6%的GAFAC?表面活性剂溶液（GAF Corporation, Wayne NJ)的0· 4 mL等分试样（0· 15%)稀释至L 6%。
[0101] 将维生素 D3 (8. 5 mg)和 850 μ L DMSO(K) mg/mL)混合。将 2.0 mL (200 mg) EPRM-EDA加入到装有搅拌棒的10 mL圆底烧瓶中（标记为3323-064B)，随后加入400 μ L (4 mg)的来自上述的维生素D3溶液。在室温下将该混合物搅拌过夜。
[0102] 将2. 0 mL (200 mg) EPRM-EDA (如上所述制备）加入到装有搅拌棒的10 mL圆底烧 瓶中，随后在适度的搅拌下加入260 μ L I. 6%GAFAC?表面活性剂溶液（0. 15%)。将504 μ L 无水DMSO加入到小试管中，随后加入如上所述制备的60 μ L (0.06 mg)经活化的维生素 D3_3氨基甲酸酯；并将该混合物加入到EPRM-EDA珠粒混合物。所述珠粒悬浮液的总DMSO 含量为20%。将反应容器在室温下搅拌过夜。然后，通过渗滤来洗涤所述珠粒。
[0103] 每批珠粒与10% ME0P/1% GAFAC?/MES pH6缓冲剂占据20 mL工作体积。用5体 积的缓冲剂渗滤该混合物，然后在18-21瓦特下用探针超声波仪进行超声处理，使用冰使 混合物保持冷却。所述渗滤/超声处理持续经过50体积，流出物样品以35、40、45和50体 积取出。将缓冲剂改变为以10体积使用的LOCI半抗原洗涤缓冲剂（50 mM HEPES、300 mM NaCl、l mM EDTA、0.01%新霉素硫酸盐、0· 1% TRITON 405X和 0· 15% PR0CLIN?300，pH 7.2)。 将混合物减少至约7 mL并实施UPA。粒度为3323-064A = 289 nm和3323-064B = 298 nm。 确定固体百分数，并用LOCI半抗原洗涤缓冲剂pH7. 2使珠粒达到10 mg/mL。产量为160. 4 mg 〇
[0104] 非差向-维牛素 D和差向-维牛素 D的测宙 在 DIMENSION? Vista? 分析仪（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Deerfield， IL)上，按照LOCI测定的规程并使用含有不同量的非差向-25-羟基维生素％和/或3-差 向-25-羟基维生素％的校准仪溶液进行测定。在本实施例中，所述测定使用如上所述制 备的发光珠粒试剂作为化学发光试剂。样品部分与（i)如上所述制备的第一生物素化抗体 试剂（第一样品部分）或（ii)第一生物素化抗体和第二抗体（第二样品部分），然后与发 光珠粒试剂反应。对于第二样品部分，所述第二抗体是维生素D抗体10H9 (小鼠单克隆抗 体，记载于 CENTAUR? 维生素 D 测定，Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE 中）的溶液（0.8 mL，2.63 mg/mL);所述第二抗体过量存在（75 yg/mL或5H10抗体的量 的100倍）。使所述发光珠粒结合至未被来自样品的分析物占据的单克隆抗体结合位点的 片段。随后，将抗生蛋白链菌素偶合的敏化剂珠粒加入到反应混合物中。这导致发光珠粒/ 敏化珠粒对的形成，其浓度与维生素D的两种形式（第一样品部分）或维生素D的差向形 式（第二样品部分）的浓度负相关。当在680 nm发光时，敏化剂珠粒产生单线态氧，该单 线态氧扩散进入到与敏化珠粒成对的发光珠粒中，与烯属染料反应，并触发在大约612 nm 的化学发光信号，其与分析物浓度负相关。
[0105] 使用与美国专利号6, 153, 442、7, 022, 529、7, 229, 842和美国专利申请公布号 20050118727A中描述的方法类似的方法制备抗生蛋白链菌素-敏化剂珠粒（一种或多 种"敏化珠粒"）。所述光敏剂是双（三己基）_硅-叔丁基-酞菁。敏化珠粒试剂的浓 度在pH 8.0,含有150 mM NaCl的HEPES缓冲剂中为200 μ g/mL。将如上所述制备的 EPRM-EDA-25-OH维生素D3颗粒试剂在200 μ g/mL的浓度下，在pH 7. 2,含有150 mM NaCl 和0. 1%洗涤剂的HEPES缓冲剂中用作"发光珠粒试剂"。
[0106] 对于各个样品部分，在时间t =零秒，将20 μ L生物素化抗体试剂和20 μ L水加 入到反应容器中。21. 6秒后加入12 yL样品，随后加入8 yL水。在t =414. 0秒，加入 40 μ L发光珠粒试剂，并随后加入20 mL水。然后在457. 2秒分散敏化珠粒试剂。引发反 应时序之后601. 2秒进行测量。得到代表维生素D的差向和非差向形式二者的量的第一测 量值和仅代表维生素D的差向形式的量的第二测量值。
[0107] 使用上述测定形式在血清样品上进行测定，所述血清样品被掺入不同量的非差向 25-羟基维生素D 3 (非差向-VD)，但不惨入3_差向_25_羟基维生素D3 (3_差向-VD)。进 行该组测定以校准仪器和含有或不含有10Η9第二抗体的样品。结果总结在下表1中并绘 制在图3所示的曲线图中。
[0108] 结果显示，即使存在过量的10H9第二抗体，所述测定仍检测到一些非差向VD。因 此，将必须调整在此仪器系统上在使用10H9第二抗体的其它测定中获得的结果来解释该 校准的结果。
[0109] 使用以上测定形式在血清样品上进行测定，所述血清样品被掺入不同量的非差向 VD和3-差向-VD。在有10H9第二抗体（+10H9)和没有10H9第二抗体（-10H9)下都进行 所述测定。参照图2和图3中的曲线图获得"预测1"和"预测2"值。所述值是ng/mL;差 异=+10H9值与预测1值之间的差异。"掺入量"是掺入样品中的3-差向-VD的量。结果 总结在下表2中。
[0110] 使用表2中的以上数据，如下计算3-差向-VD的校正量；3-差向异构体的预测量 列在第二到最后一列中。上表2的每列的解释如下： 第1列：-10H9是在不存在10H9 Ab下测量的25(0H)D(ng/mL)。这代表了 25(0H)D的 总量（D2 + D3 + 3差向体X交叉反应性）（ng/mL) 第2列：+10H9是在10H9 Ab的存在下测量的25(0H)D(ng/mL)。这代表了被抑制的总 25 (OH) D (部分D2 +部分D3 + 3差向体X交叉反应性）（ng/mL) 第3列：预测1是如果3_差向异构体不存在于样品中，在10H9 Ab的存在下的25 (OH) D的量（部分D2 +部分D3) (ng/mL) 第4列：差异是第2列减第3列=3差向体X交叉反应性 第5列：预测2是第4列除以交叉反应性或（3差向体X交叉反应性）/交叉反应性= 3差向体（ng/mL) 第6列：掺入量是有多少3差向异构体被掺入样品中。此列应与第5列进行比较以显 示第5列和第6列的结果有多接近。
[0111] 结果总结于表3中。校正表示从在不存在10H9 Ab下测量的总的25(0H)D(ng/mL) 减去测量的3_差向异构体（ng/mL)后计算的25 (OH) D (ng/mL)。CXR表不除去3_差向异构 体的干扰之后，2反应容器测定的3-差向异构体的交叉反应性。这与上面提到的交叉反应 性不同。表2中的交叉反应性是具有3-差向异构体的5H10Ab的交叉反应性。表3中的交 叉反应性是从最终的25 (OH)D浓度（ng/mL)减去3-差向异构体的浓度后的测定的交叉反 应性。
[0112] 在表3中，第1、2、3、4和5列分别对应于表2中的第1、2、7、4和5列。第6列是校 正的，其是没有3-差向异构体的25 (OH) D (ng/mL)。基本上，将校准仪L2-L5的25 (OH) D值 (ng/mL)对存在和不存在10H9抗体的25 (OH)D值之间的差异（ng/mL)绘图。由该图产生的 系数用于通过差异预测非-3-差向异构体25 (OH) D值。该结果是因为差异是代表非-3-差 向异构体信号的抑制的信号，因为10H9抗体仅结合至非差向异构体。
[0113] 在此将本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文中，如同每个 单独的出版物或专利申请被特别和单独指明通过引用并入本文中一样。
[0114] 应当理解的是，上述实施例仅举例说明代表本文描述的原理的许多具体实施例的 一部分。显然，不脱离以下权利要求限定的范围的基础上，本领域的技术人员可以容易地设 想出许多其它方案。
[0115] 除非另外指出，下面实验中的材料可以购自Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO)或 Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI) 〇 除非另 有说明，本文公开的份数和百分数都以重量比体积计。
【主权项】
1. 确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量的方法，所述方法包 括： (a) 通过使用第一抗体在一部分所述样品上进行测定来测量所述第一同分异构分析 物和第二同分异构分析物的总量，以获得第一测量值，所述第一抗体对所述第一同分异构 分析物和所述第二同分异构分析物的每种都展示出足够的测定结合亲合力； (b) 通过使用所述第一抗体在一部分所述样品上进行所述测定来测量所述第二同分 异构分析物的量，其中过量使用第二抗体以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一 抗体，以获得第二测量值，所述第二抗体结合至所述第一同分异构分析物但对所述第一同 分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力并且对所述第二同分异构分析物基本无测定 结合亲合力；和 (c) 使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量，并从所述 第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所 述第一同分异构分析物的量。2. 根据权利要求1的方法，其中所述两种同分异构分析物是差向异构体。3. 根据权利要求1的方法，其中所述两种同分异构分析物是25-羟基维生素D 3和3-差 向-25-羟基维生素D3。4. 根据权利要求1的方法，其中所述测定是均质测定。5. 根据权利要求1的方法，其中所述测定是非均质测定。6. 根据权利要求1的方法，其中所述测定是竞争性测定。7. 根据权利要求1的方法，其中所述测定是非竞争性测定。8. 根据权利要求1的方法，其中所述测定使用包含所述分析物的类似物的试剂，其中 所述类似物包含标记物。9. 根据权利要求1的方法，其中所述测定使用包含颗粒的试剂。10. 根据权利要求1的方法，其中所述测定使用包含光敏剂试剂和化学发光颗粒的试 剂。11. 根据权利要求10的方法，其中所述光敏剂试剂包含颗粒。12. 确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量的方法，所述方法包 括： (a) 通过使用第一抗体在一部分所述样品上进行测定来测量所述第一同分异构分析 物和第二同分异构分析物的总量，以获得第一测量值，所述第一抗体对所述第一同分异构 分析物和所述第二同分异构分析物的每种都具有至少约IO 7升/摩尔的结合亲合力； (b) 通过使用所述第一抗体在一部分所述样品上进行所述测定来测量所述第二同分 异构分析物的量，以获得第二测量值，其中过量使用第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分 析物结合至所述第一抗体，所述第二抗体对所述第一同分异构分析物具有约IO 6至约IO8升 /摩尔的结合亲合力和对所述第二同分异构分析物具有小于约IO4升/摩尔的结合亲合力； 和 (c) 使所述第二测量值等同于所述样品中的所述第二同分异构分析物的量，并从所述 第一测量值减去所述第二测量值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所 述第一同分异构分析物的量。13. 根据权利要求12的方法，其中所述两种同分异构分析物是差向异构体。14. 根据权利要求12的方法，其中所述两种同分异构分析物是25-羟基维生素D 3和 3_差向_25-羟基维生素D 3。15. 根据权利要求12的方法，其中所述测定是竞争性均质测定、竞争性非均质测定、非 竞争性均质测定或非竞争性非均质测定。16. 根据权利要求12的方法，其中所述测定使用包含所述分析物的类似物的试剂，其 中所述类似物包含标记物。17. 根据权利要求12的方法，其中所述测定使用包含颗粒的试剂。18. 根据权利要求12的方法，其中所述测定使用包含光敏剂试剂和化学发光颗粒的试 剂。19. 根据权利要求18的方法，其中所述光敏剂试剂包含颗粒。20. 根据权利要求12的方法，其中所述测定是发光氧通道免疫测定。
【专利摘要】方法包括确定样品中第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的量。确定第一测量值和第二测量值。所述第一测量值代表所述第一同分异构分析物和所述第二同分异构分析物的总量。所述第二测量值仅代表所述第二同分异构分析物的量。从所述第一测量值减去所述第二测量值，以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中第一同分异构体分析物的量。
【IPC分类】G01N33/541
【公开号】CN105164532
【申请号】CN201480010884
【发明人】魏铁全, I.巴哈尔
【申请人】西门子医疗保健诊断公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年2月26日
【公告号】EP2962105A1, US20140242615, WO2014134139A1