一种粮食真菌污染情况的快速检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用红外光谱检测微生物的方法，一种粮食真菌污染情况的快速检测方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 粮食在适宜条件下极易发霉变质，不仅造成经济损失，且多数产毒霉菌的次级代 谢产物严重威胁人畜健康。目前，粮食中霉菌污染的检测方法主要包括：平板菌落计数法、 高效液相色谱法、气相色谱与质谱联用法、PCR和免疫法等，然而，上述方法存在或操作繁 琐、灵敏性低，或成本高且耗时长等不足，难以实时监测粮食中霉菌的生长状况。因此，急需 发展一种能够快速识别粮食中污染霉菌的检测方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了克服现有检测粮食中霉菌污染方法过程复杂，耗时过长或成 本较高的问题，提供了一种可以迅速对粮食中污染霉菌进行定性和大致定量的方法。
[0004] 本发明采用如下技术方案实现。
[0005] -种粮食中真菌污染情况的快速检测方法，包括如下步骤：
[0006] (1)将污染有对照真菌的粮食分别与无菌粮食混合均匀，得到污染各对照真菌的 粮食样品或污染不同浓度对照真菌的粮食样品；
[0007] (2)采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪，采集污染各对照真菌的粮食样品 或污染不同浓度对照真菌的粮食样品在特征波段的红外光谱图及数据；所述特征波段为 4000 ~800cm1和 / 或 10000 ~4000cm1波段；
[0008] (3)对各样品的红外光谱数据进行主成分分析，提取主成分分值，运用线性判别 分析或偏最小二乘判别分析建立不同类别或不同浓度真菌鉴别模型，验证鉴别模型的可靠 性；
[0009] (4)采集待测粮食样品在所述特征波段的红外光谱图及数据，采用步骤（3)中建 立的模型确定待测粮食样品中污染的真菌种类或浓度。
[0010] 所述特征波段为1800~900cm\ 1800~1485cm1和10000~4000cm1中一个或 两个以上波段。
[0011] 采用留一交互验证法验证鉴别模型的可靠性。
[0012] 步骤（2)中采集红外光谱图过程中，光谱分辨率为4cm\在各波段对每个样品至 少检测3次，取每个样品的平均光谱；样品的每次检测中，至少扫描32次。
[0013] 所述主成分分析是指二维主成分分析。
[0014] 每种粮食样品取5个以上的平行样。
[0015] 所述对照真菌为灰绿曲霉、亮白曲霉、黄灰青霉菌、扩展青霉、尖孢镰刀菌。
[0016] 采用本发明方法可以快速分析粮食中污染的霉菌种类并进行大致定量，操作简 便、耗时短、成本较低。
【附图说明】
[0017] 图1 7种霉菌孢子悬浮液样品的ATR-FTIR光谱图。
[0018] 图2 7种霉菌孢子悬浮液样品的PCA得分图（1800~900cm4。
[0019] 图3 7种霉菌孢子悬浮液样品红外光谱信息的LDA得分图（1800~900cm4。
[0020]图4不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图（1800~900cm^，各图标分 别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量 为0〇
[0021] 图5不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图（1800~900cm^，各图标分 别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量 为0〇
[0022] 图6不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图（1800~1485cm^，各图标分 别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量 为0〇
[0023]图7不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图（1800~1485cm^，各图标分 别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质量 为0〇
[0024]图8不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的PCA得分图（10000~4000cm^，各图标 分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质 量为0。
[0025]图9不同浓度灰绿曲霉污染稻谷样品的LDA得分图（10000~4000cm^，各图标 分别表示无菌稻谷中添加的灰绿曲霉稻谷粉末的质量，纯表示添加的无菌对照稻谷粉末质 量为0。
[0026] 图10三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（1800~900cm4。
[0027] 图11三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（1800~1485cm4。
[0028] 图12三种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（10000~4000cm3。
[0029]图13多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（1800~900cm^，图标表示各无 菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
[0030] 图14多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（1800~1485cm^，图标表不各 无菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
[0031] 图15多种不同霉菌污染稻谷样品的LDA得分图（10000~4000cm^，图标表示各 无菌稻谷中添加灰绿曲霉1污染稻谷粉末的质量。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证 的目的，绝不限制本发明的保护范围。在该部分选取稻谷中常见有害霉菌的一种或多种 进行实验：包括：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的灰绿曲霉CGMCC3. 3975(缩写 为灰绿曲霉1)、灰绿曲霉CGMCC3. 0100(缩写为灰绿曲霉2)和黄灰青霉CGMCC3. 5243， 购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的亮白曲霉CICC40475 (缩写为亮白曲霉）、青 霉CICC41489 (以下简写为青霉1)、扩展青霉CICC41063 (缩写为扩展青霉）、尖孢镰刀 菌CICC2532 (缩写为尖孢镰刀菌1)、尖孢镰刀菌CICC41029 (缩写为尖孢镰刀菌2)，购 自中国农业微生物菌种保藏管理中心的青霉ACCC30106(缩写为青霉2)、尖孢镰刀菌 ACCC31369 (缩写为尖孢镰刀菌3)。
[0033] 实施例1七种真菌孢子悬液的红外光谱检测
[0034] 1.霉菌的培养
[0035] 采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)培养。500mL三角瓶装入400mL马铃薯葡萄 糖琼脂培养基，经121°C灭菌20min后，待培养基冷却到55°C左右时，将培养基倒入到灭菌 过的一次性培养皿中，待培养皿中的培养基凝固后，将灰绿曲霉1、亮白曲霉、黄灰青霉、扩 展青霉、尖孢镰刀菌1、尖孢镰刀菌2、尖孢镰刀菌3分别接种到PDA培养基上，在培养箱中 培养，培养温度为28 °C。
[0036] 2.孢子悬浮液的收获与处理
[0037] 将培养5d后的霉菌取出，取4mL灭菌的甘油水溶液（甘油与水体积比为1:10)于 培养基表面，轻微震荡后，移取培养基表面的孢子悬浮液于EP管中，置于_20°C保藏备用。
[0038] 3.计数
[0039] 将孢子悬浮液置于微型旋涡混合仪上振荡10s，取50uL孢子悬浮液于血 球计数板上，在EX30生物显微镜（舜宇光学科技（集团）有限公司）下观察并计 数，七种霉菌孢子初始悬液的浓度分别为：扩展青霉：（5. 5 ±0. 3)X106cfu/mL，黄灰 青霉：（5. 4±0. 2)X106cfu/mL，尖孢镰刀菌 1 : (1. 9±0. 1)X107cfu/mL，尖孢镰刀 菌 2:(1. 4±0· 1)X107cfu/mL，尖孢镰刀菌 3:(6. 9±0· 2)X106cfu/mL，灰绿曲霉 1: (3. 4±0. 3)X106cfu/mL，亮白曲霉：（1. 1±0. 2)X107cfu/mL，即七种霉菌孢子悬浮液的浓 度相近。为验证ATR-FTIR对霉菌光谱特异性以及不同孢子悬浮液浓度的影响，分别对以上 样品稀释10倍和20倍，每个稀释度取三个平行样，共计得到63份样品，进行检测分析。
[0040] 4.ATR-FTIR光谱采集
[0041] 利用德国布鲁克公司的FTIR仪（傅里叶变换红外光谱仪，型号TENS0R27)，结合红 外ATR(衰减全反射）附件（Pike公司，美国）采集63份样品的红外光谱信息。先扫描背 景（空气），然后移取4uL的样品于红外ATR附件上进行检测，扫描32次，分辨率为4cm\ 光谱范围4000~800cm\每个样品至少检测3次，取平均光谱建模。不同样品间需用无水 乙醇擦拭平台以避免交叉污染。
[0042] 图1是63份样品的ATR-FTIR光谱图。对光谱图分析可知，在3700~2996cm1处 是与〇-H、N-H伸缩振动有关的吸收，1800~1450cm1处是关于蛋白质酰胺I带和酰胺II带 的吸收，1185~900cm1处为C-0-C和C-0-P的伸缩振动带。仔细观察可知，不同霉菌样品 的光谱图在1800~900cm1存在一定差异，表明其内部成分存在细微差异。
[0043] 5.数据分析
[0044] 采用TQAnalystv6、SPSS16. 0软件对所有样品的光谱数据进行分析，包括：运用 TQAnalystv6对原始红外光谱数据进行主成分分析，提取各样品原始红外光谱主成分分 值，然后把主成分分值导入到SPSS16. 0软件中，分别采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA) 和线性判别分析（LDA)建立鉴别模型。最后采用留一交互验证法对各鉴别模型性能进行验 证。主成分分析是指二维主成分分析。
[0045] 图2为63份样品光谱信息的前两个主成分的得分图。结果显示，从菌属来看，尖 孢镰刀菌属、青霉属和曲霉属3种菌属间的差异较为明显，曲霉类样品可完全区分于其他2 类。除了个别来自青霉菌属的样品与其他类别混在一起之外，大部分样品能够被很好的区 分。进一步观察7类霉菌样品的聚类趋势可知，除了 3种尖孢镰刀菌样品及黄灰青霉样品 间存在部分重叠之外，其余3种霉菌可区分良好。结果表明，不同霉菌样品悬浮液的红外光 谱吸收强度存在区别，PCA可以提取不同样品间的差异信息，采用ATR-FTIR法识别稻谷中 的不同霉菌具有可行性。
[0046] 图3为7种霉菌孢子红外光谱信息的LDA函数得分图。结果显示，不同类别霉菌 样品在水平方向的位置相距较远，差异明显，除青霉菌属间和曲霉菌属间出现部分重叠外， 其余样品均能被完全区分，其结果优于PCA。运用线性判别分析建立的鉴别模型，采用留一 交互验证评价该模型的可靠性，结果如表1所示，整体判别正确率为87. 1%，其中仅尖孢镰 刀菌3的判别正确率偏低，3个样误判为尖孢镰刀菌1，其余结果均大于或等于80%。尖孢 镰刀菌1和黄灰青霉的判别正确率最高，均为100%。另外，仔细观察发现，误判均发生在不 同菌属内，3类菌属间的判别正确率同为100%。
[0047] 表1 7种霉菌孢子悬浮液样品的LDA模型留一交互验证结果
[0048]