于反应皿中间通 道，然后将其固定于反应皿的中间，再向反应皿的两侧中加入超纯水，浸泡24h后，依次用 无水乙醇和超纯水清洗上述的反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干； (2. 2)配制5mM的2-羧乙基磷酸溶液，溶剂为超纯水；将2-羧乙基磷酸溶液加入反应 皿的两侧，2-羧乙基磷酸溶液体积为使得纳米孔阵列恰好完全浸泡在2-羧乙基磷酸溶液 中；在室温下，避光静置72h，2-羧乙基磷酸中的磷酸根吸附于纳米孔阵列的表面，进而将 2-羧乙基磷酸固定于纳米孔阵列上；之后再吸出反应皿中残留的2-羧乙基磷酸溶液，然后 用超纯水清洗反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干； (2. 3)在反应皿的两侧分别加入8mg/ml的EDC(l-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚 胺盐酸盐）溶液和12mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的体积 均为2-羧乙基磷酸溶液体积的二分之一，EDC溶液的溶剂为0.1 M MES缓冲液，NHS溶液的 溶剂为〇. IM PBS缓冲液，室温下静置15min后，再加入饱和似110)3溶液调节反应皿中溶液 pH 至 7. 2-7. 4 ; (2. 4)在反应皿的两侧分别加入与EDC溶液等体积的20 y g/ml人气味结合蛋白溶液， 人气味结合蛋白溶液的溶质为人气味结合蛋白，溶剂为〇. IM PBS缓冲液，内含质量百分比 为5%的海藻糖和质量百分比为5%的甘露醇；将反应皿置于4°C条件下静置2h，使得人气 味结合蛋白与2-羧乙基磷酸溶液中的2-羧乙基磷酸的羧基发生脱水缩合作用而形成稳定 的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出反应皿中残留的液体，再向反应皿两侧加满0.1 M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，即可获得基于纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感 器，置于4°C条件下备用。2. -种应用权利要求1所述纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器检测脂肪酸和醛类 物质的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 配制苯甲醛和二十二碳六烯酸的标准样品溶液：采用分析纯为99%的苯甲醛和分 析纯为99%的二十二碳六烯酸标准贮备溶液分别稀释配制5种不同浓度梯度的标准样品 溶液，稀释液是分析纯为99 %的甲醇溶液； (2) 纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器构建的表征：首先是三电极检测系统的连 接，先将三电极中金工作电极的一端连接电化学工作站的工作输入端，金工作电极的另一 端插入反应皿中；银/氯化银参比电极的一端连接电化学工作站的参比输入端，铂丝对电 极的一端连接电化学工作站的对电极输入端；银/氯化银参比电极和铂丝对电极的另外 一端同时插入反应皿的另外一侧；当反应皿中间没有纳米孔阵列时，向反应皿的两侧中分 别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有IOmM铁氰化 钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1 M的KCl，溶剂为超纯水，再向反应皿的两侧中分别加入与氧化还 原对溶液等体积的甲醇溶液，直接进行电化学阻抗图谱扫描，具体测试参数为初始电压为 〇. 2V，交流电压幅度为5mV，扫频范围为IHz~1MHz，最后得到无纳米孔阵列的电化学阻抗 图谱；之后利用相同的测量方法，测量纳米孔阵列固定于反应皿中的电化学阻抗图谱，以及 纳米孔阵列上固定人气味结合蛋白之后的电化学阻抗图谱，利用检测到的三条电化学阻抗 图谱表征纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的构建； (3) 检测苯甲醛标准样品溶液：三电极检测系统的连接及具体测试参数同步骤2,测试 传感器是纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，首先进行空白对照溶液电化学阻抗图谱的 测量，向反应皿的两侧中分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液，氧化还 原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1 M的KC1，溶剂为超纯水，再向反应 皿的两侧中分别加入与氧化还原对溶液等体积的甲醇溶液，通过电化学工作站对纳米孔阵 列的人气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱；测量结束后 吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加满PBS缓冲液，静置5min后缓慢 吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列，消除上次测量残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及PBS 缓冲液的混合溶液影响；之后再进行苯甲醛标准样品溶液的检测，向反应皿的两侧分别加 入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液和已知物质的量浓度的苯甲醛标准样品 溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的苯甲醛标准样品溶液对应的 电化学阻抗图谱；测量结束后吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加满 PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列； (4) 重复步骤3中苯甲醛标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5种不 同浓度梯度的苯甲醛标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的电化学阻抗图谱； (5) 建立纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的等效电路模型：三电极（包含金工作 电极，银/氯化银对电极，铂丝对电极）检测系统由经典Randles模型等效，包含溶液阻抗 R s，电子转移电阻Rm Warburg阻抗Zw，及常相角元件CPE ;纳米孔阵列等效电路为纳米孔电 阻Rpcira和纳米孔电容Cp_的并联电路；人气味结合蛋白的等效电路为人气味结合蛋白电阻 R p和人气味结合蛋白电容Cp的并联电路；其中，随着苯甲醛标准样品溶液的浓度增加，人气 味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R在增加，其中R = (Rp_+Rp)/2 ; (6) 建立苯甲醛分子标准浓度-归一化阻抗曲线：利用步骤2-4中检测到的空白溶液 和5种不同浓度梯度下的苯甲醛标准样品溶液的电化学阻抗图谱，和步骤5建立的等效电 路模型计算人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗R，从而计算归一化阻抗，即标准样品溶 液对应的人气味结合蛋白修饰的纳米孔阵列阻抗&与空白对照溶液对应的人气味结合蛋 白修饰的纳米孔阵列阻抗Rc的差值相对于空白对照溶液对应的人气味结合蛋白修饰的纳 米孔阵列阻抗Rc的变化百分比（R 1-Rc)/?，得到苯甲醛标准样品溶液浓度与归一化阻抗之 间的关系曲线y = ax+b，其中，X为苯甲醛标准样品溶液浓度，y为归一化阻抗，a和b为常 数，实现对苯甲醛分子的检测； (7) 检测二十二碳六烯酸标准样品溶液，建立二十二碳六烯酸分子标准浓度-归一化 阻抗曲线，方法同步骤2-6,最终得到5种不同浓度梯度下的二十二碳六烯酸标准样品溶液 的电化学阻抗图谱与二十二碳六烯酸分子标准浓度-归一化阻抗曲线； (8)完成待测苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的检测，测量得到待测 苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的电化学阻抗图谱及归一化阻抗，对应得 出待测苯甲醛样品溶液和待测二十二碳六烯酸样品溶液的浓度。
【专利摘要】本发明公开了一种纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法与应用，本发明利用标准的两步阳极氧化法制备的纳米孔阵列，使用2-羧乙基磷酸处理纳米孔阵列，进而固定人气味结合蛋白，将固定有人气味结合蛋白的纳米孔阵列固定于设计的反应皿中，获得所述传感器。采用电化学阻抗测试方法，及等效电路分析方法，本发明将人气味结合蛋白固定于纳米孔阵列上，用于检测与疾病相关的脂肪酸(二十二碳六烯酸)分子和醛类分子(苯甲醛)。本发明构建的电化学传感器检测灵敏度高，检测下限低。
【IPC分类】G01N27/26
【公开号】CN105136877
【申请号】CN201510482148
【发明人】刘清君, 卢妍利, 张迪鸣, 姚瑶, 张倩, 李爽
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月3日