、Centaur?XP 或 Centaur?CP 设备（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)在第一和第二样品部分上进行所述测定。在以上吖啶酯测定的变体中， 所述小分子可以是例如生物素或荧光素，并且所述小分子的结合配偶体可以分别是例如抗 生物素蛋白或抗生蛋白链菌素或荧光素抗体。
[0078] 可以测定的样品中的同分异构分析物的浓度通常为例如约10 5至约10 17 M，或约 10 6至约10 14 M。例如所述测定是定性的、半定量的还是定量的（相对于存在于样品中的分 析物的量）、具体的检测技术和分析物的预期浓度的考虑通常决定各种试剂的浓度。
[0079] 测定培养基中各种试剂的浓度将通常由所考虑的分析物的浓度范围、所述测定的 性质等决定。然而，每种试剂的最终浓度通常凭经验确定，以最优化考虑范围内测定的灵敏 度。即，显著的分析物浓度变化将提供可精确测量的信号差异。例如信号产生系统的性质 和所述分析物的性质的考虑通常决定各种试剂的浓度。
[0080] 如上所述，在培养基中以组合提供所述样品和试剂。尽管加入至所述培养基的顺 序可以改变，但对于本文描述的测定形式的一些实施方案将存在一定的优选。最简单的加 入顺序当然是同时加入所有的材料，并确定所述测定培养基对信号的影响，如在均质测定 中。或者，可以按顺序将每种试剂或试剂组组合。在一些实施方案中，在如上所讨论的各个 加入步骤之后，可以包括培养步骤。在非均质测定中，在一个或多个培养步骤之后还可以使 用洗涤步骤。
[0081] 根据本文描述的原理的一些实例涉及确定怀疑含有维生素D的样品中维生素D的 两种同分异构形式的一种或二者的存在和量的一种或二者并且可以在本文中被称为"维生 素D的测定"的方法。如本文所使用的，关于测定的术语"维生素D"表示25-羟基胆钙化甾 醇（也被称为钙二醇、骨化二醇、25-羟胆钙化留醇或25-羟基维生素D(缩写为25(0H)D); 钙二醇；1，25-二羟基维生素D 3 (钙三醇；1，25 (OH) 2D3) ; 1，25-二羟基维生素D4; 1，25-二羟 基维生素D5;和1，25-二羟基维生素D 6;包括以上所有的代谢物的一种或多种的一种或多 种非差向和差向形式。
[0082] 检验步骤 在测定方法的一个步骤中，检验培养基以验证根据本文描述的原理的含有分析物的一 种或多种同分异构形式和分析物的抗体的复合物的存在。一种或两种复合物的存在和/或 量指示样品中分析物的一种或多种同分异构形式的存在和/或量。
[0083] 短语"测量分析物的量"表示定量、半定量和定性测定分析物的一种或多种同分异 构形式。定量、半定量和定性的方法及所有其它用于确定分析物的方法被认为是测量所述 分析物的量的方法。例如，仅检测怀疑含有所述分析物的样品中的分析物的存在或不存在 的方法被认为包括在本发明的范围之内。术语"检测"和确定以及测量的其它常见同义词 预期在本发明的范围内。
[0084] 在许多实施方案中，检验培养基包括检测来自所述培养基的信号。该信号的存在 和/或量与样品中的分析物的一种或多种同分异构形式的存在和/或量有关。检测的具体 方式取决于信号产生系统的性质。如上所讨论的，存在许多方法，通过该方法产生信号的信 号标记物可以产生通过外部装置可检测的信号。信号产生系统的活化取决于信号产生系统 成员的性质。
[0085] 测量期间的温度通常为例如约10°C至约70°C，或约20°C至约45°C，或约20°C至约 25°C。在一种方法中，使用已知浓度的维生素D分析物形成标准曲线。也可以使用校准仪 和其它对照物。
[0086] 由任何标记物产生的冷光或光可以以目测、照相、光量测定、分光光度的形式测 量，例如通过使用光电倍增管或光电二极管，或通过任何其他适宜的装置来确定其量，这与 所述培养基中的分析物的量有关。信号的存在和/或量的检验还包括信号的检测，这通常 仅为其中读取信号的步骤。通常使用仪器读取该信号，所述仪器的性质取决于所述信号的 性质。所述仪器可以是，但不限于例如分光光度计、荧光计、吸收分光计、光度计和化学光度 计（chemiIuminometer)〇
[0087] 用于讲行测宙的包含试剂的试剂倉 可以制备用于在怀疑含有分析物的同分异构形式的样品部分上进行测定的试剂盒。所 述试剂盒包含用于在所述样品的各个部分上待进行测定的抗体试剂。因此，一种抗体试剂 包含对第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的每种展示出足够的测定结合亲合力 的抗体。包含第二抗体，其结合至所述第一同分异构分析物，但对所述第一同分异构分析物 展示出不足的测定结合亲合力且对所述第二同分异构分析物基本无测定结合亲合力。所述 试剂盒还可以包含用于进行所述测定的其它试剂，其性质取决于具体的测定形式。
[0088] 试剂可以各种在单独的容器中或各种试剂可以在一个或多个容器中混合，这取决 于所述试剂的交叉反应性和稳定性。所述试剂盒还可以包含用于进行测定的其它单独包装 的试剂，例如额外的特异性结合对成员、信号产生系统成员和辅助试剂。
[0089] 试剂盒中各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供显著最优化本发明方法期间 需要发生的反应和进一步显著最优化测定灵敏度的试剂浓度。在适当情况下，试剂盒中的 一种或多种试剂可以作为干粉，通常是冻干的，包含赋形剂提供，其在溶解时将提供对使用 根据本文描述的原理的化合物试剂进行方法或测定具有合适的浓度的试剂溶液。所述试剂 盒还可以包括使用包含根据本文描述的原理的化合物试剂的试剂的方法的书面说明书。
[0090] 如本文所用的名称"第一"和"第二"是完全任意的，并且不意图建议本发明方法 中所提及的部分中的任何顺序或排名或加入部分的任何顺序。
[0091] 如本文所用的短语"至少"表示指定项的数目可以等于或大于列举的数目。如本 文所用的短语"约"表示列举的数目可以相差加上或减去10% ;例如，"约5"表示4. 5至5. 5 的范围。
[0092] 通过说明而非限制的方式，下面的讨论涉及根据本文描述的原理的具体实施例； 所述具体实施例并不意在限制本公开内容和所附权利要求书的范围。在不脱离本公开内容 的精神和范围的基础上，可以设想多种修改和替代组合物、方法和系统。 实施例
[0093] 除非另外指出，下面的实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO)或 Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI) 〇 除非另 有说明，本文公开的份数和百分数以重量比体积计。
[0094] 定义： mg=毫克 g =克（S) ng =纳克（s) mL =毫升（s) μ L=微升（s) μ mol =微摩尔 °C =摄氏度 min=分钟（s) sec=秒（s) hr =小时（s) w/v=重量比体积 v/v=体积比体积 TLC =薄层色谱法 HPLC =高效液相色谱法 EDTA =乙二胺四乙酸 PEG =聚乙二醇 的EtOAc =乙酸乙酯 DMF =二甲基甲酰胺 DMSO =二甲基亚砜 MEOP = 1-甲氧基-2-丙醇 MES = 2-(N-吗啉基）乙磺酸 DI =蒸馏 UPA =超微粒分析仪 LOCI =发光氧通道免疫测定 Ab =抗体。
[0095] 制备对非差向-维牛素 D和差向-维牛素 D二者都展示出足够的测宙结合亲合力 的牛物素化的第一抗体 将维生素D抗体5H10 (来自Bioventix，Farnham，Surrey，UK的羊单克隆抗体）在10 mM P04、300 mM NaCl 中的 pH 7. 0 的溶液（0· 8 毫升，2. 63 mg/mL)与 43. 2 μ L 的 NHS-dPEG?4-生 物素（Quanta Biodesign Ltd.，Powell 0H，料号（part number) 10200)的水性溶液（2.0 mg/mL)混合。加入的生物素化试剂的量代表所述生物素化试剂对所述抗体的10倍摩尔挑 战。将反应混合物在室温下培养3小时，然后通过加入80 μ L的0. 5M TRIS将反应淬灭。将 反应混合物在Amicon? (YMlO)设备中进行与pH 7.0的10 mM P04、300 mM NaCl缓冲交换直 至流出物在260 nm的吸光度彡0· 03。将抗体溶液（1. 04 mL，2. I mg/mL蛋白质）与10 μ L 的 PR0CLIN?300 和 10 μ L 的使用 0· 2 μπι ACR0DISC? 注射器过滤器（Pall Corporation)过 滤的新霉素硫酸盐水性溶液（10 mg/mL)混合，并在2-8°C贮存。
[0096] EPRM-EDA珠粒的制备 将EPRM珠粒（2000 mg，20. 0 mL)加入到40 mL的小瓶。EPRM珠粒通过类似于在美 国专利号7, 179, 660中描述的程序制备，并且化学发光化合物中为含有铕的2-(4-(N，N， 二-十四烷基）-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩螯合物。将EDA(800 mg，890 μL)与10mL的 MES pH 6缓冲剂（"缓冲剂"）和约4.2 mL的6N HCl混合。所述混合物的pH是，或被调 节到约6. 9。利用涡流将所述EDA溶液加入到EPRM珠粒并将混合物在室温下摇动15分钟。 在15 mL的小瓶中将氰基硼氢化钠（400 mg)与10 mL去离子水混合并且将该组合物加入 到来自上述的珠粒混合物。将所述混合物在37°C下摇振18-20小时。将珠粒转移至六个 40 mL的离心管中。加入MES缓冲剂使体积达到35 mL，将所述混合物以19, 000 rpm离心 30分钟。滗析上清液，并用搅拌棒使珠粒再悬浮在2 mL的缓冲剂中，并且加入另外的缓冲 剂到35 mL。将混合物在18瓦特的功率下超声处理30秒，使用冰将混合物保持冷却。洗涤 /超声处理步骤进行4次，以除去所有活化化学物质。最后的MES缓冲剂离心后，将2mL的 含有5% MEOP和0. 1% Tween?20的缓冲剂（"第二缓冲剂"）加入到管中用于再悬浮步骤。 在超声处理之前加入另外的第二缓冲剂到35 mL。将珠粒悬浮液以19, 000 rpm离心30分 钟。弃去上清液。在各个管中最终超声处理使用12 mL的第二缓冲剂，以产生25 mg/mL的 稀释液。如在UPA仪器上确定的粒度为277 nm。
[0097] 以类似于在美国专利号6，153,442和美国专利申请公开号20050118727六中描述 的方法的方式制备EPRM发光珠粒（chemibead)，其相关公开内容通过引用并入本文中。所 述EPRM发光珠粒包含氨基葡聚糖内层和具有游离醛官能团的葡聚糖醛外层。参见例如，美 国专利号5, 929, 049、7, 179, 660和7, 172, 906,其相关公开内容通过引用并入本文。在使 用合适的缓冲剂，例如MES的缓冲水性介质中，反应在约0°C至约40°C的温度，约5. 5至约 7. 0,或约6的pH下进行约16至约64小时。通过加入合适的淬灭剂，例如羧甲基羟胺半盐 酸盐（CMO)淬灭所述反应，然后洗涤所述颗粒。
[0098] 在还原性胺化条件下，外部葡聚糖醛层上的醛基与乙二胺反应以形成具有包含亚 乙基链和末端胺基的侧链部分的试剂EPRM-EDA。还原性胺化条件包括使用还原剂，例如金 属氢化物。反应期间，所述反应在水性介质中在约20°C至约KKTC的温度下进行约1小时 至约48小时。
[0099] 25-OH维牛素 D2 3-氨基甲酸醅（25-OH维牛素 3-氨基甲酸醅）的合成 在氮气下在室温下在5mL烧瓶中（用箱片覆盖）将购自ChemReagents. com，Sugarland TX 的 22 mg (55 μ mol) 25-OH 维生素 D3、100 mg (420 μ mol)二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC)、 I mL无水乙腈中的100 μ L三乙胺的混合物搅拌18小时，以制备经活化的25-OH VD3。 TLC(EtOAc:己烷=2:1)显示没有起始材料残留。通过将150 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐 (CMO)、0.3 mL三乙胺和I mL DMF加入至IOmL烧瓶中制备悬浮液。在搅拌下将含有经活化 的25-OH VD3的溶液逐滴加入到CMO悬浮液中，所述搅拌持续另外18小时。施加真空以尽 可能除去溶剂（加热浴温度应不超过50°C)。将EtOAc (25 mL)加入到残余物中，用2 mL 盐水洗涤三次。将有机相用无水Na2SO4干燥并过滤；使用旋转蒸发仪除去溶剂。干燥后获 得粗产物（42 mg)并经HPLC纯化。在高真空下干燥后获得纯产物（24 mg)。将所述产物溶 于I. 2 mL的无水DMSO中。将等分试样转移到保持在-70°C的小瓶中。
[0100] EPRM-EDA和25-OH维牛素 D2 3-氨基甲酸醅偶合产牛发光珠粒试剂 将25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯（10 μ L如上所述制备的DMSO中的等分试样）（0. 2 mg)加入到 2 mL 的小瓶。将 EDAC (6. 8 mg)和 SNHS (9. 4 mg)以及 2. 27 mL 无水 DMSO (3 mg/ mL)加入到5 mL的小瓶。将EDAC/SNHS溶液（190 μ L)与来自上述的2-mL小瓶的内容物 (I mg/mL)混合，以制备经活化的25-OH维生素D3 3-氨基甲酸酯。使混合物在室温下旋转 18小时。用3. 6 mL去离子水将1