SSO模型的调优参数选择的Ten-time交叉验证：垂直实线代表部分似然偏差土SE (标准 误），垂直虚线代表通过最小标准和I-SE标准获得的最佳值。随后发明人得到一个基于6 个基因标签表达水平的公式来计算每一病人的疾病复发风险评分。根据患者各自的6个基 因标签表达水平，发明人应用LASSO Cox回归模型计算每位患者的风险评分：风险评分= (0. 03773100 X CD147 表达状态）+ (0. 05809367 X IL-7 表达状态）+ (0. 24175387 X Ki67 表达 状态）+ (0. 23151294XMIF表达状态）+ (0. 03817919XP97表达状态）+ (0. 25708962Xro-Ll 表达状态）。在这个公式，每个基因标签的高低表达分界值利用X-tiIe软件获得，每个基因 标签的低表达状态等于0,尚表达状态则等于1。
[0027] 3. 4检测及验证基于6基因标签分类器的复发风险模型 综合X-tile软件产生的最佳分界值与LASSO Cox回归分析的结果，发明人进一步评估 风险分数的分布和患者生存状态之间的关系，发明人的结果显示风险分数较低的患者比风 险分数高的患者预后要好（表2. 4和图4A)。发明人用时间依赖的ROC曲线评估了 6基因 标签分类器在不同的随访时间预测小肝癌患者复发的准确度（图4A)。临床病理参数的分 布在高风险和低风险组并没有明显不同（表2. 2)，但是6基因标签分类器定义的高复发风 险人群与低复发风险人群的危险比为2. 721 (95% Cl :1. 633-4. 532 ;P〈0. 0001 ;图4A)。
[0028] 随后，发明人对内部验证组队列（167例）进行同样的分析也得到类似的结果 (图4B)。为了验证6基因标签分类器在不同人群是否有同样的预测效能，发明人该分类 器应用于来自不同中心的包含有347例小肝癌的独立外部验证组队列中。发明人发现：分 类器定义的高复发风险人群与低复发风险人群的危险比为1. 868 (95 % Cl: 1. 334-2. 617 ; Ρ〈0· 0001 ;图 4C)。
[0029] 通过排除临床病理参数的协同作用，多变量生存分析结果显示6基因标签分类器 是一个影响小肝癌复发的强大的独立预后因素，无论是在训练组和内部验证组，还是在外 部验证组都得到类似的结果（表2. 4)。分层生存分析结果显示66基因标签分类器仍然是 小肝癌临床上和统计学上有显著意义的预后模型（图5和图6)。ROC曲线分析显示6基因 标签分类器在预测小肝癌复发方面比临床危险因素具有更好的准确度（图7)。因此，发明 人的结果表明6基因标签分类器能够提高临床病理参数的预后预测价值。
[0030] 就如发明人的研究结果所示，血清AFP水平并不能够很好的预测小肝癌患者的预 后。为了临床医生提供一个定量方法来预测AFP阴性和阳性组小肝癌肿瘤复发的可能性， 发明人构造两个集6基因标签分类器和临床高危因素于一体的列线图：AFP阴性组和AFP 阳性组（图8)。刻度尺图显示列线图与理想模型相比效果很好（图8)。时间依赖的ROC 曲线分析显示列线图在AFP阴性的患者有更高的预测准确度（图8)。 表2. 4基于6基因标签分类器、临床病理参数及单个基因标签的单变量生存分析
*中位年龄。
[0031] 表2. 5基于6基因标签的分类器与小肝癌患者无复发生存的多变量分析
*中位年龄。
[0032] 结论 在本研究中，发明人使用LASSO Cox回归模型分析了 335例小HCC肿瘤组织中的与肝 细胞癌发生发展相关的基因免疫组化表达情况，鉴别出一个基于6基因免疫组化特征的分 类器（包括CD147、IL-7、Ki67、MIF、P97和PD-L1)。335例小HCC病例被随机分入一个训 练组（η = 168)和一个内部验证组（η = 167)。在训练组，发明人使用LASSOCox回归模型 筛选出的6个与小肝癌复发相关的基因标签，随后在内部验证组确定了 6基因标签分类器 的预测效能。另外，发明人还收集了 347名在其他医院接受手术治疗的病人（独立验证组） 对发明人的结果作进一步验证。增加样本量是为了减少筛选过程中的假阳性结果并提高统 计效能。发明人的研究结果显示在小HCC组织中，这一 6基因标签分类器危险积分高意味 着患者更高的复发风险。这一强化的数据集让发明人可以鉴定出一个包含3个临床病理参 数和6基因表达谱，用于准确预测哪些小HCC患者在手术切除后易发生肿瘤复发，尤其是那 些AFP水平不升高的患者。在这项研究中，发明人使用基于生物标记-LASSO的预后分类器 来验证这一仅含6基因表达的特征谱的效能。LASSO Cox回归模型的使用使发明人可以在 一个工具中整合多个基因，这使得预后预测的准确性比单基因标记得到大幅度的提高。因 此，发明人认为，这一 6基因表达特征谱所得到的数据是可靠的，而且是评价小肝癌患者复 发风险强有力的预后模型。
[0033] 发明人鉴定出的这一 6基因标签分类器有着从科学研究到临床应用的潜在可能， 尤其适用于鉴定那些有高复发风险的小HCC病人。虽然早期HCC可以通过切除、移植或局 部消融治疗，但超过60 %的早期HCC在行手术治疗后会发生肿瘤复发。然而，因为HCC发 病机制的复杂性，目前仍很难在切除后预测肿瘤复发的风险。发明人相信，临床上非常有必 要在诊断时将这类小HCC病人分为高复发风险群体和低复发风险群体。使用这一系统作 分类的目的可能在于：对高风险小HCC有针对性的作化学预防或者至少作更充分的跟踪随 访。发明人相信，这一技术可以通过更积极的跟踪随访或早期干预提高小HCC病人的总体 生存率；所以，这一分类方法可能改变小HCC医疗护理的处理方式。据发明人所知，目前只 有少数几个生物标记被报道可用于预测小HCC患者的复发。虽然这些研究都非常有价值， 但到目前为止，还没有一种基于大型多中心研究的多标记预测模型，用于预测HBV相关的 小HCC(尤其是那种血清AFP水平不高的HCC)的复发。在发明人的研究中，这一 6基因标 签分类器对小HCC复发风险的评估有独立的临床意义，尤其是对那些当前临床分组不能准 确评估的小型早期肝细胞癌。
[0034] 总之，发明人的研究结果显示6基因表达特征谱为基础的预后评价系统能够有效 将小肝癌患者分为高低复发风险组，整合这一分类系统到传统的临床病理风险因素里面能 够大大提高小肝癌预后判断的预测价值。据发明人所知，发明人首次研究并验证了一组可 准确判断实体小HCC预后的基因特征谱。发明人找到的这组6基因表达特征谱与小HCC病 人手术后的复发风险紧密相关。这一标记可很好的用于对病人作肿瘤复发风险分级。
【主权项】
1. 用于小肝癌诊断的联合标志，由CD147、IL-7、Ki67、MIF、P97及ro-Ll共6个基因标 签组成。2. 基因标签组作为小肝癌诊断标志的应用，其特征在于：基因标签组由⑶147、IL-7、 Ki67、MIF、P97及PD-L1共6个基因标签组成。3. 检测基因标签组表达量试剂作为小肝癌诊断复发试剂的应用，其特征在于：基因标 签组由CD147、IL-7、Ki67、MIF、P97及PD-L1共6个基因标签组成。4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：风险评分=(0.03773100X CD147 表达状态）+ (0.05809367XIL-7 表达状态）+ (0.24175387XKi67 表达状 态）+ (0· 23151294XMIF表达状态）+ (0· 03817919XP97表达状态）+ (0· 25708962XPD-L1 表达状态），在这个公式，每个基因标签的高低表达分界值利用X-tile软件获得，等于或低 于分界值定为低表达，尚于分界值称为尚表达，低表达状态等于〇,尚表达状态则等于1。5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测基因标签组表达量试剂为抗人 CD147、IL-7、Ki67、MIF、P97 及PD-L1 等六个抗体。
【专利摘要】本发明公开了用于预测小肝癌复发的联合诊断标记，发明人通过对大量病例进行分析，基于LASSO？Cox回归模型确立并构建了基于6基因标签（包括CD147、IL-7、Ki67、MIF、P97及PD-L1）的小肝癌复发预测模型；6基因标签分类器定义的高复发风险人群与低复发风险人群的危险比为2.721（95%？CI:1.633-4.532；<i>P</i>？<？0.0001），内部验证组和独立外部验证组的分析也具有相同的结果。说明6基因标签为基础的分类器能够有效预测小肝癌患者不同的复发风险，提高传统临床病理参数预测小肝癌复发的诊断准确率；很好地判断AFP阴性的小肝癌患者的复发风险；在小肝癌的个体化治疗具有潜在的临床价值。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105319364
【申请号】CN201510744435
【发明人】蔡木炎, 谢丹, 王凤伟, 凌逸虹, 李鹏, 张意军, 陈杰伟
【申请人】中山大学附属肿瘤医院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月3日