一种基于汞单克隆抗体检测纺织品中汞含量的间接竞争elisa试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于重金属检测技术领域，更具体地说，涉及一种基于单克隆抗体技术检 测纺织品中汞含量的间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中，天然水体中含汞量极少，一般不超 过0. lyg/L。但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少 重金属如镉、汞等进入大气、水、土壤环境，引起严重的环境污染。植物具有吸收、积累汞的 能力，尤其是当土壤中含汞量增加时植物会吸收积累更多的汞。纺织品以植物作为原料，并 且在生产工艺过程中，某些环节也会引入重金属汞，汞及汞化合物对人体的损害程度与进 入体内的汞量有关。汞对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸 系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。因此，建立纺织品中汞的准确、快速、便捷、高通量 的检测方法，对纺织品品质控制、减少其质量问题对人们生命安全与健康具有十分重要的 意义。
[0003] 纺织品中汞的含量低，一般需要通过酸性汗液或其他介质进行浸提或消解，由此 带来的问题是纺织品本身存在的大量干扰物质如染料、增塑剂、增白剂以及其他金属离子 将会随着汞一起被提取出来。另外，纺织品的汞筛查往往样品量大，对方法的分析速度和灵 敏度有较高要求。当前，汞的传统检测方法主要为仪器检测，对样品要求高，抗干扰能力差， 包括原子吸收光谱法、原子荧光光谱法和电感耦合等离子体-质谱法等，这些方法普遍需 要依靠大型或专门仪器才能完成，且前处理过程复杂，耗时较多，难以满足高通量快速和在 线检测的需要。基于抗原、抗体特异性结合作用的间接竞争酶联免疫吸附测定方法具有检 测速度快、费用低廉、仪器简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，且能同时分析大量的环 境样本，已广泛应用于临床医学、生命科学以及环境中有机有毒物质的检测。目前，该方法 用于纺织样品中重金属汞的检测报道则没有。
[0004] 文献检索结果表明，国外Willy等采用GSH为双功能螯合剂，首次制备了能特异 性识别重金属萊的单克隆抗体（Wylie, D.E.，et al. Monoclonal-antibodies specific for mercuric ions[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(9) :4104-4108)。国内只有杨凤刚等在《高技术通 讯》（2008.5)上发表了题为"重金属汞单克隆抗体的制备及鉴定"，该文介绍了制备汞单克 隆抗体的方法及抗体鉴定。但制备的腹水效价偏低，不利于建立标准化的免疫检测方法。 中国专利申请号为200910037475. 7,公开日为2009年7月22日的专利申请文件公开了 一种抗汞鳌合物单克隆抗体，所述单克隆抗体对汞鳌合物具有特异性，所述的汞鳌合物为 汞-1- (4-异硫氨酸苄基）-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物和汞-乙二胺四乙酸，该发 明公开了制备抗汞鳌合物单克隆抗体的方法、制备免疫抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基）-乙 二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素和包被抗原汞-1-(4-异硫氨酸苄基）-乙二胺四乙酸-牛血清 白蛋白的方法及检测汞离子浓度的方法。申请号为201010229009. 1，申请公布日为2010 年11月17日的专利申请文件公开了一种重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附 测定方法。通过将双功能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载 体蛋白牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原 MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体用于酶联免疫吸附 测定，该发明制备得到的抗体对汞离子具有很高的特异性，除了与镉的交叉反应率为7. 9% 之外，其他金属的均小于0. 001%，添加回收率在91. 4% -120%之间，可用于水样中的重金 属汞的测定，也可以通过结合一定的前处理技术发展为快速检测农产品等其他样品中重金 属萊的快速免疫检测技术。
【发明内容】
[0005] 1.要解决的问题
[0006] 针对纺织品中汞的生化分析方法的不足、检测灵敏度低、操作繁琐等问题，本发 明提供一种基于汞单克隆抗体检测纺织品中汞含量的间接竞争ELISA试剂盒及其检测方 法，，该测定方法适用于以模拟酸性汗液提取的纺织品中汞的快速、准确、高通量测定，实现 了纺织品中汞的生物测定方法，并构建试剂盒，为儿童轻纺品的安全检测提供技术支持。
[0007] 2.技术方案
[0008] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] -种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒，包括包被了 Hg-ITCBE-BSA且已封闭 的96孔酶标板、汞标准储备液、稀释液、汞单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗、抗体稀释 液、底物缓冲液，双氧水、TMB、终止液和洗涤液。
[0010] 优选地，所述的汞标准储备液的浓度为200mg/L，pH值为7. 4 ;所述的稀释液为含 有2. 5mM EDTA的PBS溶液；所述的汞单克隆抗体为上述方法制备得到；所述的抗体稀释液 为PBS溶液；所述的底物缓冲液为CPBS溶液；所述的双氧水的体积分数为0. 65% ;所述的 终止液为2M浓度的H2S04溶液；所述的洗涤液为PBST溶液。
[0011] 优选地，所述的汞单克隆抗体的制备方法为：以异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸 与钥孔戚血蓝蛋白和汞反应得到的Hg-ITCBE-KLH为免疫抗原，对小鼠进行免疫反应得到， 具体的制备步骤如下：
[0012] (1)制备免疫抗原Hg-ITCBE-KLH和包被抗原Hg-ITCBE-BSA (采用异硫氰酸酯法制 备免疫抗原和包被抗原，采用紫外可见分光光度仪和傅里叶红外分光光度仪鉴定免疫抗原 和包被抗原是否偶联成功）；
[0013] (2)将步骤（1)中制备的免疫抗原免疫小鼠；
[0014] (3)将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养；
[0015] (4)采用有限稀释法，以间接ELISA、间接竞争ELISA和包被抗原筛选阳性克隆的 杂交瘤细胞；
[0016] (5)鉴定步骤（4)得到的杂交瘤细胞所分泌的单克隆杭体。
[0017]优选地，能特异性测定萊，与Pb2+、Cr3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cd2+的 交叉反应率低于0.60%。
[0018] 上述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒检测纺织品中汞的方法，其步 骤为：
[0019] (a)采用上述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒建立间接竞争酶联免 疫吸附测定方法，包括优化汞单克隆抗体和包被抗原的工作浓度及汞单克隆抗体和包被抗 原的反应条件；
[0020] (b)绘制标准竞争抑制曲线，计算标准竞争抑制曲线的线性方程；
[0021] (c)提取纺织品中的汞，采用步骤（a)中建立的方法和步骤（b)中的线性方程测定 纺织品提取液中的汞含量。
[0022] 优选地，所述步骤（b)中的线性方程为Y = 0· 86837+0. 22795X，R2= 0· 994,其中 Y为Logit (B/B。)，B为标准系列汞浓度下的0D45。值，B。为阳性对照的0D 45。值，X为Hg 2+浓 度的负对数值，Hg2+浓度的单位为μ g/L。
[0023] 优选地，所述步骤（c)中采用模拟酸性汗液提取纺织品中的汞，模拟酸性汗液包 括0. 5g/L的L-组氨酸盐酸盐-水合物，5. Og/L的氯化钠，2. 2g/L的磷酸二氢钠二水合物， pH值为5. 5。提取后的溶液调节pH至7. 4。
[0024] 本发明采用以ITCBE作为双功能螯合剂，以钥孔戚血蓝蛋白（KLH)作为耦合蛋白 制备的汞单克隆抗体，在此构建经酸性汗液提取的纺织品中中汞的间接竞争ELISA试剂盒 及其检测方法。
[0025] 3.有益效果
[0026] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0027] (1)本发明中的汞