面参照图4a和图4b详细的说明上述公式（2)和（3)中各个物理量的定义、推 导和参数选取。
[0066] 如图4a和图4b所不，λ表不入射光，r3p和r3s表不生物芯片表面没有结合生物 样品1的区域对P和s偏振光的反射率，r 4p和r4s表示生物芯片表面结合有生物样品1的 区域对P和s偏振光的反射率。其中ε s、ε ρ、ε d和ε。分别表示载玻片2、缓冲层5、生物 样品1和流体腔4的介电常数，而€.、分别表不在载玻片2、缓冲层5、生物样 品1和流体腔4中的折射角。h为缓冲层5的厚度，d为生物样品1的厚度。
[0067] 在生物芯片表面的没有结合生物样品1的区域中，p和s偏振光的反射率r3p和r 3s 分别表示为：
[0068]
[0069]
[0070] 其中，和分别表示在载波片2和活化层3界面对p偏振光和s偏振光的反 射率，?和分别表示在活化层3和流体腔4界面对p偏振光和s偏振光的反射率。
[0071] 在生物芯片表面的结合生物样品1的区域中，P和S偏振光的反射率r4p、r 4s分别 表示为：
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 和端1*分别表示在活化层3和生物样品层1界面对p偏振光和s偏振光的反射 率，分别表示在生物样品层1和流体腔4界面对P偏振光和s偏振光的反射率。
[0076] -般由介电常数为ε a和ε b的两种材料a和b构成的界面对p和s偏振光的反 射率可以由下面的公式给出：
[0077]
[0078]
[0079] 其中外和_分别为入射光在a、b两种介质中的折射角。
[0080] 因此根据公式⑶和（9)，代入具体介质的介电常数就可以计算各个 界面对P和S偏振态的反射率。换句话说，也就是可以用公式⑶和（9)得到： Jp) ru> "(p) r"> ?Λρ) 1 Λρ) Λ^) fsp 、1Ψ、rPQ、 V、 }pd ^ V、 7?/?、 /0 °
[0081] 我们将公式（4)-(7)代入到公式（2)和（3)，忽略初始光强I。，并给定相应的参数， 就能计算出OIRD基频和倍频信号强度随缓冲层5厚度的变化规律。
[0082] 例如，在根据本发明的一个实施例中，探测激光的波长λ = 632. 8nm，在玻片2内 部的入射角外:=3Γ，玻片2的折射率ns = 1. 5,流体腔4内的液体（反应溶液）的折射 率近似等于水的折射率n。= 1. 33,缓冲层5的折射率np = 1. 54,生物样品1的折射率为 1.52。OIRD检测装置中相移器的相位差取Φ。= Φ3ρ-Φ3；5，检偏器的角度α =45°。生物 样品1的厚度d = lnm。
[0083] 将上述参数带入公式（2)和（3)中可知，当透明缓冲层5的厚度h从0到500nm 时，OIRD信号中的基频信号强度和倍频信号强度的变化情况如图5a和图5b所示。根据缓 冲层厚度的不同，OIRD的基频信号强度和倍频信号强度在负极大值和正极大值之间变化。
[0084] 如图5a所示，若缓冲层5的厚度h为0, 250和500nm时，则基频信号的强度到达负 的极大值。若缓冲层5的厚度h为125和375nm时，基频信号的强度达到正的极大值。而 当缓冲层5的厚度分别为40, 210, 280和400nm时，基频信号的强度为0。
[0085] 如图5b所示，若缓冲层5的厚度h分别为60和310nm时，倍频信号的强度到达正 的极大值。在缓冲层5的厚度h分别为185和435nm时，倍频信号的强度达到负的极大值。 当缓冲层的5厚度h分别为0,125, 250和500nm时，倍频信号的强度为0。
[0086] 由此可见，本领域技术人员可以根据实际需要而选择合适的缓冲层5厚度h，以获 得最大的倍频信号强度或最大的基频信号强度，从而提高OIRD检测的灵敏度和分辨率。或 者可以通过选择合适的缓冲层5的厚度h，而同时获得强度均较大的倍频信号强度和基频 信号强度，其中优选为，基频信号的强度超过其负极大值或其正极大值的50%，且倍频信 号的强度超过其负极大值或其正极大值的50%。例如缓冲层5的厚度h为75nm或150nm 等某些特殊的厚度，就可同时获得信号强度较为理想的基频和倍频两路信号，从而在提高 OIRD检测的灵敏度和分辨率的同时，还能够根据两路信号拟合出被检测生物样品的一些物 理特性。
[0087] 另外，本发明还提供了一种用于检测根据本发明的基于"四层模型"的生物芯片的 OIRD检测方法。
[0088] 现有技术中的OIRD检测方法中，检测前都必须对基频和倍频信号同时背底"调 零"。然而，在使用本发明提供的生物芯片的情况下，在OIRD检测之前，不必要对基频和倍 频信号同时调零。
[0089] 在OIRD检测中，OIRD检测装置中的光电探测器所检测到的值为OIRD信号与背底 信号的叠加。为了使检测结果更精确，当背底信号和OIRD信号均为正值或均为负值时，通 常会通过背底调零，使背底信号的绝对值尽可能地小，从而提高信噪比。
[0090] 然而,对于背底信号和OIRD信号为一正、一负时，背底信号的绝对值如果过小，会 导致OIRD信号的幅度减小，反而对结果的精确度不利。这是因为，OIRD检测装置中的光电 探测器只能够检测信号值的大小，而无法检测出信号为正值还是负值。因此，当背底信号与 OIRD信号叠加后，由于正负抵消，OIRD信号的幅度会减小。例如当背底信号为0. 6mV，OIRD 信号为-ImV时，光电探测器所检测到的信号为二者叠加后的信号的绝对值，即0. 6mV。此时 光电探测器所检测到的值在〇. 6mV