粒体2mg/ml，分别加入待测样本0.5-lmg、脱氧腺苷 2mg、同位素标记的脱氧腺苷（15N5)0.5mg，还原型辅酶Πlmmol/L，磷酸盐缓冲液补足体积 至0.5ml，体系中有机溶剂含量不超过5 %，37°C孵育3h，加入同体积冰乙腈停止反应，涡旋 振荡，3000r离心lOmin，0.22μπι微孔滤膜过滤，高效液相色谱-三重四级杆质谱采用中性丢 失扫描进行检测。同时设立对照组，对照组中不添加脱氧核苷及同位素标记的脱氧核苷。
[0080] 检测结果如图1所示，结果表明，在60 %、80 %、95 %洗脱液及蛇床子素孵育体系中 均检测到疑似DNA加合物。在花椒毒素、补骨脂素、伞形花内酯、二氢欧山芹素孵育体系中未 检测到DNA加合物。独活60%、80%、95%洗脱液孵育体系中，检测到的疑似DNA加合物[Μ+Η ]+m/z493.9，同位素峰m/z498.0，[M+Na]+m/z515.8，同位素峰m/z520.9，在蛇床子素孵育体 系中也检测到疑似DNA加合物[M+H]+m/z493.9,同位素峰m/z498.0，[M+Na]+m/z515.8,同位 素峰m/z520 · 9〇
[0081]在同时设立的未加脱氧核苷及同位素标记的脱氧核苷对照组中未检测到相应疑 似加合物，在未加同位素标记的脱氧核苷对照组中，未检测到相应同位素峰。
[0082]通过对比保留时间和产物离子信息，发明人发现独活3个洗脱液孵育体系中检测 到的疑似DNA加合物与蛇床子素孵育体系中的疑似DNA加合物的保留时间和产物离子均相 同，因此确定独活提取物孵育体系中检测到的疑似DNA加合物由蛇床子素或其代谢产物形 成。[M+H]+m/z493.9的产物离子m/z377.8，为[M+H]+脱去脱氧核糖的碎片离子;m/z135.9，为 脱氧核苷碱基的碎片离子;m/z242.9,为蛇床子素的片段离子。[M+Na]+m/z515.8的产物离 子m/z400.2,为[M+Na]+m/z515.8脱去脱氧核糖的碎片离子；[M+H]+m/z493.9的产物离子为 m/z377.8 ;m/zl57.9，为脱氧核苷碱基碎片离子的加钠峰，m/z265.1，为蛇床子素碎片离子 的加钠峰。[M+Na] +同位素峰m/z521.5的产物离子m/z405.2，比[M+Na]+m/z515.8脱去脱氧核 糖的碎片离子形成的m/z400.2多5u，为其同位素峰，m/z243.0为为蛇床子素的片段离子，m/ z265.1，为蛇床子素碎片离子的加钠峰，m/z163.0为脱氧核苷碱基m/z157.9碎片离子的同 位素峰。由上可见，该疑似加合物由脱氧核苷和蛇床子素两部分组成。
[0083] 1.2蛇床子素与小牛胸腺DNA的反应
[0084] 孵育体系0.5ml，加入小牛胸腺DNAO. 5mg，还原型辅酶Πlmmol/L，蛇床子素0.5mg， 磷酸盐缓冲液补足体积，体系中有机溶剂含量不超过5 %，37°C孵育3h，按组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司）说明书记载方法提取DNA。取100ygDNA，加 入脱氧核糖核酸酶I(Dnase1)15卩以2〇1^/^1，41，现用现配，生工生物工程(上海)股份有 限公司，600U)，35yL10mMMgC12和10mMTris缓冲液，用10mMTris缓冲液补体积至200yL。 37°C孵育2h后向酶解体系中加入197yL0.2MTris和2yL磷酸二酯酶I(lOOmU/yL，-20°C，生 工）和1.3yL碱性磷酸酶（1.25U/yL，4度冰箱，sigma)。孵育24h后取出，进行固相萃取。 CleanertPEP-2固相萃取柱（1ml)，活化:固相萃取柱加lml甲醇洗脱后，再加lml双蒸水洗 脱，将酶解后的DNA样品上到活化后的固相萃取柱中，lml双蒸水洗脱，洗脱液弃去，再用lml 甲醇洗脱，洗脱液吹干，加1〇〇μ1甲醇定容，过滤，HPLC-MS采用多反应监测(MRM)进行检测。 同时设立对照组，对照组中不添加蛇床子素。
[0085]检测结果如图1所示，在蛇床子素与小牛胸腺DNA的反应体系中，检测到了相应加 合物。表明蛇床子素在孵育体系中与小牛胸腺DNA能形成DNA加合物。
[0086] 1.3Ames试验(细菌回复突变试验)研究蛇床子素的致突变作用
[0087]选取TA98和TA100两个菌株。试验前均经鉴定合格。采用Ames微量波动试验考察蛇 床子素的致突变作用。-S9条件下，TA98和TA100菌株的阳性对照分别2-Nitroflucrene4μ g/mL和Nitrofurantoin0 · 25yg/mL;在+S9条件下，ΤΑ98和ΤΑ100菌株的阳性对照均为2-aminoanthracene，浓度分别为2和5yg/mL。取10yL供试品液、240yL暴露培养基与菌液的混 合液加入24孔板中，每个剂量3复孔，置于37°C恒温摇床150rpm/min，孵育90min。孵育结束 后，每孔加入2.8mL指不培养基，混合均勾，每孔取50yL加到384孔板中，每孔对应加48个孔 (384板孔）。将384孔培养板置于设定在37°C恒温培养箱培养约48-72h。培养到期后，取出培 养板，用肉眼观察菌落进行计数，黄色孔为回复突变的菌落生长孔，紫色孔为无突变菌落的 生长孔。蛇床子素采用1.3、10.30、100、30(^/1111浓度(在1000和500(^/1^剂量下有严重沉 淀，在300yg/mL有少量沉淀。故不设定1000和5000yg/mL剂量），
[0088]有效试验标准:至少应包含4个可用于结果分析的剂量;TA98菌株阴性对照的回复 突变孔数平均值< 10个/48孔，TA100菌株阴性对照的回复突变孔数平均值< 12个/48孔，阳 性对照的回复突变孔数平均值2 25个/48孔。
[0089]评价突变作用标准
[0090] (1)将阴性对照组的回复突变孔数的Mean+SD值设为baseline，所有测试组的回复 突变孔数平均值小于baseline2倍，判为阴性。
[0091 ] (2)测试组的回复突变孔数平均值大于baseline2倍，贝lj进行Student'st-test (1sided，unpaired)检测，仍无显著意义，则可判为阴性。若具有显著性差异(P〈0.05)可参 照剂量关系和生物学意义，供试品所诱发的回复突变孔数出现浓度依赖性的增加或在多个 浓度组上出现可重复性的增加，可判断阳性。
[0092] 结果
[0093] (1)阴性对照组和阳性对照组的回复突变孔数平均值均符合要求。
[0094] (2)在供试品加样处理过程中，蛇床子素在300yg/mL剂量下有少量沉淀产生，在2 1000yg/mL剂量下有较多沉淀产生。
[0095] (3)蛇床子素在各剂量下对TA100菌株均未发生回复突变孔数的增加，未超过 baseline的2倍;在+S9条件下对TA98菌株在100和300yg/mL菌落回变数呈现剂量依赖性增 加，且超过baseline的2倍，分别为baseline的3.7倍和7.6倍。
[0096]结论:在本实验条件下，认为蛇床子素在+S9条件下对鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株具 有诱发突变的作用。
[0097]实施例2丹参中遗传毒性成分筛选
[0098] 丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛 瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不 目民，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。本发明人对丹参提取物进行了研究。
[0099]2.1丹参提取物疑似DNA加合物检测
[0100]丹参药材50g，粉碎，过筛，50 %乙醇提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味， 用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩。将萃取后的水层、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及 丹参素钠、丹参酮ΠΑ、隐丹参酮作为待测样本，分别进行检测：
[0101 ]分析条件色谱条件AgilentProshellC18色谱柱（4.6mm*50mm，2.7ym);流动相 为乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0-15min，10%-90%B;体积流量0.4mL/min;柱温30 °C;进样量2yL。
[0102] 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描;检测