用于受激拉曼检测的设备和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测样本中的受激拉曼散射(SRS)类型的共振非线性光学信号的设备和方法。本发明尤其适用于显微镜学成像、光谱学、以及散射介质(诸如生物介质)中的高光谱成像。
【背景技术】
[0002]每一个化学键都拥有特定于它的振动频率。旨在使用光和物质之间的相互作用来获得关于这些分子振动的信息的方法被称为振动光学技术。这些技术中最著名的是红外(IR)光谱学，在IR光谱学中，观察存在于样本中的化学键的特定吸收线。在1928年发现，拉曼散射(以发现该效应的物理学家Chandrasekhara Venkata Raman命名)使得可见光可被用于获得与光束相互作用的分子的振动光谱。在拉曼散射过程中，入射在分子上的角频率ωρ的栗波非弹性地散射成为所谓的角频率ω s的斯托克斯波以及所谓的角频率ω As的反斯托克斯波。所产生的波和栗波之间的频率差取决于(角频率0,的)分子拉曼跃迀，以使得ωρ-ω5= ω Α5-ωρ= Ω RO从该过程的光子学观点来讲，斯托克斯波和反斯托克斯波分别对应于来自基本或激发振动能级的吸收。从激发振动能级产生反斯托克斯波的过程的可能性比产生斯托克斯波的过程小得多，斯托克斯波是在自发拉曼光谱学中在实践中观察到的唯一的波。斯托克斯波的光谱分布的严密研究提供关于存在于样本中的化学键的密度的信息。该自发非弹性散射过程与荧光相比是非常无效的(拉曼有效截面约为103°cm2/分子，与荧光团的1-光子有效吸收截面(其达到10 16cm2/分子)相比较)。
[0003]称之为相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)的受激拉曼技术是相对于自发拉曼散射过程而言提供大约107的放大的相干拉曼散射过程。在这些技术(参见图1A)中，角频率ωρ和ω s(或频率vp和v s)的两个激光脉冲(其角频率差被设置为等于期望探测到的振动能级的角频率Ωκ)被注入到将被分析的介质中。分别被表示为栗脉冲和斯托克斯脉冲的这些脉冲创建使角频率Ωκ的振动模式进入共振的频率跳动。在CARS过程中，该共振用栗束探测，栗束诱导角频率coAS的反斯托克斯散射。受激拉曼散射(SRS)是使用由于由栗场和斯托克斯场诱导的非线性场与激发(栗)场的相互作用而导致的非线性响应的过程，因此，与CARS过程相反，它在与栗脉冲和斯托克斯脉冲相同的频率上被观察到。它导致从栗束到斯托克斯束的能量转移。因此，受激拉曼散射涵盖两个过程，SRL (指受激拉曼损耗)过程和SRG (指受激拉曼增益)过程，这两个过程分别在栗束中引起强度损耗ΑΙι以及在斯托克斯束中引起强度增益AISR(；(参见图1Β)。例如在Ν.Bloembergen 的综述文章(“The stimulated Raman effect，，，American Journal ofPhysics，35:989-1023, 1967年)中描述了 SRS过程。已经表明，栗束的强度的降低Δ ISRL和斯托克斯束的强度的增益Δ ISR(；与三阶非线性磁化率的虚部(Im(x R?))成比例。这些量的测量因此使得拉曼光谱的严谨计算变成可能。最近，振动光学技术更多地集中于SRS技术，与CARS技术相反，SRS技术不受总是存在于CARS中的非共振背景制约，并且与化学物种浓度是线性关系。
[0004]SRS显微镜学是利用飞秒SRS光谱学领域中的新进展的新技术。在2007年，Ploetz 等人(“Femtosecond Stimulated Raman Microscopy”，Applied PhysicsB, 87(3):389-393, 2007)开发了第一台基于递送飞秒脉冲和皮秒脉冲的放大激光系统的SRS显微镜。该类型的系统诱发强SRS信号，但是却不适合于生物成像。具体而言，所用的(大约nj的)高峰功率损坏样本，并且低重复率(1kHz)与快速扫描显微镜学不兼容。
[0005]当时提出了基于与生物样本的图像形成兼容的高重复率(80MHz)皮秒激光系统的使用的SRS显微镜(参见例如C.ff.Freudiger等人的文章'Label-freeb1medical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scatteringmicroscopy”，Science, 322 (5909): 1857-1861，2008 年；P.Nandakumar 等人的文章:“Vibrat1nal imaging based on stimulated Raman scattering microscopy，，，NewJournal of Physics, 11 (3):033026 (9pp)，2009 年；Y.0zeki 等人的文章'Analysis andexperimental assessment of the sensitivity of stimulated Raman scatteringmicroscopy”，Optics Express, 17 (5): 3651-3658，2009 年 3 月)。在 CARS 显微镜学中，在与激发束不同的频率产生有用信号，即，反斯托克斯信号。反斯托克斯信号可被极其敏感的检测器(诸如雪崩光电二极管或光电倍增管)检测到。在SRS显微镜学中，检测带来了不同的问题，因为有用信号是在与激发束相同的频率产生的。它因此是检测栗束的能量A 1.损耗或者检测斯托克斯束中的能量A〗.增益的问题。在实践中，栗束的能量损耗大约为A ISRL/IP^ 10 5-10 80在以上引用的文章中，建议以频率圪调制斯托克斯信号并且通过同步检测以频率匕提取栗信号的损耗以便提高检测灵敏度。
[0006]因此，图2示出现有技术的SRG配置(即，适于从斯托克斯束提取增益的配置)的SRS显微镜的示意图。在图2中被引用为102和104的、角频率分别为ωρ和ω 5的栗脉冲序列和斯托克斯脉冲序列被注入到样本S中，样本S被定位在布置在显微镜120的本体中的显微镜物镜122的焦点处。以角频率差等于期望在样本中探测到的振动能级的角频率Ωκ的这样的方式选择角频率ω。和ω s。通过组合器114将栗脉冲序列和斯托克斯脉冲序列在空间上叠加，并且提供可变延迟线(未示出)来确保样本中的脉冲的时间叠加。通过调制设备112以调制频率匕对栗脉冲序列102进行振幅调制，以便形成调制脉冲序列106。为了降低电子噪声和激光器的噪声，调制频率被选为高于1MHz。因此，在图2中，曲线101和103分别示出调制栗脉冲序列106和(未调制)斯托克斯脉冲序列104的光强度IP和Is的时间波形。聚光物镜124使得由样本中的栗脉冲和斯托克斯脉冲的相互作用导致的光学信号可被收集。在所选配置中，滤光器126使得角频率为cos的脉冲序列108可被选择，该序列然后被发送到光学检测器128，例如，光电二极管。作为时间的函数测量的光学强度用曲线107示意性地示出。调制频率匕的同步检测130使得表征角频率Ω R的分子振动的寻求信号ΑΙι可被提取。例如通过包括两个电流计镜的扫描系统116在样本上方扫描激发束104、106然后使得样本的感兴趣区域的图像可被形成。
[0007]然而，SRS显微镜学容易有若干个伪像，因为这些伪像引入可被解释为SRS信号的信号，所以它们限制了化学特异性。具体而言，SRS显微镜学对交叉克尔效应(或用于指“交叉相位调制”的XPM)敏感，交叉克尔效应不是特定于目标化学键的，并且在SRS信号中表现为正或负偏移。SRS显微镜学也对双光子吸收(或用于指“双光子吸收”的TPA)敏感，双光子吸收在SRS信号中表现为正(在SRL配置中)或负(在SRG配置中)偏移。
[0008]双光子吸收是仅当栗束存在时才(在诸如图2中所示的SRG配置中)诱导斯托克斯束耗尽的瞬间非线性过程。在斯托克斯束中诱导的调制因此被检测到并且被解释为SRS信号。在SRG检测模式下，通过TPA耗尽斯托克斯束相对于SRG增益测量而言表现为副偏移。在SRL检测模式下，通过TPA耗尽栗束相对于SRL损耗测量而言表现为正偏移。
[0009]光学克尔效应是非线性(瞬间)过程，该过程诱导折射率变化(该折射率变化与产生它的波的强度成比例)，并且引起导致产生它的束聚焦或散焦的透镜效应。在SRS显微镜学中，当克尔效应仅影响栗光子或者仅影响斯托克斯光子时，克尔效应不是问题。具体而言，例如在SRG配置(诸如图2中所示)中，当只有栗光子受到影响时，克尔效应诱导只有栗束看到的变化；然而，后者未被检测到，因此其聚焦不影响测量。当只有斯托克斯光子受到影响时，克尔效应诱导只有斯托克斯束看到的变化；因为后者未被调制，所以其聚焦和在检测器处诱导的能量变化随着时间保持不变，因此不影响调制频率圪的SRS测量。然而，例如在SRG配置中，在斯托克斯束的角频率ω s处的折射率中观察到变化，该变化是由角频率ωρ的栗束诱导的；这是交叉克尔效应，该交叉克尔效应在这种情况下以与被测SRS信号的调制相同的调制使斯托克斯束聚焦或散焦。导致测量偏移。为了降低交叉克尔效应的影响，重要的是当在测量束与样本相互作用之后收集测量束(在SRL中为栗，在SRG中为斯托克斯)时不引入光阑。由于这个原因，已知使用其数值孔径大于激发物镜的数值孔径的聚光物镜。
[0010]这些伪像因散射介质(尤其是生物组织)而加剧，并且阻碍了 SRS显微镜学对于检查其有效拉曼截面很小的振动键的使用。具体而言，即使当使用其数值孔径大于激发物镜的数值孔径的聚光物镜时，散射也将导致聚光物镜的阻隔(diaphragming)，该阻隔加剧伪像(尤其是交叉克尔效应)的影响。
[0011]因此，图3B至3D例示说明在由人的皮肤形成的组织中在各种光谱区域中通过CARS、SRS和拉曼显微光谱学获得的光谱，该组织的拉曼光谱在图3A中示出。图3A中所示的从Huang等人的文章(Optics Express, 19，23 (2011年))复制的光谱包括用于拉曼成像的三个感兴趣光谱区域。被称为“脂类和蛋白质”区域的区域对应于2750cm1和3050cm 1之间的角频率，并且包含高强度分子振动，被称为“酰胺”区域的区域对应于1350cm 1和1750cm 1之间的角频率，被称为“指纹”区域的区域对应于850cm1和1150cm 1之间的角频率。图3B至3D示出在这些区域中的每个中分别通过CARS、SRS和拉曼显微光谱学执行的光谱测量。在分子振动的强度高的区域(图3B)中，可以看到SRS测量203很好地对应于拉曼光谱201，而CARS测量202表现出与连续的非共振背景相关的偏移。CARS测量中的连续的非共振背景效应在两个其它区域(图3C和3D中的曲线212和222)中也是可见的。而且，在分子振动的强度较低的区域中的SRS测量中也观察到偏移(连续背景)出现。因此，由SRS测量导致的曲线(图3C和3D中的213和223)不再叠加在拉曼光谱(211和221)上。这些实验曲线例示说明分子振动的强度低的区域中的SRS测量伪像的影响。
[0012]本发明提供一种用于检测在样本中诱导的SRS类型的共振非线性光学信号的独创方法，该方法使得寻求的有用的SRS信号可被增大并且伪像(尤其是由交叉克尔效应导致的伪像)可被移除，包括在由散射生物介质形成的样本中。
【发明内容】
[0013]根据第一方面，本发明涉及一种用于检测在样本中诱导的受激拉曼散射(SRS)类型的共振非线性光学信号的设备。该设备包括:
[0014]-电光装置，其用于在样本中使角频率ω#Ρω 2的光脉冲序列以第一调制频率相互作用并且使角频率《2和ω 3的光脉冲序列以第二调制频率相互作用，以使得ω 2-ω1 =ω3-ω2= Ω R，其中，Ωκ是样本的分子振动共振角频率；
[0015]-用于以第一调制频率和第二调制频率对由样本中的光脉冲的相互作用导致的非线性光学信号进行同步检测的装置；以及
[0016]-电子处理装置，其使得可从由同步检测导致的电子信号获得表