性研究。计算各反应的抑制中浓度IC5。值，以抗体对汞的 IC 5。与对竞争物的1C 5。的比值作为其交叉反应率（CR% )，如下列公式所示。
[0092]
[0093] 按照
【发明内容】
中间接竞争酶联免疫吸附测定方法的具体实验步骤进行操作。以 浓度为 〇· 1，1，1〇,20,50,100,500,1000 μ g/L Hg2+标准溶液以及浓度为(λ 01，0· 1，1，5,10， 50mg/L 的 Pb2+、Cr3+、Cu2+、Mn2+、Mg 2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cd 2+系列标准溶液作为样品加入 酶标板中，测定板中各孔的〇D45。的值。根据抑制曲线产生50%抑制或结合的各竞争物浓度 IC 5Q(mg/L)，比较它们对抗体的亲和性。
[0094] 交叉反应率的高低决定了它们对Hg2+检测干扰程度的大小，即方法对Hg的特异 性。其他10种金属对抗体的最大抑制率均低于50%，交叉反应率均小于0. 52%。实验结 果表明，本发明构建的试剂盒对汞具有良好的特异性，其对他金属离子的亲合力比较弱。
[0095] 实施例3
[0096] 酸性汗液提取纺织品样品的汞
[0097] 步骤1:酸性汗液的配置
[0098] 按照国家标准GB/T 17593. 2-2007《纺织品重金属的测定第2部分电感耦合等离 子体原子发射光谱法》中4. 1规定配置人工酸性汗液：1000mL水中加入0. 5g L-组氨酸盐 酸盐-水合物（C6H902N3 . HC1 . H20)，5.0g氯化钠，2. 2g磷酸二氢钠二水合物（NaH2P04. 2H20)配成酸性汗液，用4g/L的氢氧化钠溶液调整试液pH值至5. 5。
[0099] 步骤2:酸性汗液提取纺织品
[0100] 按照国家标准GB/T 17593. 2-2007《纺织品重金属的测定第2部分电感耦合等离 子体原子发射光谱法》中6. 1规定，模拟人体穿着条件用人工酸性汗液提取纺织品中的重金 属：从样品上随机剪取试样，剪碎至5mmX5mm以下、混勾。称取4g试样置于具塞三角烧瓶 中，加入80mL酸性汗液，摇振使得织物纤维充分浸湿，放入恒温水浴振荡器中振荡60min后 取出，冷却至室温，用玻璃砂芯漏斗过滤样品溶液后，用于检测酸性汗液萃取的汞含量。
[0101] 步骤3 :样品溶液pH值调节
[0102] 根据条件实验结果，采用1M氢氧化钠溶液对提取后的含汞溶液进行pH调节，至最 佳pH7. 4,不改变溶液的体积。
[0103] 实施例4
[0104] 试剂盒检测方法应用于模拟酸性汗液提取纺织品中汞的测定
[0105] 步骤1:加标样品与实际样品
[0106] 取一定量的三种纺织品，按照实施例3中的方法前处理提取后，在与建立标准检 测曲线时条件一致的情况下，进行加标回收实验，加标溶度分别为〇. 02,0. 2,1，2mg/kg。
[0107] 取20种实际样品采用实施例3中的制备方法进行前处理，待测。
[0108] 步骤2:方法测定
[0109]采用实施例1中的方法对加标样品和实际样品进行测定。加标样品测试结果列于 如表1。
[oho] 表1汞测定试剂盒的准确度与精密度试验结果
[0111]
[0112] 以添加回收率考察试剂盒测定方法的准确度，以批内批间变异系数考察试剂盒测 定方法的精密度。从表出可以看出，四种浓度的回收率在102. 8~111. 8%之间，平均回收 率为109. 0%，这也表明酸性汗液对酶联免疫试剂盒的基质干扰可以忽略。批间变异系数比 批内变异系数稍大，但均小于10%，这可能是不同酶标板所带来的误差，不影响测定结果。 试剂盒对汞的检测具有良好的准确度与精密度，满足检测要求。
[0113] 20个实际样品同时采用仪器方法与本发明的试剂盒方法进行测定。其中仪器方法 的阳性样品检出3个，检出溶度分别为0. 018、0. 016和0. 009mg/kg，试剂盒方法阳性样品检 出4个，对应浓度分别为0. 013、0. 020、0. 013和0. 037。试剂盒与仪器方法测试结果无显著 性差异。
[0114] 根据实验，确定酶联免疫试剂盒对水溶液中Hg的测定低限为0. 1μg/L，对于 纺织品中酸性汗液萃取汞检测，按照4g样品：80mL酸性汗液的比例，测定低限为10μg/ kg(0.01mg/kg)，远低于Oeko-tex standard 100规定的0.02mg/kg。满足纺织品中萊的测 定要求。
【主权项】
1. 一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：包括包被了 Hg-ITCBE-BSA且已封闭的96孔酶标板、汞标准储备液、稀释液、汞单克隆抗体、羊抗鼠 IgG-HRP酶标二抗、抗体稀释液、底物缓冲液，双氧水、TMB、终止液和洗涤液。2. 根据权利要求1所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于： 所述的汞标准储备液的浓度为200mg/L，pH值为7. 4 ;所述的稀释液为含有2. 5mMEDTA的 PBS溶液；所述的抗体稀释液为PBS溶液；所述的底物缓冲液为CPBS溶液；所述的双氧水的 体积分数为〇. 65% ;所述的终止液为2M浓度的H2S04溶液；所述的洗涤液为PBST溶液。3. 根据权利要求1所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于： 所述的汞单克隆抗体的制备方法为：以异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸与钥孔戚血蓝蛋 白和汞反应得到的Hg-ITCBE-KLH为免疫抗原，对小鼠进行免疫反应得到。4. 根据权利要求1所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于： 能特异性测定汞，与Pb2+、Cr3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Cd2+的交叉反应率低于 0· 60%〇5. 权利要求1-4中任意一项所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒检测纺 织品中汞的方法，其步骤为： (a) 采用权利要求1-4中任意一项所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒 建立间接竞争酶联免疫吸附测定方法，包括优化汞单克隆抗体和包被抗原的工作浓度及汞 单克隆抗体和包被抗原的反应条件； (b) 绘制标准竞争抑制曲线，计算标准竞争抑制曲线的线性方程； (c) 提取纺织品中的汞，采用步骤（a)中建立的方法和步骤（b)中的线性方程测定纺织 品提取液中的萊含量。6. 根据权利要求5所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒检测纺织品中汞 的方法，其特征在于：所述步骤（b)中的线性方程为Y= 0. 86837+0. 22795X，R2= 0. 994,其 中Y为Logit(B/B。），B为标准系列汞浓度下的0D45。值，B。为阳性对照的OD45。值，X为Hg2+ 浓度的负对数值，Hg2+浓度的单位为μg/L。7. 根据权利要求5所述的一种汞单克隆抗体的间接竞争ELISA试剂盒检测纺织品中汞 的方法，其特征在于：所述步骤（c)中采用模拟酸性汗液提取纺织品中的汞，模拟酸性汗液 包括0. 5g/L的L-组氨酸盐酸盐-水合物，5.Og/L的氯化钠，2. 2g/L的磷酸二氢钠二水合 物，pH值为5. 5。
【专利摘要】本发明公开了一种基于汞单克隆抗体检测纺织品中汞含量的间接竞争ELISA试剂盒及其检测方法，属于重金属检测技术领域。本发明以Hg-ITCBE(异硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸)-KLH(钥孔戚血蓝蛋白)为免疫抗原对小鼠进行免疫反应得到检测汞的单克隆抗体，基于汞单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附测定方法适用于以模拟酸性汗液提取的纺织品中汞的快速、准确、高通量测定，实现了纺织品中汞的生物测定方法，并构建试剂盒，为儿童轻纺品的安全检测提供技术支持，具有效价高、亲和力强、检测灵敏度高、操作简便等优点。
【IPC分类】G01N33/53
【公开号】CN105388280
【申请号】CN201510772550
【发明人】丁友超, 何欢, 蔡建和, 郑凯, 孙成, 何重辉
【申请人】江苏省检验检疫科学技术研究院, 南京大学, 江苏出入境检验检疫局工业产品检测中心
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月12日