一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测醋酸格拉替雷样本的高效液相色谱（HPLC)方法及与其 配套使用的内标肽组。
【背景技术】
[0002] 自身免疫类疾病（autoimmunediseases)是指，生物机体的免疫系统将一些机体 本身的组织当作"外来物"进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细胞和 B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到MHC分子 上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作 "自抗原"，被机体免疫系统攻击。例如：多发性硬化症，就是免疫系统对隔离和保护神经的 髓鞘进行攻击而导致的疾病，这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能 丧失；其他例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自免疫性溶血性贫血等，也属于此类疾病。
[0003] 很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替 雷（又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸通过聚合产生的不同分子量聚 合物的混合物。它的四种氨基酸摩尔比大约是0.392~0.462:0. 129~0. 153:0. 300~ 0. 374:0. 086~0. 100(Ala:Glu:Lys:Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大约5000~ 9000道尔顿。
[0004]最早，Teitelbaum等在Eur.J.Immun.，1，242, 1971 中描述了合成共聚物-1 的方 法是由溶于1，4-二氧六环的L-丙氨酸的N-羧酸酐、L-酪氨酸的N-羧酸酐、Y_谷氨酸苄 酯的N-羧酸酐和三氟乙酰基赖氨酸的N-羧酸酐制备保护的共聚物-1。然后用33%溴化 氢的乙酸溶液除去谷氨酸残基上的Y_苄基保护基，同时部分的切断多肽的肽链，到三氟 乙酰基共聚物-1。然后用哌啶水溶液除去赖氨酸残基上的三氟乙酰基保护基，得到粗共聚 物-1。最后，经过透析，将溶液冻干，既得到共聚物-1原料药。
[0005] 由于共聚物-1是一种聚合混合物，其批与批之间的结构及氨基酸组成不可能完 全一样，所以用普通的UV检测器是不能准备检测其含量的，因为批与批结构上的小差异及 氨基酸组分的微小变化均会导致其响应信号的不同，所以其测定结果也会有较大误差。因 此，为了准确测定其含量，首要问题就是提供一种与结构无关的质量型检测器。
[0006] 此外，在聚合物-1的研发过程中，在起始阶段由于没有合适的对照品，那么就需 要采用TEVA的制剂作（Copaxone)为对照品使用，但其每支制剂里含有40mg的甘露醇，由 于采用了质量型检测器，所以其原料与甘露醇的快速且集中的分离成为又一需要解决的难 题。如果采用凝胶色谱柱或反相C18,由于本品是一种混合物，出峰不集中，就会导致信号重 现性不好，所以就需要一种能将原料集中出峰且又能将甘露醇分离出来的色谱条件。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述在聚合物-1的研发和制备过程中所遇到的问题，发明人经过筛选， 确定了采用ThermoscientificDionex液相色谱仪的CoronaCAD电喷雾检测器，并设计了 专属于该型号检测设备的色谱条件。该检测器检测结果与分析物颗粒有关，信号电流与样 品中分析物的质量成正比，因此无论何种化合物，只要进样质量相同响应都基本一致，所以 CoronaUltra检测器能检测所有非挥发物，包括不含发色团的物质，不论被测物分子结构 如何。
[0008] 本发明首先涉及一种检测含有甘露醇辅料的醋酸格拉替雷样品（市售卡帕松 制剂）的浓度专用色谱检测方法，该方法使用ThermoscientificDionex液相色谱仪的 CoronaCAD电喷雾检测器，色谱柱为：Kromasil6〇-5CN，4.6X250mm，5um;所述的色谱方 法中，流动相的配制方法为，缓冲盐溶液与有机相按照缓冲盐溶液：有机相溶剂=4 :1~ 16 (v/v)混合；所述流动相的pH值为2. 0-5. 0,优选为3. 0 ;所述的有机相溶剂为乙腈或甲 醇，优选为乙腈；所述的缓冲盐成分为甲酸铵、醋酸铵，优选为甲酸铵；所述缓冲盐溶液的 浓度为 〇. 1-0. 5mol/l，优选为 0. 2mol/l。
[0009] 本发明所述的色谱检测方法中，色谱条件为，柱温20-60°C，优选为25°C。
[0010] 本发明所述的色谱检测方法中，样品的进样浓度为0. 0l-o. 5mg/ml，优选为 0?lmg/ml〇
[0011] 本发明所述的色谱检测方法中，所使用的检测器是电喷雾检测器（CAD)或蒸发光 散射检测器（ELSD)。
【附图说明】
[0012] 图1、醋酸格拉替雷浓度的对数与检测器响应值的对数的线性回归曲线。
[0013] 图2、甘露醇浓度的对数与检测器响应值的对数的线性回归曲线。
[0014] 图3、卡帕松（Copaxone)制剂曲型的色谱图，前峰为醋酸格接替雷，后峰为甘露 醇。
[0015] 图4、4a_4c，不同色谱条件下的卡帕松（Copaxone)制剂的色谱图。
【具体实施方式】
[0016]实施例1.色谱条件的筛选及验证
[0017] 色谱柱用Kromasil60-5CN, 4. 6X250mm，5um;流动相A为0?IM的甲酸铵（用甲 酸调pH3. 0)，流动相B为乙腈，A:B= 50:50,进行等度洗脱；采用紫外检测器与电喷雾检测 器串联，其中紫外在前电喷雾检测器在后。紫外检测器的检测波长为275nm，电喷雾检测器 雾化气体采用高纯氮气，雾化温度为25°C;流速I. 0ml/min，柱温：25°C，醋酸格拉替雷的色 谱峰与甘露醇的色谱峰的分离度应大于4 ;醋酸格拉替雷拖尾因子应小于2. 5。
[0018] 为了保证该分析方法的可行性，我们对该分析方法的线性及精密度进行了验证， 结果如下：
[0019] 1.浓度线性关系分析：
[0020] 由于本分析方法所用的检测器为质量型检测器，其浓度与峰响应值之间的关系并 不是直接的线性关系，是两者的对数值呈线性关系。因此，首先检测该色谱条件下，聚合 物-1 (醋酸格拉替雷）样品的浓度线性关系，结果见表1。进一步用上述数据中浓度的对数 与进行线性回归，线性方程为y= 0. 8054X+7. 171，其相关系数的平方为0. 9995,说明该方 法中浓度的对数与检测器响应值的对数呈良好的线性关系。（图1)
[0021] 表1.醋酸格拉替雷线性考察
[0022]
[0023] 接下来，检测该色谱条件下，甘露醇样品的浓度线性关系，结果见表2。进一步用上 述数据中浓度的对数与进行线性回归，线性方程为y= 〇.5649X+7. 4936,其相关系数的平 方为0. 9996,说明该方法中甘露醇浓度的对数与检测器响应值的对数呈良好的线性关系。 (图2)
[0024] 表2.甘露醇线性考察
[0025]
[0026] 2.检测精密度考察：
[0027] 为了确定该质量型检测器对本品响应值的稳定性情况，针对一个特定的含有甘露 醇的醋酸格拉替雷样品，连续进样6针考察本方法的精密度情况，具体的数据如下表3所 示，其中序号3的检测结果如图3所示：
[0028] 表3.醋酸格拉替雷峰面积及甘露醇峰面积的精密度情况
[0029]
[0030] 从上述数据可看出该检测器对醋酸格拉替雷及甘露醇有稳定的响应信号，所以该 方法具有可靠的进样精密度。
[0031] 实施例2.色谱条件的筛选及验证
[0032] 色谱柱用Kromasil60-5CN, 4. 6X250mm，5um;流动相A为0?IM的甲酸铵（用甲 酸调PH5.0)，流动相B为乙腈，A:B= 80:20,进行等度洗脱；采用紫外检测器与电喷雾检测 器串联，其中紫外在前电喷雾检测器在后。紫外检测器的检测波长为275nm，电喷雾检测器 雾化气体采用高纯氮气，雾化温度为25°C;流速I.Oml/min，柱温：25°C，醋酸格拉替雷的色 谱峰与甘露醇的色谱峰的分离度为4. 5 ;醋酸格拉替雷拖尾因子2.1。（图4a)
[0033] 实施例3?色谱条件的筛选及验证
[0034] 色谱柱用Kromasil60-5CN, 4. 6X250mm，5um;流动相A为0? 5M的甲酸铵（用甲 酸调pH3.5)，流动相B为乙腈，A:B=35:65,进行等度洗脱；采用紫外检测器与电喷雾检测 器串联，其中紫外在前电喷雾检测器在后。紫外检测器的检测波长为275nm，电喷雾检测器 雾化气体采用高纯氮气，雾化温度为25°C;流速I.Oml/min，柱温：50°C，醋酸格拉替雷的色 谱峰与甘露醇的色谱峰的分离度为4. 6 ;醋酸格拉替雷拖尾因子1. 9。（图4b)
[0035] 实施例4?色谱条件的筛选及验证
[0036] 色谱柱用Kromasil60-5CN, 4. 6X250mm，5um;流动相A为0?IM的醋酸铵（用甲 酸调pH5. 0)，流动相B为乙腈，A:B= 50:50,进行等度洗脱；采用紫外检测器与电喷雾检测 器串联，其中紫外在前电喷雾检测器在后。紫外检测器的检测波长为275nm，电喷雾检测器 雾化气体采用高纯氮气，雾化温度为25°C;流速I. 5ml/min，柱温：25°C，醋酸格拉替雷的色 谱峰与甘露醇的色谱峰的分离度为4. 6 ;醋酸格拉替雷拖尾因子2. 2。（图4c)
[0037]实施例5.以本发明的色谱方法，测量卡帕松样本中的醋酸格拉替雷
[0038] 采用本发明所述的色谱体系对TEVA公司在不同地区不同时间生产的6个批号的 卡帕松（Copaxone)制剂分析结果如下表4，
[0039] 表4?五批TEVA的卡帕松制剂（Copaxone)检测数据汇总
[0040]
[0041] 从5批发明商制剂的分析精况来看，其醋酸格接替雷的含量还是相当的一致的，6 批的检测器响应值的RSD% = 2. 46 ;其甘露醇的6批RSD% = 0. 42。说明本发明所述的方 法，能够很好的适用于醋酸格拉替雷样品的检测和标定。
[0042] 最后，需要说明的是，上述实施例仅供本领域技术人员理解本发明的技术方案的 具体内容，并不用作对本发明保护范围的限定。
【主权项】
1. 一种检测卡帕松制剂样品中醋酸格拉替雷的浓度专用色谱检测方法，其特征在 于，使用ThermoscientificDionex液相色谱仪的CoronaCAD电喷雾检测器，色谱柱为： KromasiI60-5CN，4. 6X250mm，5um对样品中的醋酸格拉替雷浓度进行检测。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测样品时的流动相的配制方法为，缓冲 盐溶液与有机相按照缓冲盐溶液与有机相溶剂的比例为4 :1~16(v/v)混合；调节流动相 的PH值为2. 0-5.0 ;所述的有机相为乙腈或甲醇；所述的缓冲盐为甲酸铵、醋酸铵；所述缓 冲盐溶液的浓度为〇? 1-0. 5mol/l。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的流动相pH为3. 0 ;有机相为乙腈， 缓冲盐为甲酸铵，缓冲液浓度为〇. 2mol/l。4. 根据权利要求2或3任一所述的方法，其特征在于，色谱检测时的柱温20-60°C，优 选为25°C。5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，检测样品的进样浓度为 0? 01-0. 5mg/ml，优选为 0?lmg/ml。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所使用的检测器是电喷雾检测器 (CAD)或蒸发光散射检测器（ELSD)。
【专利摘要】一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法。本发明涉及一种采用Thermo？scientific？Dionex液相色谱仪的Corona？CAD电喷雾检测器，及专属于该型号检测设备的HPLC色谱条件，用于检测含有甘露醇辅料的醋酸格拉替雷样品(即市售卡帕松制剂)中的醋酸格拉替雷浓度。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/02
【公开号】CN105223281
【申请号】CN201410289379
【发明人】唐洋明, 李国弢, 马亚平, 袁建成
【申请人】深圳翰宇药业股份有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月24日