与根据本发明的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗 法结合使用的抗炎方法。这些包括，例如，非类固醇抗炎药（NSAID)、类固醇、缓解疾病的抗 风湿药（DMARD)，包括氨甲噪呤（Trexall)、来氟米特（Arava)、羟基氯喹（Plaquenil)、柳氮 磺胺吡啶（Azulfidine)和米诺环素（Dynacin，Minocin)及免疫抑制剂，包括咪唑硫噪呤 (Imuran，Azasan)、环抱霉素（Neoral，Sandimmune，Gengraft)和环磷酰胺（Cytoxan)。
[0151] 本发明的方法可以使用这些方法来治疗本领域已知用来治疗的那些相同类型的 炎性疾病，以及其他的，如可以通过本领域技术人员来确定的。此外，可以根据与本领域对 其使用已知的那些相似的参数（例如，给药方案和剂量）来进行这些方法。然而，如本领 域所理解的，由于与这些方法另外一起使用抗-TNF治疗和抗-IL17治疗，可能希望调整这 些参数中的一些。例如，如果另一种药物通常作为唯一治疗剂来施用，当与根据本发明的 抗-TNF治疗和抗-IL17治疗结合时，可能希望降低该药物的剂量，如可以通过本领域技术 人员来确定的。
[0152] III.本发_的试剂盒
[0153] 在再另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其用于（i)确定患有炎性疾病的 受试者是否对用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗有反应；（ii)监测联 合疗法的效力；（iii)选择参与炎性疾病联合疗法的临床试验的受试者；或（iv)鉴别用于 患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法。试剂盒包括用于 测定获自受试者的样品中的CXCLl和CXCL5标志物中的至少一种和对照标志物的表达水平 的试剂。试剂盒还包括用于（i)确定受试者是否对包括的联合疗法有反应；（ii)监测联合 疗法的效力；（iii)选择参与联合疗法的临床试验的受试者；或（iv)鉴别用于患有炎性疾 病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的说明。说明可以对应于本文 中所述的任一个或多个方面。
[0154] 本发明的试剂盒可以任选包括可用于进行本发明方法的其他组分。
[0155] 例如，试剂盒可以包括用于从受试者获得生物样品和/或获得对照样品的试剂。
[0156] 此外，试剂盒包括用于测定CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂。 在一个实例中，用于测定CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括用于扩 增和检测CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的探针。在另一个实例中，用于测定CXCLl和 CXCL5标志物中至少一种的表达水平的试剂包括抗体或其抗原结合片段。
[0157] 关于对照标志物，试剂盒可以包括预定的对照值（例如，基于预定的受试者群 体）。或者，试剂盒可以包括用于测定受试者（例如，用于治疗的潜在候选者或接受治疗的 受试者）中对照的表达水平的另外的试剂和说明。
[0158] 在一个实施方案中，用于测定来自受试者的生物样品中至少一种生物标志物的表 达水平的试剂包括足以检测编码标志物的核酸（例如，mRNA)的表达的核酸制剂。该核酸 制剂包括至少一种，并且可以包括超过一种核酸探针或引物，其序列设计为使得核酸制剂 可以检测来自受试者的样品中编码生物标志物的核酸（例如，mRNA)的表达。优选的核酸 制剂包括两种或更多种允许PCR扩增编码目标生物标志物的mRNA的区段的PCR引物。在 其他实施方案中，试剂盒包括用于CXCLl和/或CXCL5的核酸制剂。
[0159] 用于测定CXCLl和/或CXCL5表达水平的方式还包括，例如，缓冲剂或用于评估表 达（例如，在核酸或蛋白质水平）的试验中的其他试剂。试验可以是生物分析，例如，活体 外试验，其中取出患者细胞（例如，单核细胞）并在培养物中使用联合疗法进行测试。
[0160] 在另一个实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于治疗如本文中所述的炎性疾病 的联合疗法，所述联合疗法包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗。例如，联合疗法包括针对TNF 和IL17或更特别地针对TNF α和IL17的DVD-Ig分子。
[0161] 优选地，试剂盒设计用于人类受试者。
[0162] 通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应当解释为进一步限制。整个 本申请以及附图中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容将其全部特别地按 引用并入本文中。
[0163] 实施例
[0164] 实施例1-单独和联合的抗-TNF和抗-IL17在小鼠胶原蛋白诱导关节炎模型中的 功效
[0165] 在这个实施例中，在小鼠的胶原蛋白诱导关节炎模型中评价了抗-TNF或抗-IL17 或其组合的功效，并且结果显示于图3中。在尾根部对雄性DBA/1J小鼠 i.d.注射100μΙ 含有溶解于〇. IN醋酸中的100 μ g II型牛胶原蛋白的乳液和100 μ 1含有100 μ g结核分 枝杆菌（Mycobacterium Tuberculois)H37Ra的完全弗氏佐剂。21天后通过用200 yL磷 酸盐缓冲盐水（PBS)中的LOmg zymosan A对小鼠 i.p.加强。在加强3天内疾病开始发 作。第一周每天监测小鼠的关节炎，此后每周三次。通过以下标准给每只爪评分：〇=正常； 1 = 一个部位（足或踝）肿胀；2 =足和踝肿胀；3 =关节僵硬。对每只动物的所有四只爪 的评分进行总计（最大评分为12)，并且将总评分表示为每个组中所有动物的平均值和表 示为平均关节炎评分（MAS)。在磷酸盐缓冲盐水（PBS)中通过腹膜内注射施用的12mg/kg 抗-TNF抗体8C11、12mg/kg抗-IL17抗体MAB421或12mg/kg每种抗体处理动物2X/周。 在一个实验中，在预防性处理模型中，动物在呈现关节炎体征前接受抗体治疗。在第二个实 验中，动物在治疗性处理模型中在关节液体征发作后接受抗体治疗。在两种类型的实验中， 抗-TNF或抗-IL17的治疗在减轻爪的关节炎中都是部分有效的，而抗-TNF和抗-IL17组 合的治疗给予了高于任一单一疗法的功效。
[0166] 实施例2 :在小鼠胶原蛋白诱导关节炎模型中单独和组合的抗-TNF和抗-IL17的 骨保护的比较
[0167] 在这个实施例中，证明了 TNF和IL17的联合阻断对防止骨丢失的更高功效，并且 显示于图4中。按照实施例1中所述的，在DBS/1J小鼠中诱发关节炎。在研究结束时，关 节炎体征发作后三周，评价骨丢失的水平。在接受了治疗性处理方案的动物中测量防止骨 丢失的保护功效。后爪在胫骨/腓骨的中间移除并储存在10%中性缓冲福尔马林中。爪子 使用 Scanco yCT40(Scanco Medical AG)，在 55kVp 和 145μΑ 下利用高分辨率设置（1000 投射/180°，在2048X2048像素重构下）和Isotropic Voxels以180微秒积分时间成像， 获得18 μ mX 18 μ mX 18 μ m的最终各向同性三维像素大小。从根骨和舟骨的近端连接点并 且延伸至跗骨100个切片的固定高度（I. 8_)，围绕目标区域手动画出圆柱状轮廓。内部原 始对照已经显示出该区域给出用于分析的高度保守的并且统计学可重现的体积区域。通过 针对骨体积（_3)以及表面积-体积比的ScancoAG分析软件进行3-D定量评价，获得了跗 骨表面粗糙度（_ 4的近似值。使用了 0. 8希格玛高斯和1. 0的分析设置，具有1000的上 限域值和320的下限域值。如图4中所示，接受媒介处理的关节炎小鼠中存在明显的骨体 积损失。相反，单独的抗-TNF或抗-IL17的治疗分别导致骨丢失的显著保护，42或66% (p 值〈0. 05vs.媒介对照）。抗-TNF和抗-IL17的联合治疗导致相对于媒介80%的更高骨丢 失保护（P〈〇. 05)。
[0168] 实施例3 :TNF和IL-17在CIA和RA中的相互作用
[0169] 在这个实施例中，将基因表达谱用作工具来研究反映抗-TNF和抗-IL17治疗的协 同作用的生物标志物。在这种情况中，将8C11抗体用作抗-TNF治疗，和将大鼠抗-小鼠 抗-IL17抗体MAB421用作抗-IL17治疗，除非另外指出。使用本领域已知的方法，表征疾 病相关RNA的反应并鉴别对联合的抗-TNF和抗-IL17治疗敏感但对抗-TNF或抗-IL17单 一疗法显著较不敏感的同期组。鉴别出CXCLl和CXCL5为生物标志物，因为它们在临床现 场需要最少制备或操作的容易获取的生物流体中随着时间是稳定的。使用小鼠中的胶原蛋 白诱导关节炎（CIA)模型，全爪匀浆中CXCLl和CXCL5生物标志物的测量表明RNA水平的 变化是蛋白质水平变化的良好预测子。此外，结果确定抗-TNF和抗-IL17治疗的联合疗法 存在协同作用，如以下讨论的。
[0170] CXCLl和CXCL5-反应件和非反应件的统计学分析
[0171] 如果治疗者和患病者之间的差异显著性的P-值（使用Student's t检验，没有对 于多重比较的校正）高于〇· 05或由于治疗引起的倍数变化低于0· llog(25% )(与变化的 显著性无关），认为CXCLl和/或CXCL5对于给定的治疗没有反应。
[0172] CIA樽铟和RNA制备
[0173] 在尾根部对雄性DBA/1J小鼠 i. d.注射100 μ L含有100 μ g溶解于0.1 N醋酸中 的II型牛胶原蛋白的乳液和100 μ L含有100 μ g结核分枝杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂。21 天后用200 μ L磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的LOmg Zymosan A给小鼠 i.p.加强。在加强3 天内，出现疾病发作。
[0174] 第一周每天监测小鼠的关节炎，且之后每周三次。通过以下标准给每只爪评分：0 =正常；1 =一个部位（足或踝）肿胀；2 =足和踝都肿胀；3 =关节僵硬。对每只动物的所 有四只爪的评分进行总计（最大评分为12)，并且将总分表示为每个组中所有动物的平均 值且表示为平均关节炎评分。用Capliper Thickness-Gage(Dyer，310_115)测量爪肿胀的 变化。对于治疗性给药，在最大评分为2的疾病头一个临床体征时，将小鼠登记入组。
[0175] 第一次呈现疾病症状后七天，从去皮的小鼠后爪制备RNA。入组时，将小鼠随机分 成由单一疗法（6mg/kg，任一种抗体）、联合疗法（每种抗体6mg/kg)或用同种型对照处理 的小鼠组成的治疗同期组。基于之前确定6mg/kg为最大有效剂量的剂量-反应实验来选 择剂量。
[0176] 涂径分析
[0177] 对比途径分析使用了 Ingenuity Pathway Assist?和 Fisher' s Exact Test 方 法。对于本分析，所示的途径具有〈0. 05的显著性和至少两个受调控的转录物。
[0178] 结果:
[0179] IL17和TNF表现为协同调节CIA小鼠中的基_表汰
[0180] 分析来自CIA小鼠的爪总RNA以研究两种细胞因子途径在调控疾病活性中的相互 作用。与健康动物相比，CXCLl和CXCL5基因表达在患病动物中显著上调。聚类结果表明 接受了相似治疗方案的小鼠具有相似的RNA表达谱。用单独的抗-IL17抗体治疗的动物与 媒介处理的动物聚类，表明对基因表达的最小作用。抗-TNF抗体治疗的小鼠聚类在一起， 但与用抗-TNF和抗-IL17两者治疗的小鼠分离，因而具有相对于抗-IL17单一疗法的中等 作用。因此，基于无偏聚类分析，三个治疗方案中存在功效梯度。
[0181] 根据聚类分析，少数疾病相关基因对抗-TNF治疗具有显著反应，而甚至更少的量 对抗-IL17治疗具有显著反应。然而，与对抗-TNF单一疗法具有反应的基因数量相比，约 两倍数量的基因对联合疗法有反应。使用相同统计学标准的进一步分析表明大部分受到单 独的抗-IL17调控的mRNA也受到组合的调控。通过比较，仅有一半受到单独的抗-TNF调 控的基因也受到组合的调控。
[0182] 涂径分析表 联合疗法比单一疗法实质h影响审多系统
[0183] 观察到的提高的mRNA调控可能是提高的效能的结果，导致检测或多或少受单一 疗法影响的相同途径内的更多mRNA。另一方面，提尚的mRNA调控也可能具有定性结果，表 明对未受单一疗法影响的途径的效应。为了帮助区分这两种机制，使用策划的途径数据库 (curated pathway database) (Ingenuity Pathway Assist?)进行每个处理组中受调控基 因的途径分析。这一分析表明尽管几条途径共同地受到调控，但明显实质上更多的受到联 合疗法影响的途径，表明可归因于联合抗-TNF和抗-IL17治疗的另外的非丰余功能。
[0184] 为了确定mRNA水平的提高是否反映在蛋白质水平的变化，使用Ingenuity Pathway Assist?分析CXCLl蛋白和CXCL5蛋白的水平。在全爪匀浆中检测的CXCLl蛋 白和CXCL5蛋白水平都存在显著的疾病相关的提高。发生响应于单独和联合的抗-TNF和 抗-IL17治疗的这些蛋白质水平的至不同程度的降低。在所有情况中，与单一疗法相比，响 应于联合疗法的CXCLl蛋白和CXCL5蛋白水平存在更高的降低。因此，CXCLl RNA和CXCL5 RNA水平的变化是小鼠 CIA模型中CXCLl蛋白和CXCL5蛋白表达的可靠定量预测子以及是 对抗-TNF和抗-IL17治疗反应性的指示。
[0185] 图7显示了小鼠爪裂解物（左栏）和血清（右栏）中的蛋白质表达。血清中观察 到的趋势总体地反映出爪裂解物中针对CXCLl观察到的那些。患病小鼠中的CXCLl蛋白水 平上调，通过单一疗法只存在少量地下调（如果有的话），但通过联合治疗显著下调。因此， 爪和血清趋化因子水平之间存在总体相关性。
[0186] 为了确定分泌的CXCLl和CXCL5蛋白水平是否在人中得到相似的调控，从患有 确认的RA的患者和健康对照获得血清样品。图8显示了与非-RA对照相比，RA患者中的 CXCLl和CXCL5蛋白水平高度上调。因为需要对现有的商业联合疗法有反应的生物标志物， 图8中所描绘的研究的RA同期组包括用单独的氨甲喋呤或Humira?加氨甲喋呤治疗的 患者，以确定在另外的TNF阻断存在下CXCLl和CXCL5标志物是否继续过表达。图9显示 单独的氨甲喋呤或对抗-TNF治疗增加氨甲喋呤对CXCLl和CXCL5水平没有显著影响。图 10显示了图9中所示实验的数值结果。
[0187] 按引用并入
[0188] 可能在这整个申请中引用的所有引用的参考文献（包括文献参考书目、专利、专 利申请、数据库和网站）在此特意将其全部按引用并入用于任何目的，其中引用的参考文 献也是如此。本发明的实施将使用本领域公知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规 技术，除非另外指出。
[0189] 等同
[0190] 本发明可以以其他特定形式来实施而不脱离其精神或实质性特征。因此认为之前 的实施方案在所有方面都是说明性的，而非本文中所述发明的限制。因此本发明的范围由 所附权利要求来决定，而不是由之前的描述来决定，并且因此确定在权利要求等同性的含 义和范围内的所有变化包括在本发明中。
【主权项】
1. 一种确定患有炎性疾病的受试者是否将对包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗 法的治疗有反应的方法，该方法包括步骤： 测定获自所述受试者的样品中CXCLl和CXCL5标志物中的至少一种的表达水平；和 将所述标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较， 其中与所述对照标志物的表达水平相比，CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较高表 达水平，和/或与对照标志物的表达水平相比，在施用包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联 合疗法后CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平指示所述联合疗法在治疗所述 受试者中将是有效的。2. -种确定患有炎性疾病的受试者是否将对包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗 法的治疗有反应的方法，该方法包括步骤： 处理获自所述受试者的样品以使得所述样品被转化，从而允许测定CXCLl和CXCL5标 志物中至少一种的表达水平；和 将所述标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较， 其中与所述对照标志物的表达水平相比，CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较高表 达水平指示所述联合疗法在治疗所述受试者中将是有效的，和/或与所述对照标志物的表 达水平相比，在施用包括抗-TNF治疗和抗-IL7治疗的联合疗法后CXCLl和CXCL5标志物 中至少一种的较低表达水平，指示所述联合疗法在治疗所述受试者中将是有效的。3. -种用包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法治疗患有炎性疾病的受试者的 方法，该方法包括步骤： 选择与对照标志物的表达水平相比呈现出CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较高表 达水平的受试者和/或选择响应于所述联合疗法呈现出与对照标志物的水平相比CXCLl和 CXCL5标志物中至少一种的较低表达水平的受试者；和 将治疗有效量的所述联合疗法施用于所述受试者。4. 一种用于监测包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的治疗效力的方法，该方 法包括步骤： 在将治疗有效量的所述联合疗法施用于受试者后测定获自所述受试者的样品中的 CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的表达水平，和 将所述标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较， 其中与对所述照标志物的表达水平相比，CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较低表 达水平指示所述联合疗法在治疗所述受试者中是有效的。5. -种选择参与用于炎性疾病治疗的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治疗的联合疗法的 临床试验的受试者的方法，该方法包括步骤： 测定获自所述受试者的样品中的CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的表达水平；和 将所述标志物的表达水平与对照标志物的表达水平进行比较， 其中与所述对照标志物的表达水平相比，CXCLl和CXCL5标志物中至少一种的较高表 达水平指示所述受试者适合参与所述临床试验，和/或在施用包括抗-TNF治疗和抗-IL17 治疗的所述联合疗法后，与所述对照标志物的表达水平相比CXCLl和CXCL5标志物中至少 一种的较低表达水平指示所述联合疗法在治疗所述受试者中将是有效的。6. -种用于鉴别适用于治疗患有炎性疾病的受试者的包括抗-TNF治疗和抗-IL17治 疗