用于确定同分异构分析物的方法和试剂的制作方法
【专利说明】用于确定同分异构分析物的方法和试剂
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请要求2013年2月28日提交的非临时性申请美国序列号13/780, 305在35 U.S.C. 119(e)下的权益，在此将其全部内容通过引用明确并入本文。
【背景技术】 [0002] 本发明涉及用于在怀疑含有同分异构分析物的样品中确定两种或更多种同分异构分 析物的每种的存在和/或量的组合物、方法和试剂盒。
[0003] 许多小分子化合物或半抗原，例如药物和维生素，以同分异构形式存在，其中只有 一种形式是活性的。为了获得分析物的活性形式的准确测量，必须解决该分析物的非活性 同分异构体的存在。取决于该分析物的活性形式的功能，测量分析物的两种同分异构形式 (即活性形式和非活性形式）可导致可能对个体不利的不准确性。准确地评估生物样品中 一对同分异构分析物的每种的水平是重要的，尤其当仅一种同分异构体是活性的，并且包 含非活性同分异构体的量的测量扭曲了样品中分析物的水平。例如，测量生物样品中的维 生素D水平是重要的，因为维生素D缺乏与哺乳动物中许多病症有关。在婴儿中，例如，包 含3-差向异构体的量的维生素D测量可导致婴儿中维生素D水平的不准确评估，这进而可 导致缺乏合适的补充。测量维生素D的活性形式是重要的，以使婴儿可以接受合适的维生 素D治疗（如有必要）。
[0004] 术语"维生素D"表示一类脂溶性开环留类化合物。在人体中，维生素D是独特的， 因为它可作为胆钙化留醇（维生素D 3)或麦角钙化留醇（维生素D2)被摄取，以及因为人体 也可以在日照充足时（由胆留醇）合成维生素D。由于此后一性能，一些人认为维生素D是 非必要膳食维生素，但大多数人认为它是必要营养素。维生素D在钙离子体内平衡的正调 节中具有重要的生理作用。维生素D 3是由动物合成的维生素形式。维生素D2也是乳制品 和某些食品中添加的常见补充剂。
[0005] 膳食和体内合成的维生素％二者都必须经历代谢活化来产生生物活性代谢物。 在人体中，维生素D 3活化的初始步骤主要在肝脏中发生并涉及羟基化以形成中间代谢物 25-羟基胆钙化留醇（也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟基胆钙化留醇或25-羟基维生素 D 3)。钙二醇是维生素D3在循环系统中的主要形式。维生素D 2也经历类似的代谢活化，成 为25-羟基维生素D2。这些化合物共同地被称作25-羟基维生素D (缩写为25 (OH) D)，并 且它们是在血清中测量以确定维生素D状态的主要代谢物；25 (OH)D及其差向异构体二者 都为需要被转化成1，25 (OH) D以发挥生物作用的预激素。1，25 (OH) D的生物活性与3-差 向-1，25 (OH)D的生物活性的比较是复杂的。
[0006] 维生素D化合物25-羟基维生素％和25-羟基维生素D 2在3-位是差向异构的， 所述差向异构体分别被命名为25-羟基维生素％和3-差向-25-羟基维生素D 3和25-羟 基维生素％和3-差向-25-羟基维生素D 2。只有这些差向异构化合物的每种的一种差向 异构体，即分别是25-羟基维生素％和25-羟基维生素D 2是活性的。25-羟基维生素D 3和 25-羟基维生素D2的差向异构体的结构在图1中阐述。
[0007] 存在用于准确和灵敏地确定怀疑含有这样的分析物的样品中的同分异构分析物 的浓度的试剂和方法的需要。例如，存在用于准确和灵敏地确定维生素D的差向异构形式 的浓度的试剂和方法的需要。
[0008] 概述 根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异 构分析物的量的方法。在所述方法中，确定第一测量值和第二测量值。为了确定所述第一 测量值，通过使用第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第一同分异构分析物和第 二同分异构分析物的总量，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物与所述第二同分异构 分析物的每种展示出足够的测定结合亲合力。为了确定所述第二测量值，通过使用所述第 一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第二同分异构分析物的量，其中过量使用结合 至所述第一同分异构分析物但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力 且对所述第二同分异构分析物基本无测定结合亲合力的第二抗体，以阻挡所述第一同分异 构分析物结合至所述第一抗体。使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构 分析物的量。从所述第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等 同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
[0009] 根据本文描述的原理的一些实例涉及确定样品中第一同分异构体分析物和第二 同分异构分析物的量的方法。在所述方法中，确定第一测量值和第二测量值。为了确定所 述第一测量值，通过使用第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第一同分异构分析 物和第二同分异构分析物的总量，所述第一抗体对所述第一同分异构分析物和所述第二同 分异构分析物的每种具有至少约IO 7升/摩尔（liters/mole)的结合亲合力。为了确定所 述第二测量值，通过使用所述第一抗体在样品的部分上进行测定来测量所述第二同分异构 分析物的量，以获得第二测量值，其中过量使用对所述第一同分异构分析物具有约IO 6至约 1012升/摩尔的结合亲合力以及对所述第二同分异构分析物具有小于约 104升/摩尔的结 合亲合力的第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一抗体。使所述第二 测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量，并且从所述第一测量值减去所 述第二测量值以得到所得值，使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物 的量。
【附图说明】
[0010] 图1是25-羟基维生素％和25-羟基维生素D2的差向异构形式的化学式的描述。
[0011] 图2是描述按照根据本文描述的原理的实例，加入和不加入第二抗体的3-差向-25-羟基维生素％的维生素D测量的曲线图。
[0012] 图3是描述按照根据本文描述的原理的实例，加入和不加入第二抗体的3-差向-25-羟基维生素％的维生素D测量的曲线图。
[0013] 具体实施方案的详细说明 常规讨论 根据本文描述的原理的方法使分析物的两种同分异构体的一种的交叉反应性 (cross-reactivity)最小化并测量其量，其中一种同分异构体或它的代谢产物是有效的， 而另一种同分异构体或它的代谢产物是无效的。术语"有效的"表示分析物关于具体功能 的活性的程度，所述具体功能可以是例如生物功能，例如骨骼代谢。例如，物质的生物活性 与所述物质增强或抑制例如保持受试者中的矿物质和盐的适当水平、细胞功能的生物功能 的能力有关。通过说明而非限制的方式，维生素D保持受试者中与钙稳态和骨骼代谢有关 的钙与磷酸盐的适当水平。
[0014] 方法包括确定样品中第一同分异构分析物与第二同分异构分析物的量。确定第一 测量值和第二测量值。所述第一测量值代表所述第一同分异构分析物与所述第二同分异构 分析物的总量。所述第二测量值仅代表所述第二同分异构分析物的量。从所述第一测量值 减去所述第二测量值，以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同 分异构分析物的量。
[0015] 在根据本文描述的原理的方法中，使用至少两部分待分析的样品。使用结合至所 述分析物的两种同分异构形式的抗体（第一抗体）在怀疑含有分析物的至少两种同分异构 形式的样品的第一部分上进行测定。所述第一抗体对所述第一同分异构分析物与所述第二 同分异构分析物的每种展示足够的测定结合亲合力。
[0016] 短语"测定结合亲合力"表示抗体结合至相应的分析物以产生结合至分析物的抗 体的复合物的强度。
[0017] 短语"足够的测定结合亲合力"表示抗体对分析物的结合亲合力是产生足以获得 导致准确和灵敏测定分析物的测定信号的量的可检测复合物的结合亲合力。所述第一抗体 的结合亲合力足够强以形成所述第一抗体与第一同分异构分析物和第二同分异构分析物 的每种的可检测复合物，一旦测定系统和仪器已经经过合适的校准且已采用了任何对所述 同分异构分析物之一或二者的抗体识别的校正因子，则可检测复合物准确地代表样品中所 述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的量。在所述样品的第一部分上的该测 定测量样品中分析物的两种同分异构形式的量或浓度。
[0018] 使用结合至所述分析物的两种同分异构形式的第一抗体和结合至所述同分异构 形式之一（第一同分异构形式）但对另一种同分异构形式（第二同分异构形式）基本不展 示结合亲合力，使得所述第二同分异构形式在所述第二部分上进行的测定中免于被所述第 一抗体检测的第二抗体二者在相同样品的第二部分上进行相同的测定。所述结合至所述第 一同分异构形式但不结合至所述第二同分异构形式的第二抗体对所述第一同分异构分析 物展示出不足的测定结合亲合力。在一些实例中，所述结合至同分异构形式之一但不结合 至另一种同分异构形式的第二抗体结合至活性同分异构形式但不结合至非活性同分异构 形式。在所述样品的第二部分上的所述测定仅测量所述分析物的同分异构形式的一种，BP 上述中的第二同分异构分析物的浓度。可以使用获得的信号值确定总的分析物浓度和所述 分析物的两种同分异构形式的每种的浓度。
[0019] 短语"不足的测定结合亲合力"表示所述第二抗体对同分异构分析物的结合亲合 力小于所述第一抗体对同分异构分析物的结合亲合力。在一些实例中，短语"不足的测定结 合亲合力"表示所述第二抗体对同分异构分析物的结合亲合力不大至足够在所述第二抗体 与所述第一同分异构分析物之间形成可检测复合物，从而任何可检测复合物都不会准确地 代表所述第一同分异构分析物的量。当过量使用时，所述第二抗体展示出对所述第一同分 异构分析物的足够的结合亲合力，以阻挡在所述样品的第二部分上的测定中所述第一抗体 结合至所述第一同分异构分析物。所述第二抗体对所述分析物的第一同分异构形式的结合 亲合力太低，以至不会产生第二抗体和第一同分异构分析物的复合物，使得在采用的测定 中产生用于准确检测所述第一同分异构分析物的足够的信号。
[0020] 对于所述第二同分异构形式的短语"基本不展示结合亲合力"表示在所述第二抗 体与所述分析物的第二同分异构形式之间基本不形成可检测复合物。
[0021] 应该注意的是，如果来自所述样品的第二部分上的测定的结果基本等于零，则从 所述样品的第一部分上的测定获得的结果代表所述分析物的两种同分异构形式的仅一种 的浓度，因为未在所述样品的第二部分上的测定中检测到所述分析物的另一种同分异构形 式。在这样的情况下，无需在考虑中的所述样品的两个部分上进行测定，因为来自根据本文 描述的原理的方法的结果表明只有一种所述分析物的同分异构形式对在所述样品的第一 部分上的测定中获得的信号作出贡献。另一方面，如果来自所述样品的第二部分上的测定 的结果基本不等于零，则从所述样品的第一部分上的测定获得的结果代表所述分析物的两 种同分异构形式的浓度，因为在所述样品的第二部分上的测定中检测到所述分析物的另一 种同分异构形式。在这样的情况下，需要在考虑中的所述样品的两个部分上进行测定，因为 来自根据本文描述的原理的方法的结果表明所述分析物的两种同分异构形式对在所述样 品的第一部分上的测定中获得的信号都作出贡献。
[0022] 抗体的制备 通过说明而非限制的方式描述根据本文描述的原理制备抗体的方法的实例。需要至少 两种不同的抗体，所述抗体具有根据本文描述的原理的性能。一种抗体对所述第一同分异 构分析物和所述第二同分异构分析物二者都展示出足够的测定结合亲合力。另一种抗体结 合至所述第一同分异构分析物，但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合 力，且对所述第二同分异构分析物基本不展示出测定结合亲合力。
[0023] 在根据本文描述的原理的一些实例中，足够的测定结合亲合力为例如至少约IO7 升/摩尔，或者至少约IO8升/摩尔，或者至少约IO9升/摩尔，或者至少约101°升/摩尔， 或者至少约IO 11升/摩尔，或者至少约10 12升/摩尔，或者至少约10 13升/摩尔，或者至少 约1014升/摩尔，并且可检测复合物的量足以获得导致准确和灵敏测定所述分析物的测定 信号。在根据本文描述的原理的一些实例中，足够的测定结合亲合力为例如约IO 7至约1〇14 升/摩尔，或约IO7至约10 11升/摩尔，或约10 7至约10 12升/摩尔，或约10 8至约10 14升/ 摩尔，或约IO8至约10 11升/摩尔，或约10 8至约10 12升/摩尔。
[0024] 在一些实例中，不足的测定结合亲合力表示所述第二抗体对第一同分异构分析物 的结合亲合力小于所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力。在一些实例 中，取决于所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲合力，所述第二抗体对所述 第一同分异构分析物的结合亲合力比所述第一抗体对所述第一同分异构分析物的结合亲 合力小例如约10、或约1〇 2、或约1〇3、或约1〇4、或约IO5倍。例如，如果所述第一种抗体对所 述第一同分异构分析物的结合亲合力是约IO 9升/摩尔，则所述第二抗体的结合亲合力可 以小于约IO7升/摩尔，或小于约IO6升/摩尔。在根据本文描述的原理的一些实例中，不 足的测定结合亲合力表示抗体对分析物的结合亲合力为例如约IO 6至约IO8升/摩尔，或约 IO6至约10 7升/摩尔，取决于所述抗体的性质和所述分析物的性质。
[0025] 在一些实