。通过测量由复合物产生的 信号水平来测量包含分析物的第一抗体和第一和第二同分异构分析物的复合物的量。观察 到的信号与所述样品中结合的第一同分异构分析物和第二同分异构分析物的总量有关。
[0067] 为了确定第二测量值，通过使用第一抗体在所述样品的第二部分上进行所述测定 来测量所述第二同分异构分析物的量，并且所述测定培养基还包含结合至所述第一同分异 构分析物但对所述第一同分异构分析物展示出不足的测定结合亲合力且对所述第二同分 异构分析物基本无测定结合亲合力的第二抗体。可以如上文讨论的对所述第二样品部分进 行预处理以从内源性结合物质中释放分析物。或者，可以在将所述部分用于根据本文描述 的原理的方法中之前对所述样品进行预处理。在所述实例中，所述第二抗体是通过上述过 程之一制备的单克隆抗体。在包含所述样品的第二部分的测定培养基中相对于所述第一抗 体过量地使用所述第二抗体，以阻挡所述第一同分异构分析物结合至所述第一抗体。过量 是大于结合可能存在于所述样品中的所述第一同分异构分析物的大部分所需的所述第一 抗体的量的量。使用的第二抗体的量取决于例如所述第二抗体的性质、所述第一抗体的性 质、所述同分异构分析物的性质、所述测定培养基的性质和所述测定的性质。在根据本文描 述的原理的一些实例中，所述第二抗体的过量是例如所述第一抗体的量的约5至约200倍， 或约5至约150倍，或约5至约100倍，或约5至约50倍，或约10至约200倍，或约10至约 150倍，或约10至约100倍，或约10至约50倍，或约20至约200倍，或约20至约150倍， 或约20至约100倍，或约20至约50倍。通过测量由所述复合物产生的信号的水平来测量 包含所述分析物的所述第一抗体和所述第二同分异构分析物的复合物的量。观察到的信号 与所述样品中的所述第二同分异构分析物的量有关。从所述第一测量值减去所述第二测量 值以获得所得值，并且使所述所得值等同于所述样品中的所述第一同分异构分析物的量。
[0068] 如上文更充分讨论的，可以使用任何合适的测定。所述测定包括添加用于确定所 述样品中的分析物的浓度的试剂。所述试剂至少包括第一抗体和第二抗体，并且因此所述 测定是免疫测定。在所述样品部分上进行的测定可以在单独的反应容器中依次或同时进行 或在对每个样品部分相同的反应容器中依次进行。术语"复合物"表示其中所述分析物的 抗体结合至所述样品中的分析物的复合物。
[0069] 如上所述，所述同分异构分析物的测量可以在已经用释放剂处理过的样品上进 行。添加至所述样品中的释放剂的量是足以从内源性结合物质置换基本全部同分异构分析 物的量。短语"置换基本全部由内源性结合物质结合的同分异构分析物"表示从内源性结合 物质置换的同分异构分析物是至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少99%，或至少99. 5%， 或至少99. 9%或100%，并且在测定期间可用于检测。
[0070] 加入释放剂之后，在从内源性结合物质置换基本全部同分异构分析物的条件下将 所述样品培养一段时间。所述培养的时间长度和条件取决于例如所述释放剂的性质、所述 分析物的性质和所述分析物的疑似浓度的一个或多个。在一些实施方案中，该步骤的培养 温度可以是例如约5°C至约99°C，或约15°C至约70°C，或约20°C至约45°C。所述培养的时 间段为例如约〇. 2秒至约24小时，或约1秒至约6小时，或约2秒至约1小时，或约1至约 15分钟。所述培养可以在培养基，为方便起见，可以是如本文所讨论的测定培养基中进行， 但不是必须的。
[0071] 根据本文描述的原理的一个具体实例涉及在怀疑含有所述分析物的样品的第一 和第二部分上使用以下测定试剂的方法：（i)根据本文描述的原理的抗体试剂，（ii)包含 分析物类似物的化学发光颗粒试剂，和（iii)包含小分子结合部分或小分子的结合配偶体 的光敏剂颗粒试剂。
[0072] 在下面的具体实例中，通过说明而非限制的方式，所述同分异构分析物是维生素D 的非差向和差向形式。可以使用诱导发光免疫测定。所述诱导发光免疫测定在美国专利号 5, 340, 716 (Ullman)中提及，其公开内容通过应用并入本文中。在一种方法中，所述测定使 用已经与光敏剂缔合的颗粒，其中维生素D类似物结合至所述颗粒（颗粒-类似物试剂）。 对于在怀疑含有维生素D分析物的非差向和差向形式二者的样品的第一部分上的测定，化 学发光试剂包含对所述维生素D分析物的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结 合亲合力的第一抗体。对在所述样品的第二部分上的测定，所述包含第一抗体的化学发光 试剂与第二抗体一起使用，所述第二抗体结合至所述维生素D分析物的非差向形式，但对 所述维生素D分析物的非差向形式展示出不足的测定结合亲合力且对所述维生素D分析物 的差向形式基本无测定结合亲合力。在上面的实例中，所述第一抗体连接至小分子，所述小 分子结合至化学发光颗粒上的小分子的结合配偶体。所述化学发光试剂可以预先形成或原 位形成。所述维生素D分析物（非差向和差向形式）与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合 至根据本文描述的原理的维生素D的抗体。如果存在维生素D分析物，则与所述化学发光 试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂的分子的数目较少。因此，将存在测定信号的减少。当 所述两种标记物紧密邻近时，所述光敏剂产生单线态氧并活化所述化学发光试剂。经活化 的化学发光试剂随后产生光，其中在分析物存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形 成的复合物的量有关，这进而对于第一样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D 分析物的非差向和差向形式二者的量（第一测量值）有关，并且对于第二样品部分上的测 定与存在于所述样品中的维生素D分析物的差向形式的量（第二测量值）有关。从所述第 一测量值减去所述第二测量值，得到所述样品中维生素D分析物的非差向形式的量。
[0073] 在使用维生素D作为实例的诱导发光免疫的另一具体实例中，通过说明而非限制 的方式，所述测定使用已经与化学发光化合物缔合的颗粒，其中维生素D类似物结合至所 述颗粒（颗粒-类似物试剂）。对于第一样品部分，光敏剂试剂包含对所述维生素D分析物 的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结合亲合力的第一抗体，所述第一抗体连接 至小分子，所述小分子进而结合至化学发光颗粒上的小分子的结合配偶体。对于第二样品 部分，使用所述光敏剂试剂和第二抗体。所述第二抗体结合至所述维生素D分析物的非差 向形式，但对所述维生素D分析物的非差向形式展示出不足的测定结合亲合力且对所述维 生素D分析物的差向形式基本无测定结合亲合力。对于所述第一样品部分，维生素D分析 物的非差向形式和差向形式二者与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合至维生素D的所述 第一抗体。如果存在维生素D分析物，则与所述光敏剂试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂 的分子的数目较少。因此，将存在测定信号的减少。对于所述第二样品部分，所述维生素D 分析物的差向形式与所述颗粒-类似物试剂竞争，以结合至维生素D的所述第一抗体，因为 所述维生素D分析物的非差向形式由第二抗体结合。如果存在所述维生素D分析物的差向 形式，则与所述光敏剂试剂紧密邻近的颗粒-类似物试剂的分子的数目较少。因此，将存在 测定信号的减少。当所述两种标记物紧密邻近时，所述光敏剂产生单线态氧并活化所述颗 粒-类似物试剂的化学发光化合物。经活化的化学发光化合物随后产生光，其中在分析物 的存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形成的复合物的量有关，这进而对于第一样 品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的非差向和差向形式二者的量（第 一测量值）有关，并且对于第二样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物 的差向形式的量（第二测量值）有关。从所述第一测量值减去所述第二测量值，得到所述 样品中的维生素D分析物的非差向形式的量。
[0074] 在使用维生素D的诱导发光测定的另一具体实例中，通过说明而不是限制的方 式，使用共辄至小分子的结合配偶体的光敏剂颗粒，例如，抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素 (其是生物素的结合配偶体）。使用根据本文描述的原理的包含连接至结合至维生素D分 析物的非差向异构和差向异构形式二者的第一抗体的生物素的抗体试剂。化学发光试剂 用作部分检测体系。培养所述第一样品部分或所述第二样品部分的反应培养基（视情况而 定），以允许光敏剂颗粒的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素凭借抗生物素蛋白和生物素之 间的结合而结合至所述抗体试剂的生物素，并且还允许根据本文描述的原理的抗体试剂的 第一抗体之间的特异性结合，其现在连接至所述光敏剂颗粒，以结合至所述样品的分析物 以及是部分所述化学发光试剂的分析物。然后，用光照射所述培养基，以激发光敏剂，其在 它的激发态能够将氧活化到单线态。因为现在由于存在分析物，较少的化学发光试剂与光 敏剂紧密邻近，所以存在较少的通过单线态氧的化学发光试剂的活化和较少的发光。然后 检查所述培养基以得到发光或发射光的存在和/或量，其存在与所述分析物的存在和/或 量有关，其中在分析物的存在下观察到信号的减少。产生的光的量与形成的复合物的量有 关，这进而对于第一样品部分上的测定与存在于所述样品中的维生素D分析物的非差向和 差向形式二者的量（第一测量值）有关，并且对于第二样品部分上的测定与存在于所述样 品中的维生素D分析物的差向形式的量（第二测量值）有关。从所述第一测量值减去所述 第二测量值，得到所述样品中的维生素D分析物的非差向形式的量。
[0075] 通过说明而非限制的方式，用于样品中的维生素D的检测的测定形式的另一实例 是ACMIA测定形式。对于所述ACMIA测定形式，涂布有维生素D或维生素D类似物的二氧 化铬颗粒（二氧化铬颗粒试剂）被用作第一组分。第二种组分是包含根据本文所述的原理 的维生素D的抗体的抗体试剂。在所述抗体试剂中，所述抗体通过连接基团连接至报告酶 (reporter enzyme)(例如，β -半乳糖苷酶），以形成抗体-酶共辄物。以过量，即大于结 合样品中可能存在的全部维生素D分析物所需的量的量将所述抗体试剂加入到反应容器 中。对预先用释放剂进行处理的样品的第一部分用如上所述的第一抗体试剂进行处理，所 述第一抗体试剂包含对维生素D分析物的非差向和差向形式的每种展示出足够的测定结 合亲合力的抗体；所述抗体结合至所述样品中的维生素D。在所述培养基中将所述抗体-酶 共辄物与样品混合，以允许维生素D分析物结合至所述抗体。然后，加入二氧化铬颗粒试剂 以结合任何过量的抗体-酶共辄物。然后，施加磁体，所述磁体从悬浮液中吸出所有的二氧 化铬颗粒和过量的抗体-酶，并且将上清液转移到最终反应容器。将所述报告酶的底物加 入到所述最终反应容器，并且以吸收率随时间变化的形式，用分光光度法测量酶活性。该信 号的量与样品中的维生素D的非差向和差向形式二者的量有关。用如上所述的第一抗体试 剂和第二抗体处理预先用释放剂进行处理的样品的第二部分，其包含第二抗体，所述第二 抗体结合至所述维生素D分析物的非差向形式，但对所述维生素D分析物的非差向形式展 示出不足的测定结合亲合力且对所述维生素D的差向形式基本无测定结合亲合力。在所述 培养基中将所述抗体-酶共辄物与样品混合，以允许所述维生素D分析物结合至所述抗体。 然后，加入二氧化铬颗粒试剂以结合任何过量的抗体-酶共辄物。然后，施加磁体，所述磁 体从所述悬浮液中吸出所有的二氧化铬颗粒和过量的抗体-酶，并且将上清液转移到最终 反应容器。将所述报告酶的底物加入到所述最终反应容器，并且以吸收率随时间变化的形 式，用分光光度法测量酶活性。该信号的量与样品中的维生素D的非差向和差向形式二者 的量有关。
[0076] 用于测定样品中的维生素D的同分异构形式的另一实例（通过说明而不是限制的 方式）是使用顺磁性颗粒作为固相的吖啶酯标记物免疫测定（ADVIA免疫测定）。用于该 维生素D测定实例的检测系统包括作为小分子共辄物或捕获共辄物的小分子标记的维生 素D(捕获部分），作为固相（SP)的涂布有所述小分子的结合配偶体的顺磁性胶乳颗粒和根 据本文描述的原理的吖啶酯标记的维生素D抗体（检测抗体）。所述小分子可以是例如生 物素或荧光素，并且各自的结合配偶体可以为抗生蛋白链菌素或荧光素抗体。所述维生素 D可直接或通过连接基团连接至所述小分子，所述连接基团例如蛋白质，例如牛血清白蛋白 (BSA)。患者样品中的维生素D与捕获部分的维生素D竞争，以结合至所述吖啶酯标记的检 测抗维生素D抗体。用1，8- ANS对怀疑含有维生素D的样品进行预处理。可以使用根据 本文描述的原理的各自抗体和根据随之提供的制造商说明书的Centaur?、Centaur?XP或 Centaur?CP 设备（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)在第一和第二样 品部分上进行所述测定。
[0077] 根据本文描述的原理的分析物的测定的另一实例是使用顺磁性颗粒作为固相的 吖啶酯标记物免疫测定（ADVIA免疫测定）。用于该同分异构分析物测定实例的检测系统 包括根据本文描述的原理的抗体试剂，其中小分子连接至所述分析物的抗体（捕获抗体） 作为捕获共辄物、作为固相（SP)的涂布有抗体试剂的小分子的结合配偶体的顺磁性胶乳 颗粒和吖啶酯标记的分析物类似物（检测半抗原）。所述吖啶酯标记物可以直接结合至所 述分析物以形成所述检测半抗原或可以使用连接基团，其包括例如蛋白质，例如BSA。样品 的分析物与吖啶酯标记的检测半抗原竞争，以与抗分析物抗体结合。可以用一种或多种释 放剂和消化剂对怀疑含有所述分析物的样品进行预处理。可以使用根据随之提供的制造商 说明书的 Centaur?